氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定沙坦類制劑中N-亞硝基二甲胺和N-亞硝基二乙胺含量

馬斐，田海燕，劉向凌，肖宗陽(yáng)

(德州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 德州 253000)

世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)致癌物清單顯示，N-亞硝基二甲胺(NDMA)和N-亞硝基二乙胺(NDEA)均屬于2A類致癌物質(zhì)。ICH M7指南中也明確指出該類化合物具有較高致癌性[1]。近年來(lái)，隨著藥品監(jiān)管的不斷深入，在沙坦類原料藥中發(fā)現(xiàn)含有上述兩種雜質(zhì)，而且部分原料藥中NDMA含量超出歐盟標(biāo)準(zhǔn)200余倍，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。因此，各原料藥公司已經(jīng)將NDMA和NDEA列入內(nèi)部質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中。截至目前，國(guó)內(nèi)外已建立多種原料藥和制劑的NDMA和NDEA含量檢測(cè)方法[2-11]，包括利用氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行纈沙坦及厄貝沙坦原料藥內(nèi)NDMA和NDEA含量檢測(cè)，利用超高效液相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測(cè)方法進(jìn)行法莫替丁原料藥及制劑中NDMA含量檢測(cè)[11]等。成品藥物中NDMA及NDEA的檢驗(yàn)與原料藥質(zhì)量控制相互補(bǔ)充，不可或缺，但仍未見(jiàn)沙坦類藥物制劑中NDMA及NDEA檢測(cè)方法的報(bào)道。

本研究利用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)對(duì)纈沙坦、厄貝沙坦、替米沙坦、坎地沙坦4種藥物的不同劑型(片劑、膠囊、分散片)進(jìn)行檢測(cè)，建立了沙坦類成藥制劑中NDMA及NDEA的GC-MS/MS檢測(cè)方法；對(duì)30批次沙坦類制劑進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)1批陽(yáng)性樣品，NDMA含量低于限量值，NDEA未檢出。本方法對(duì)于服務(wù)藥品監(jiān)管，構(gòu)筑藥品安全最后一道防線具有積極的促進(jìn)作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀7890B+7010B(美國(guó)Agilent公司)；精密電子天平XSE105(瑞士Mettler-Toledo公司)；試管渦旋振蕩器[德國(guó)海道爾夫(Heidolph)公司]；H1850R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司)； 13 mm×0.22 μm PTFE濾膜(上海安譜實(shí)驗(yàn)室科技股份有限公司)。

NDMA對(duì)照品(2 000 μg·mL-1，純度100%，BW901305-2000-A,批號(hào)：A1909201，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)；NDEA對(duì)照品(100 μg·mL-1，純度100%，BW902298-100-A,批號(hào)：A1911043，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)；二氯甲烷(色譜純，科密歐公司)。

1.2 對(duì)照品及供試品溶液制備

1.2.1 對(duì)照品溶液 精密量取NDMA標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL至100 mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，制備濃度為10 μg·mL-1的NDMA對(duì)照品溶液。分別精密量取NDMA對(duì)照品溶液(10 μg·mL-1)5 mL、NDEA對(duì)照品溶液(100 μg·mL-1)0.5 mL至同一200 mL量瓶中，加二氯甲烷溶解并稀釋至刻度，制成含NDMA、NDEA均為250 ng·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取上述儲(chǔ)備液適量，用二氯甲烷稀釋，制備成質(zhì)量濃度為0、2.5、5、10、30、60、125、250 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品處理 精密稱取各品種細(xì)粉適量(約相當(dāng)于主成分100 mg)，置于15 mL離心管中，加入二氯甲烷5 mL，2 000 r·min-1渦旋混勻3 min，4 ℃條件下10 000 r·min-1離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm PTFE濾膜濾過(guò)，待進(jìn)樣分析。

1.3 色譜條件 毛細(xì)管柱(型號(hào)Agilent VF-WAX ms，30 m×0.25 mm，0.25 μm)，升溫程序：初始柱溫40 ℃，保持0.5 min，20 ℃·min-1的速率升至200 ℃，保持8 min。進(jìn)樣口溫度：250 ℃，載氣為氦氣，流速1 mL·min-1，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL。

1.4 質(zhì)譜條件 采用EI源，電壓為70 eV，接口溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，增益因子10，溶劑延遲3.5 min，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)檢測(cè)模式見(jiàn)表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)檢測(cè)模式參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)條件的考察

