DOT1L，治療骨關(guān)節(jié)炎的新靶點(diǎn)

逯愛(ài)梅，孫水，于辰曦

(1.山東省公共衛(wèi)生臨床中心臨床藥學(xué)部，山東 濟(jì)南 250000；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，山東 濟(jì)南 250021)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)，也稱(chēng)為退行性關(guān)節(jié)疾病，近年來(lái)隨著老年人口的增多以及肥胖的流行其發(fā)病率不斷提高，這給家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。然而，目前的治療措施僅僅是減輕疼痛、緩解關(guān)節(jié)僵硬和維持關(guān)節(jié)功能，尚未有一種有效的對(duì)因治療方法，其中一個(gè)重要原因是OA的確切發(fā)病機(jī)制尚不十分明確[1]。目前普遍認(rèn)為 OA是一種多因素疾病，其中遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)因素發(fā)揮著重要作用，已成為近來(lái)OA發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)[2-4]。

類(lèi)端粒沉默干擾體1(disruptor of telomeric silencing 1-like，DOT1L)是目前唯一的已知組蛋白H3賴(lài)氨酸79(histone H3 lysine 79，H3K79)甲基轉(zhuǎn)移酶，可以S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)為甲基供體特異性地催化H3K79進(jìn)行單甲基化、二甲基化和三甲基化[5]。大量研究顯示DOT1L介導(dǎo)的H3K79甲基化參與了調(diào)節(jié)端粒沉默(telomeric silencing)、胚胎發(fā)育、DNA修復(fù)、細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄等生理生化過(guò)程[5]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)DOT1L在維持關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)(homeostasis)、抑制OA發(fā)生發(fā)展方面發(fā)揮著重要作用[6-14]，并有可能成為OA治療的新靶點(diǎn)。本文將在簡(jiǎn)介DOT1L結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與活性、Wnt信號(hào)通路調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育作用的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)闡述DOT1L在OA發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 DOT1L的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與活性

DOT1L從酵母到人類(lèi)都是高度保守的，是迄今為止唯一一個(gè)被證實(shí)不含SET{Su(var)3-9,Enhancer of Zeste[E(z)],and Trithorax(trx)}催化結(jié)構(gòu)域(domain)的組蛋白賴(lài)氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(histone lysine methyltransferases)。全長(zhǎng)度人DOT1L蛋白由1 537個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子質(zhì)量為165 kDa，但僅N末端～360氨基酸序列與酵母Dot1具有明顯的序列相似性[15]。其中，1～416氨基酸含組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域[15]。該結(jié)構(gòu)域由以下3部分構(gòu)成：①N末端結(jié)構(gòu)域：由5個(gè)α螺旋(αA～αE)和2對(duì)短β發(fā)夾(β1、β2和β3、β4)構(gòu)成；②C末端結(jié)構(gòu)域：由7股β折疊(β5～β11)和5個(gè)α螺旋(αF～αJ)構(gòu)成的開(kāi)放α/β結(jié)構(gòu)，中間為 L-EF環(huán)(loop L-EF)將兩末端連接在一起。αF～αH螺旋位于β折疊前側(cè)，而αI、αJ位于對(duì)側(cè)。β折疊中，β5～β9和β10是同向的，但位于β9和β10之間的β11則呈反方向。緊隨β11的αK螺旋，并遠(yuǎn)離結(jié)構(gòu)中心。N末端與αF～αH螺旋位于β折疊同一側(cè)。C末端(319～416氨基酸殘基)是一個(gè)柔性的正電荷區(qū)域,可通過(guò)靜電相互作用的方式識(shí)別并結(jié)合帶負(fù)電的核小體,以實(shí)現(xiàn)對(duì)H3K79的催化作用；③SAM結(jié)合結(jié)構(gòu)域：SAM分子作為甲基供體，位于由 L-EF環(huán)形成的SAM結(jié)合口袋(binding pocket)內(nèi)。該結(jié)合口袋的入口處較寬，但在靠近蛋白質(zhì)中心處變得較窄，由D1、Ⅰ、Ⅰ′、D2和Ⅱ等5個(gè)區(qū)構(gòu)成，其中D1區(qū)位于L-EF環(huán)內(nèi)的133～139氨基酸殘基，形成結(jié)合口袋的右前部；Ⅰ區(qū)位于β5-環(huán)-αG內(nèi)的161～169氨基酸殘基；Ⅰ′區(qū)位于β6-環(huán)-αH內(nèi)的186～189以及191氨基酸殘基，Ⅰ區(qū)和Ⅰ′區(qū)共同形成結(jié)合口袋的背面；D2區(qū)位于環(huán) L-7I內(nèi)的221～224氨基酸殘基，形成結(jié)合口袋入口的背面；Ⅱ區(qū)位于環(huán) L-18內(nèi)的239～245氨基酸殘基，形成結(jié)合口袋的左側(cè)。Ⅰ、Ⅰ′和Ⅱ區(qū)存在與其他SAM依賴(lài)性甲基轉(zhuǎn)移酶相同的共有序列模序(consensus sequence motifs)[16]，但D1、D2區(qū)是DOT1L所特有的而其他甲基轉(zhuǎn)移酶沒(méi)有的序列。

