HPLC法測(cè)定消栓通絡(luò)片中3種三七成分的含量

張桂英,許崇德,劉建芳，牛家豐

(1.日照市人民醫(yī)院，山東 日照 276800；2.棗莊市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 棗莊 277299)

消栓通絡(luò)片是一個(gè)純中藥制劑，為現(xiàn)行藥典收載藥品，由川芎、丹參、黃芪、澤瀉、三七等11味中草藥組成，具有活血化瘀、溫經(jīng)通絡(luò)的作用，用于瘀血阻絡(luò)所致的中風(fēng)，癥見神情呆滯、言語(yǔ)謇澀、手足發(fā)涼、肢體疼痛、缺血性中風(fēng)及高脂血癥見上述證候者?，F(xiàn)行藥典對(duì)該藥的質(zhì)量控制以薄層層析鑒別為主，主要鑒別了復(fù)方中的三七(3種皂苷)、黃芪(黃芪甲苷)、槐花(蘆丁)的成分，僅利用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)三七中含量最高的人參皂苷Rg1一種成分進(jìn)行了定量檢測(cè)[1-3]。三七(Panaxnotoginseng)為五加科人參屬植物，具有散瘀止血，消腫止痛的功效，常用于抗炎、抗心律失常與抗血栓，活性成分為三七皂苷類化合物[1,4-5]。由于三七為消栓通絡(luò)片中一味用量比較大的中草藥，且為貴細(xì)藥材，應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行比較全面的質(zhì)量控制。我們利用HPLC建立了對(duì)消栓通絡(luò)片中三七的3種主要成分(人參皂苷Rb1、Rg1與三七皂苷R1)進(jìn)行含量檢測(cè)的方法，并對(duì)不同生產(chǎn)廠家的藥品進(jìn)行了質(zhì)量檢測(cè)，比較它們之間的含量差別，同時(shí)檢測(cè)了藥品中是否非法添加三七莖葉提取物的情況。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 藥品與試劑 消栓通絡(luò)片為從藥店自購(gòu)藥品；人參皂苷Rb1(批號(hào)：20170601)、人參皂苷Rg1(批號(hào)：20170214)、三七皂苷R1(批號(hào)：20161121)為壇墨質(zhì)檢-國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心生產(chǎn)；三七莖葉提取物(西安沃森生物科技有限公司，總皂苷含量80%，批號(hào)：20170218)；正丁醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20181118)、甲醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20190130)為分析純；乙腈為色譜純(TEDIA,批號(hào):20015013)；娃哈哈純凈水(批號(hào)：20190216)。

1.2 主要儀器設(shè)備 KQ5200B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);安捷倫1200液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)。色譜柱:InertSustain C18色譜柱(日本GL Sciences Lnc.)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 柱溫25 ℃；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm；流動(dòng)相以乙腈為流動(dòng)相A，以水溶液為流動(dòng)相B，按照表1的比例變化進(jìn)行梯度洗脫。

表1 流動(dòng)相的梯度變化

2.2 樣品溶液的制備 消栓通絡(luò)片樣品溶液的制備：消栓通絡(luò)片去除外層包衣或薄膜衣，干燥，研磨成粉末，過(guò)60目篩，取粉末2.0 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入25 mL乙醚，超聲處理20 min，經(jīng)濾紙過(guò)濾，棄去濾液，殘?jiān)龘]去乙醚干燥后再以水飽和的正丁醇25 mL浸泡6 h，然后超聲處理20 min，過(guò)濾，殘?jiān)僖?0 mL水飽和的正丁醇洗滌，過(guò)濾，兩次濾液合并，再以氨試液進(jìn)行萃取兩次，每次30 mL，正丁醇萃取液合并，水浴蒸干，殘?jiān)约状既芙猓D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，甲醇定容，溶液再以0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

藥材對(duì)照品溶液的制備：稱取經(jīng)過(guò)60目篩的三七藥材對(duì)照品與三七莖葉提取物粉末0.5 g，按照消栓通絡(luò)片樣品溶液的制備方法進(jìn)行處理，即得。

消栓通絡(luò)片三七陰性對(duì)照溶液的制備：按照藥材組方的比例，取缺少三七的另外10種藥材，按照消栓通絡(luò)片的制備方法進(jìn)行制備，稱取2.0 g，按照消栓通絡(luò)片樣品溶液的制備方法進(jìn)行處理，即得。