2.1.1 儀器選擇及質(zhì)譜條件優(yōu)化 根據(jù)Carcinogenicity Potency Database(CPDB)數(shù)據(jù)庫(kù)中致癌物質(zhì)的TD50值來(lái)計(jì)算每日可接受的攝入量(ADI)，NDMA、NDEA TD50值分別為0.095 9和0.026 5 mg·(kg·d)-1[12-13]，按照人體重50 kg來(lái)計(jì)算NDMA的每天可接受攝入量為：0.095 9 mg·(kg·d)-1×50 kg/50 000 =96 ng·d-1，此時(shí)對(duì)應(yīng)腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)為十萬(wàn)分之一。結(jié)合藥品說(shuō)明書及FDA公告中查閱到纈沙坦、厄貝沙坦、替米沙坦、坎地沙坦的每日最大用藥量分別為320、300、80、32 mg[13]。限度=ADI/每日最大用藥量(以纈沙坦為例，NDMA 0.3 ppm，NDEA 0.08 ppm)。根據(jù)供試品溶液中沙坦類的質(zhì)量濃度為0.02 g·mL-1，可見(jiàn)NDMA及NDEA的定量下限須低于3 ng·mL-1、0.8 ng·mL-1(即限度濃度的50%)。國(guó)內(nèi)外的檢測(cè)方法現(xiàn)有HPLC-UV、GC-MS[1-3]、GC-MS/MS[4-7]、LC-MS/MS、LC-HRMS等，有數(shù)據(jù)表明串聯(lián)質(zhì)譜靈敏度比單四級(jí)桿質(zhì)譜要高10倍，直接進(jìn)樣法比頂空靈敏度更高近1倍，為排除假陽(yáng)性，滿足靈敏度要求，也鑒于目前串聯(lián)質(zhì)譜儀的普及情況，選擇GC-MS/MS直接進(jìn)樣法和UPLC-MS/MS兩種方法進(jìn)行測(cè)試。分別對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)于目標(biāo)物給予不同碰撞能量，找出信噪比高的離子對(duì)，GC-MS/MS質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

2.1.2 色譜條件優(yōu)化 分別考察UPLC-MS/MS和GC-MS/MS分析檢測(cè)NDMA的靈敏度，發(fā)現(xiàn)GC-MS/MS的檢出限更低，因此選用GC-MS/MS進(jìn)行檢測(cè)。有文獻(xiàn)報(bào)道[14]，使用非極性色譜柱會(huì)造成亞硝胺色譜峰拖尾，使用中等、強(qiáng)極性色譜柱亞硝胺色譜峰尖銳對(duì)稱，因此選用專為極性化合物設(shè)計(jì)的Agilent VF-WAX ms柱進(jìn)行分析，能實(shí)現(xiàn)更高的靈敏度。

2.1.3 樣品前處理 對(duì)比取樣量相當(dāng)于主成分500 mg和100 mg，分別進(jìn)行加標(biāo)回收，陽(yáng)性樣品測(cè)定，陽(yáng)性結(jié)果均一致，加標(biāo)回收率、靈敏度均滿足要求，取樣量較大導(dǎo)致輔料太多，提取液比較黏稠，雜質(zhì)較多，對(duì)色譜柱及質(zhì)譜污染較大，所以選擇約相當(dāng)于主成分100 mg的取樣量進(jìn)行測(cè)定。

NDMA和NDEA在甲醇和二氯甲烷中均有較好的溶解性，因此分別采用甲醇和二氯甲烷對(duì)制劑進(jìn)行提取，加標(biāo)量0.005 μg·kg-1，提取溶劑體積均為5 mL，比較回收率，結(jié)果表明二氯甲烷的回收率及精密度較甲醇更好，因此采用二氯甲烷作為提取溶劑。

提取時(shí)間不足也是影響目標(biāo)物回收率的重要因素，超聲效果較好，但是容易產(chǎn)熱，可能造成NDMA的產(chǎn)生[15]，且二氯甲烷易揮發(fā)，因此選擇渦旋提取，并要合理控制提取時(shí)間。設(shè)置1、3、10 min 3個(gè)提取時(shí)間，對(duì)比膠囊、分散片2種不同劑型5 ng·mL-1加標(biāo)濃度下的平均回收率為78%、95%、93%，結(jié)果表明，提取時(shí)間為3 min時(shí)，可滿足檢驗(yàn)要求。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 專屬性 將溶劑(二氯甲烷)、對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液、陰性樣品加標(biāo)分別進(jìn)樣測(cè)定，相同保留時(shí)間處，溶劑及陰性樣品均無(wú)干擾(見(jiàn)圖1～3)。