Lys結(jié)合通道(lysine binding channel)位于D1區(qū)，由其內(nèi)部分子間的相互作用而形成。Glu138可與N末端αD螺旋的Tyr115形成一個(gè)氫鍵，也可與相鄰的Tyr136形成一個(gè)氫鍵，后者又可通過(guò)一個(gè)埋藏的水分子與Gln168發(fā)生相互作用。這些相互作用既可穩(wěn)定L-EF環(huán)，又可形成通向SAM結(jié)合口袋內(nèi)部的通道。該通道最狹窄處約4 ?，可容納1個(gè)單-、雙-或三-甲基化的Lys通過(guò)，其開(kāi)放與關(guān)閉為Phe243-Trp305 相互作用所調(diào)節(jié)。SAM上的甲基排列在通道內(nèi)，H3K79沿此通道到達(dá)其活性部位。

2 Wnt信號(hào)通路對(duì)關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育的精準(zhǔn)調(diào)控作用

Wnt信號(hào)通路是高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，分為Wnt/β-catenin信號(hào)通路、Wnt/Planar Cell Polarity(PCP)和Calcium(Ca2+)信號(hào)通路。其中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路被稱(chēng)之為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，具β-catenin依賴(lài)性；后兩者被稱(chēng)之為非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，具非β-catenin依賴(lài)性。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的啟動(dòng)始于Wnt配體與受體Fz結(jié)合釋放游離β-catenin，進(jìn)入細(xì)胞核與LEF/TCF家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。目前Wnt配體家族共19個(gè)成員，其中Wnt2b、Wnt3、Wnt5a、Wnt5b、Wnt10a和Wnt10b在關(guān)節(jié)軟骨中穩(wěn)定表達(dá)，但只有Wnt16可在受損關(guān)節(jié)軟骨中被快速上調(diào)(upregulation)且與β-catenin的表達(dá)相一致[17]。Chen等[18]在研究顳下頜髁突軟骨發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)Wnt4、Wnt5a和Wnt 9a可在髁突芽基部以及后來(lái)不同的軟骨層高度表達(dá)但在成人下頜髁突軟骨中沒(méi)有表達(dá)，提示生理情況下Wnt信號(hào)通路在軟骨中的表達(dá)時(shí)空上受到精準(zhǔn)調(diào)控。這一精準(zhǔn)調(diào)控模式表現(xiàn)在關(guān)節(jié)軟骨的不同發(fā)育時(shí)期Wnt信號(hào)通路發(fā)揮的作用不同，如在關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育早期決定著間充質(zhì)細(xì)胞(mesenchymal cells,MCs)是分化成成骨細(xì)胞還是軟骨細(xì)胞、在關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育后期促進(jìn)肥大軟骨細(xì)胞分化、在軟骨內(nèi)和膜內(nèi)骨化過(guò)程中促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和成熟等[19-22]；另一方面，Wnt信號(hào)通路的不同信號(hào)分子在關(guān)節(jié)發(fā)育的同一時(shí)期發(fā)揮的作用也不盡相同，如Wn1、Wnt4和Wnt8A抑制軟骨生成(chondrogenesis)和MCs分化成軟骨細(xì)胞，而Wnt5a、Wnt5b和Frzb/Frp3/Sfrp3則呈現(xiàn)促進(jìn)作用[22]。一旦這一精準(zhǔn)調(diào)控模式失調(diào)，關(guān)節(jié)軟骨Wnt信號(hào)通路過(guò)度活化則會(huì)引發(fā)OA的發(fā)生發(fā)展[19-24]，這從另一個(gè)側(cè)面也反映出Wnt信號(hào)通路在調(diào)控關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育與穩(wěn)態(tài)的重要作用。采用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)沉默Wnt5a激活成年小鼠關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的Wnt信號(hào)通路可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性丟失、骨贅形成等OA樣表型的發(fā)生[23]。相反，一些Wnt信號(hào)通路拮抗劑如lorecivivint(SM04690)的體內(nèi)、體外試驗(yàn)均證實(shí)可抑制OA的發(fā)生發(fā)展[24]。