3種對(duì)照品溶液的制備：分別稱取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷R1對(duì)照品5 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入適量甲醇，超聲溶解，再以甲醇溶液定容，搖勻，備用。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品(樣品4，批號(hào)：170302)、三七陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取含有三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb13種對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，以甲醇稀釋至10 mL，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.5 精密度試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取濃度為0.102 mg·mL-1的三七皂苷R1、0.104 mg·mL-1的人參皂苷Rg1、0.102 mg·mL-1的人參皂苷Rb1對(duì)照品溶液各10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5 次，記錄3個(gè)對(duì)照品的峰面積。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取消栓通絡(luò)片粉末(樣品4，批號(hào)：170302)約2 g，精密稱重，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按色譜條件檢測(cè)，精密吸取供試品溶液10 μL，注入色譜儀，共進(jìn)樣5次，記錄3個(gè)對(duì)照品的峰面積。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取消栓通絡(luò)片粉末(樣品4，批號(hào)：170302)約2 g，精密稱重，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按色譜條件，精密吸取供試品溶液 10 μL，分別在0、4、8、12、16、24 h 進(jìn)樣，記錄3個(gè)對(duì)照品的峰面積。

2.8 回收率試驗(yàn) 取6份已知含量的消栓通絡(luò)片粉末(樣品4，批號(hào)：170302)約2 g，精密稱重，分別加入編號(hào)1～6 的25 mL容量瓶中，精密吸取三七皂苷R10.101 mg、人參皂苷Rg10.102 mg、人參皂苷Rb1對(duì)照品0.101 mg，按供試樣品溶液制備方法，依色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積，計(jì)算回收率。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，典型的色譜圖見圖1～4。

1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Rb1圖1 3種三七皂苷對(duì)照品的色譜圖

圖2 消栓通絡(luò)片樣品的色譜圖

圖3 三七莖葉提取物的色譜圖

圖4 消栓通絡(luò)片三七陰性對(duì)照溶液的色譜圖

3.2 線性關(guān)系考察 根據(jù)試驗(yàn)色譜圖(見圖1)，以峰面積值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。三七皂苷R1Y=6 000.68X+210.61，r=0.999 6；人參皂苷Rg1Y=7 818.54X+ 191.23，r=0.999 7；人參皂苷Rb1Y= 5 348.27X+207.05，r=0.999 7。結(jié)果表明，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1分別在0.025～0.51、0.026～0.52、0.025～0.51 mg·mL-1的范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

3.3 精密度試驗(yàn) 根據(jù)試驗(yàn)色譜圖，記錄3個(gè)對(duì)照品的峰面積，RSD分別為2.28%、1.39%、1.83%(n=5)，說(shuō)明儀器的精密度良好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 根據(jù)試驗(yàn)色譜圖，記錄3個(gè)對(duì)照品的峰面積，RSD分別為1.84%、2.03%、1.91%(n=5)。結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 根據(jù)試驗(yàn)色譜圖，記錄3個(gè)對(duì)照品的峰面積，RSD分別為1.73%、2.15%、1.83%(n=6)。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.6 回收率試驗(yàn) 依色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率分別為100.51%、99.68%、98.12%，RSD分別為2.16%、2.01%、2.87%(n=6)。

3.7 樣品含量測(cè)定結(jié)果 按照前文建立的測(cè)定方法，對(duì)本次自購(gòu)的6個(gè)生產(chǎn)廠家共計(jì)12個(gè)生產(chǎn)批次的消栓通絡(luò)片中三七皂苷的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 消栓通絡(luò)片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量

4 討論

在進(jìn)行HPLC分離時(shí)，本論文參閱了藥典對(duì)三七藥材和含有三七的中成藥對(duì)三七皂苷的HPLC檢測(cè)條件[1,6-8]，發(fā)現(xiàn)它們的出峰時(shí)間比較長(zhǎng)，我們對(duì)色譜條件進(jìn)行了改變，縮短了出峰時(shí)間，指標(biāo)成分的色譜峰之間無(wú)干擾、專屬性、分離度及穩(wěn)定性也比較好，符合質(zhì)量檢測(cè)的要求。

對(duì)6個(gè)生產(chǎn)廠家共計(jì)12個(gè)生產(chǎn)批次的消栓通絡(luò)片中三七皂苷的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)被檢測(cè)的消栓通絡(luò)片中3種三七皂苷類成分都有明顯的HPLC色譜峰出現(xiàn)，且沒(méi)有明顯的三七莖葉提取物的HPLC色譜峰，說(shuō)明被抽檢的藥品沒(méi)有以三七莖葉提取物代替三七根入藥的非法添加情況(三七莖葉提取物在25 min后出現(xiàn)比較明顯的色譜峰，但消栓通絡(luò)片樣品中這些色譜峰不明顯，見圖2～3)[9-10]。對(duì)不同企業(yè)、不同生產(chǎn)批次產(chǎn)品的結(jié)果進(jìn)行比較，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量大都穩(wěn)定在1.11～1.54 mg·g-1(平均值為1.35 mg·g-1)、5.85～8.31 mg·g-1(平均值為7.08 mg·g-1)、2.92～4.41 mg·g-1(平均值為3.46 mg·g-1)，不同企業(yè)藥品之間三七總皂苷的含量整體比較穩(wěn)定，含量差別不是非常明顯。