圖1 溶劑(二氯甲烷)提取離子色譜圖

圖2 NDMA、NDEA標(biāo)準(zhǔn)溶液提取離子色譜圖

圖3 加標(biāo)樣品提取離子色譜圖

2.2.2 基質(zhì)效應(yīng) 選取纈沙坦分散片、厄貝沙坦分散片、替米沙坦膠囊的空白樣品，分別配制低(5 ng·mL-1)、中(10 ng·mL-1)、高(30 ng·mL-1)3個(gè)水平的空白基質(zhì)加標(biāo)溶液和二氯甲烷溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算兩種溶液中NDMA、NDEA響應(yīng)值的百分比。結(jié)果表明，NDMA、NDEA在3種不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)分別為90.1%～108.7%、92.6%～103.5%、95.1%～101.3%，表明基質(zhì)效應(yīng)不影響檢測(cè)。

2.2.3 線性范圍 將“1.2.1”項(xiàng)下配制的系列濃度對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定。以所得峰面積為縱坐標(biāo)Y，標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X，ng·mL-1)，建立線性回歸方程，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)(r)。結(jié)果表明，NDMA在0～250 ng·mL-1范圍內(nèi)，線性良好，回歸方程為：Y=7 733.9X+1 443.1，r=0.999 7。NDEA在0～250 ng·mL-1范圍內(nèi)，線性良好，回歸方程為：Y=4 024.1X-1 292.5，r=0.999 7。

2.2.4 檢出限和定量限 將1 ng·mL-1的NDMA和NDEA標(biāo)準(zhǔn)溶液用二氯甲烷定量逐級(jí)稀釋后進(jìn)行測(cè)定，以信噪比S/N≥3作為檢出限，以信噪比S/N≥10作為定量限。結(jié)果表明方法的檢出限NDMA為0.1 ng·mL-1，NDEA為0.08 ng·mL-1，定量限NDMA為0.3 ng·mL-1，NDEA為0.2 ng·mL-1。

2.2.5 回收率與精密度 按照“1.2.2”項(xiàng)下精密稱取纈沙坦分散片、替米沙坦膠囊、厄貝沙坦分散片適量，至15 mL離心管中，各精密加入250 ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，制備成低中高3個(gè)濃度的加標(biāo)回收樣品各6份，依照本方法處理，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。NDMA平均回收率為86.9%～113.2%，RSD為2.7%～7.4%；NDEA平均回收率為91.1%～105.3%，RSD為2.8%～8.4%，表明回收率及重復(fù)性均良好。

表2 加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.2.5 穩(wěn)定性與耐用性 將5 ng·mL-1的NDMA和NDEA空白樣品加標(biāo)溶液，按照試驗(yàn)條件放置0、1、2、4、8、12 h后進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖和峰面積。結(jié)果顯示NDMA和NDEA的峰面積的RSD為7.5%和8.9%，說(shuō)明該條件下進(jìn)行樣品測(cè)定12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

改用相似固定相的柱子Agilent DB-WAX(0.25 mm×30 m，0.25 μm)進(jìn)行分析，NDMA和NDEA的檢出限、分離度均能符合要求，表明方法耐用性良好。

2.3 樣品測(cè)定 應(yīng)用所建立的方法對(duì)30批沙坦類制劑樣品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)《國(guó)家藥典委關(guān)于纈沙坦國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)修訂稿》[15]中規(guī)定NDMA不得過(guò)0.3 ppm、NDEA不得過(guò)0.08 ppm。測(cè)得陽(yáng)性樣品1批，其計(jì)算公式為：

[式中m0為規(guī)格80 mg，ω為平均片重或裝量0.160 2 g，m為取樣量0.367 3 g，V為定容體積5 mL，ω為含量(ppm)]，結(jié)果如表3所示。

表3 陽(yáng)性樣品測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了沙坦類制劑中NDMA、NDEA的GC-MS/MS檢測(cè)方法，其中，NDMA、NDEA的線性范圍為0～250 ng·mL-1，方法的檢出限NDMA為0.1 ng·mL-1、NDEA為0.08 ng·mL-1，定量限NDMA為0.3 ng·mL-1、 NDEA為0.2 ng·mL-1。NDMA平均回收率為86.9%～113.2%，RSD為2.7%～7.4%；NDEA平均回收率為91.1%～105.3%。RSD為2.8%～8.4%。應(yīng)用該法對(duì)30批樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢出陽(yáng)性樣品1批，NDMA含量低于限量，NDEA未檢出。本方法靈敏度高、專屬性好、回收率高、線性范圍寬，操作簡(jiǎn)便、快速，已用于沙坦類制劑的檢驗(yàn)，填補(bǔ)了該檢驗(yàn)技術(shù)空白。