3 DOT1L在OA發(fā)生發(fā)展中的作用

3.1 DOT1L基因單核苷酸多態(tài)性增加髖、膝OA易感性 近來(lái)有多家研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了DOT1L基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)與髖、膝OA易感性(susceptibility)之間相關(guān)性的研究。Castano-Betancourt 等[9]針對(duì)6 523名鹿特丹人進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies，GWAS)，以關(guān)節(jié)間隙寬度(joint space width,JSW)為參數(shù)，發(fā)現(xiàn)染色體19p13.3 rs12982744位點(diǎn)G等位基因與JSW增寬5%有關(guān)，并在4 442名英國(guó)人中也得到驗(yàn)證，研究還顯示該SNP位于DOT1L基因的第一個(gè)內(nèi)含子，提示DOT1L基因SNP與髖關(guān)節(jié)OA有關(guān)[9]。Evangelou等[10]針對(duì)9 789例髖OA患者(男4 155例，女5 634例)、31 873例正常健康人(男15 213例，女16 660例)進(jìn)行meta分析，發(fā)現(xiàn)男性患者DOT1L基因 rs12982744 C等位基因與髖OA風(fēng)險(xiǎn)增加17%有關(guān)，并具有全基因組學(xué)意義。Castano-Betancourt等[13]在2016年的研究發(fā)現(xiàn)位于DOT1L基因內(nèi)含子區(qū)rs1180992位點(diǎn)與rs12982744位點(diǎn)非常接近并處于連鎖不平衡狀態(tài)，與髖OA的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。García-Alvarado 等[11]針對(duì)墨西哥東北部麥?zhǔn)康偎?Mestizo)人的研究發(fā)現(xiàn)DOT1L rs12982744位點(diǎn)與膝OA之間無(wú)顯著相關(guān)性。Zhou等[12]針對(duì)605例中國(guó)漢族膝OA患者、615例年齡性別相匹配的正常健康人進(jìn)行的研究，發(fā)現(xiàn)DOT1L基因rs12982744 GC、CC基因型和變異體C可增加中國(guó)漢族人患膝OA的風(fēng)險(xiǎn)，并且老年人(>65歲)和女性患者GC雜合子比GG純合子患膝OA風(fēng)險(xiǎn)更大；而rs12459350 GA、AA基因型與膝OA的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)顯著相關(guān)性，且進(jìn)一步按年齡或性別進(jìn)行分層分析也未顯示出顯著相關(guān)性。盡管Castano-Betancourt 等[13]發(fā)現(xiàn)DOT1L基因在系統(tǒng)優(yōu)先順序研究(systematic prioritization study)中沒(méi)有獲得高分，上述DOT1L基因SNPs與髖、膝OA易感性之間相關(guān)性研究結(jié)果提示DOT1L基因SNP與髖、膝OA易感性有關(guān)，并且體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果[6-8]進(jìn)一步證實(shí)DOT1L基因是OA的致病基因(causal gene)。

3.2 DOT1L參與維持關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài) DOT1L分布于生長(zhǎng)板(growth plate)和關(guān)節(jié)軟骨，尤其是富集于肥大前軟骨細(xì)胞(prehypertrophic chondrocytes)和肥大軟骨細(xì)胞(hypertrophic chondrocytes)[9,14]；也分布于正常關(guān)節(jié)軟骨及OA樣組織中[8]。Castano-Betancourt等[9]以可模擬軟骨細(xì)胞分化過(guò)程的ATDC5細(xì)胞為研究對(duì)象，敲低(knock down)DOT1L基因后采用阿爾新蘭染色和蕃紅O染色法顯示細(xì)胞合成的硫酸蛋白聚糖(proteoglycan)較對(duì)照組細(xì)胞分別減少1.35倍和2.5倍，茜素紅染色法顯示礦化作用減少1.4倍，天狼星紅染色法顯示膠原含量減少1.8倍，提示敲除DOT1L基因(DOT1L-)可明顯干擾關(guān)節(jié)軟骨形成。Monteagudo 等[8]采用免疫組化法發(fā)現(xiàn)甲基化H3K79的信號(hào)強(qiáng)度在OA患者關(guān)節(jié)軟骨損傷區(qū)相比非損傷區(qū)以及非OA患者的關(guān)節(jié)軟骨降低，而DOT1L基因在OA患者關(guān)節(jié)軟骨損傷區(qū)和非損傷區(qū)的表達(dá)卻沒(méi)有明顯差異。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予DOT1L抑制劑EPZ-5676不僅可抑制體外原代培養(yǎng)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞H3K79甲基化，而且可誘導(dǎo)Ⅱ型糖原(COL2A1)分泌減少、Ⅰ型糖原分泌增加等OA樣分子譜的發(fā)生[8]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射EPZ-5676可有效抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞H3K79甲基化，并增加軟骨損傷[8]。條件敲除DOT1L基因小鼠(DOT1L-cKOPrrx1)表型特征顯示肢體縮短、骨形態(tài)異常和前肢脫位[6]。也有研究發(fā)現(xiàn)小鼠軟骨細(xì)胞中DOT1L產(chǎn)前缺失可導(dǎo)致圍產(chǎn)期死亡、骨化加速和Col10a1表達(dá)失調(diào)，出生后小鼠軟骨細(xì)胞DOT1L缺失導(dǎo)致小梁骨丟失、細(xì)胞外基質(zhì)生成減少并且生長(zhǎng)板破裂[25]。采用內(nèi)測(cè)半月板失穩(wěn)誘發(fā)OA小鼠及軟骨特異性DOT1L敲除(knock out)鼠(DOT1LCART-KO)為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)DOT1L失活可導(dǎo)致OA的發(fā)生發(fā)展[7]。此外，DOT1L基因還可抑制破骨細(xì)胞生成[26]，可能也與其抑制OA發(fā)生發(fā)展有關(guān)。基于上述研究，可以得出結(jié)論DOT1L在維持關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。

3.3 DOT1L維持關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)的機(jī)制 人們?cè)谘芯緿OT1L與白血病的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)DOT1L可調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路活性[27]，由此推測(cè)DOT1L維持關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)的作用也可能與Wnt信號(hào)通路有關(guān)。Castano-Betancourt等[9]以DOT1L-ATDC5細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路正向調(diào)節(jié)靶基因如Tcf1、Axin2和c-Myc表達(dá)無(wú)變化，但負(fù)向調(diào)節(jié)靶基因如骨鈣蛋白(osteocalcin)表達(dá)則上調(diào)(upregulation)，這為DOT1L可調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞Wnt信號(hào)通路提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示，采用特異性DOT1L小分子抑制劑EPZ-5676后人或小鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)的活性β-catenin濃度沒(méi)有發(fā)生變化，表明DOT1L調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路的靶點(diǎn)在通路下游[8]。抑制DOT1L或用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)可上調(diào)LiCl處理軟骨細(xì)胞內(nèi)Wnt靶基因(LEF1、TCF1和c-MYC)RNA水平，而Wnt抑制劑XAV-939可拮抗小鼠關(guān)節(jié)注射EPZ-5676所誘發(fā)的OA[8]。由此可以的結(jié)論，DOT1L維持關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)是通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)Wnt 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

在研究DOT1L是如何抑制Wnt信號(hào)通路時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)采用沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1(Sirtuin1，Sirt1)特異性抑制劑EX527可拮抗DOT1L抑制劑所誘導(dǎo)的LiCl處理細(xì)胞LEF1、TCF1上調(diào)，而Sirt1特異性激動(dòng)劑SRT1720呈現(xiàn)相反的作用，表明Sirt1介導(dǎo)了DOT1L對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制作用[8]。抑制或者敲除DOT1L可上調(diào)軟骨細(xì)胞內(nèi)Sirt1活性，而當(dāng)給C57/B16野生型小鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)同時(shí)注射EX527與EPE-5676時(shí)發(fā)現(xiàn)EX527可有效降低EPZ-5676誘導(dǎo)OA的嚴(yán)重程度并可逆轉(zhuǎn)Wntt信號(hào)通路的過(guò)度活化，表明DOT1L可抑制軟骨細(xì)胞內(nèi)Sirt1活性[8]。染色質(zhì)免疫共沉淀定量PCR(chromatin immunoprecipitation-quantitative PCR，ChIp-qPCR)顯示細(xì)胞經(jīng)EPZ-5676處理后，轉(zhuǎn)錄激活因子過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1-α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator 1-alpha，PPARGC1A)和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶KAT2A富集在LEF1和TCF1啟動(dòng)子上，而SIRT1抑制劑EX527可對(duì)抗EPE-5676對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路靶點(diǎn)的抑制作用并可降低PPARGC1A和KAT2A對(duì)LEF1和TCF1啟動(dòng)子的占據(jù)[8]。由此可以得出結(jié)論，DOT1L抑制Sirt1作用可能是其控制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)Wnt信號(hào)通路活性以維持關(guān)節(jié)軟骨健康、抑制OA發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制。

4 展望

目前研究顯示出DOT1L是通過(guò)調(diào)控Sirt1-Wnt信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，且突變與表型相關(guān)性分析結(jié)果在歐洲人和中國(guó)漢族人中均得到證實(shí)，顯示出DOT1L作為OA治療的靶點(diǎn)具有較好前景。實(shí)事求是地講，目前研究仍在初期階段，以下問(wèn)題還要進(jìn)一步明確：①OA是多因素疾病，現(xiàn)已開(kāi)展的研究?jī)H限于DOT1L突變對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的影響，今后還應(yīng)擴(kuò)大研究范圍以明確突變對(duì)炎癥、自噬、凋亡、老化等因素的影響；②DOT1L基因在人類(lèi)是高度保守且分布廣泛，Sutter等[6]發(fā)現(xiàn)條件敲除DOT1L基因可導(dǎo)致小鼠(DOT1L-cKOPrrx1)出現(xiàn)復(fù)雜的表型改變，提示仍需要大量的研究來(lái)驗(yàn)證其作為OA治療靶點(diǎn)的特異性；③Wnt信號(hào)通路對(duì)關(guān)節(jié)軟骨功能的調(diào)控非常精細(xì)，過(guò)度活化或降低均可導(dǎo)致OA的發(fā)生[19-22]。DOT1L維持關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)是通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路活性實(shí)現(xiàn)的，作為靶點(diǎn)如何實(shí)現(xiàn)對(duì)Wnt信號(hào)通路的精準(zhǔn)調(diào)控是未來(lái)要重點(diǎn)研究的內(nèi)容之一。只有這樣才能防止DOT1L作為靶點(diǎn)時(shí)Wnt信號(hào)通路被過(guò)度抑制誘發(fā)OA再發(fā)生或惡化，又保留DOT1L對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的有益作用。