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    米諾環(huán)素對(duì)白念珠菌的抑制作用分析*

    2021-10-19 00:28:34莉,梅昭,關(guān)濤,鄧群Δ
    關(guān)鍵詞:酵母菌

    鄒 莉,梅 昭,關(guān) 濤,鄧 群Δ

    三峽大學(xué)人民醫(yī)院/宜昌市第一人民醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科;2藥學(xué)部,湖北宜昌 443300

    白念珠菌廣泛分布于環(huán)境中,被認(rèn)為是人類(lèi)最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性真菌病原體。它容易引起黏膜表面的侵襲性感染,尤其在免疫缺陷和菌群失調(diào)患者中可危及其生命。隨著廣泛長(zhǎng)期使用抗真菌藥物,白念珠菌耐藥性迅速增加,增加了現(xiàn)有抗真菌藥物對(duì)于臨床藥理治療的難度[1]。近年來(lái),科學(xué)研究對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗菌藥物如米諾環(huán)素、四環(huán)素、多西環(huán)素等進(jìn)行了重新評(píng)價(jià),認(rèn)為它們具有潛在的抗真菌活性[2-3]。本研究通過(guò)評(píng)估米諾環(huán)素對(duì)白念珠菌的體外抗真菌活性,為進(jìn)一步研究米諾環(huán)素治療白念珠菌感染的機(jī)制提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1菌株來(lái)源 收集2020年1-12月分離自本院的酵母菌臨床標(biāo)本46株,其中白念珠菌17株、熱帶念珠菌7株、葡萄牙假絲酵母菌4株、近平滑念珠菌4株、光滑念珠菌10株、擬平滑假絲酵母菌4株。所有菌株均經(jīng)全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)儀鑒定到種,質(zhì)控菌株白念珠菌(ATCC 90028)購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。

    1.2儀器與試劑 VITEK MS全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)儀(法國(guó)生物梅里埃公司),米諾環(huán)素敏感性測(cè)試紙(美國(guó)Merck公司),米諾環(huán)素(美國(guó)Sigma公司),葡萄糖美藍(lán)M-H藥敏試驗(yàn)瓊脂平板(美國(guó)Thermo公司),沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(上海博賽生物技術(shù)有限公司),磷酸鹽緩沖鹽溶液(pH 7.0±2.0,實(shí)驗(yàn)室配制),96孔板(美國(guó)康寧公司),超微量分光光度計(jì)、微孔板酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司),XTT試劑盒(上海生工公司),YPD液體培養(yǎng)基、YPD固體培養(yǎng)基、RPMI 1640液體培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司),半胱氨酸蛋白酶(Caspase)3活性測(cè)定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

    1.3菌株的活化及菌液配制 從4 ℃保存的SDA培養(yǎng)基上挑取白念珠菌質(zhì)控菌株ATCC 90028及酵母菌臨床菌株單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中,37 ℃搖床振蕩(200 r/min)過(guò)夜培養(yǎng),使菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,12 000 r/min離心后收集菌體,磷酸鹽緩沖鹽溶液洗滌菌體2~3次,用RPMI 1640稀釋至1×106CFU/mL保存?zhèn)溆肹4]。

    1.4抑菌圈測(cè)定 使用紙片擴(kuò)散法對(duì)臨床菌株進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)將菌株調(diào)整為0.5麥?zhǔn)宵c(diǎn)的菌懸液,均勻擴(kuò)散到葡萄糖美藍(lán)M-H藥敏平板,待平板表面干燥后貼上含米諾環(huán)素抗菌藥物的藥敏試紙,于28 ℃孵育24 h,測(cè)量抑菌環(huán)的直徑。目前,細(xì)菌藥敏紙片對(duì)酵母菌的藥敏試驗(yàn)方法尚無(wú)參考標(biāo)準(zhǔn),但根據(jù)本小組的前期數(shù)據(jù)及研究[5],筆者大致判斷14 mm是其敏感的抑菌圈折點(diǎn),抑菌圈直徑≥14 mm判定為陽(yáng)性。

    1.5培養(yǎng)基形態(tài)學(xué)觀察 配制含不同濃度米諾環(huán)素的YPD固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基中包含米諾環(huán)素的濃度分別為0、256、512和1 024 μg/mL,按1×105CFU/mL制備白念珠菌ATCC 90028,均勻涂布到Y(jié)PD平板上,28 ℃孵育48 h,觀察菌落形態(tài)。將未加入米諾環(huán)素的培養(yǎng)基作為對(duì)照組,加入米諾環(huán)素的培養(yǎng)基作為米諾環(huán)素干預(yù)組,米諾環(huán)素干預(yù)組進(jìn)一步分為256 μg/mL組、512 μg/mL組、1 024 μg/mL組。

    1.6菌絲的形成評(píng)估 將對(duì)數(shù)期白念珠菌細(xì)胞(1×106CFU/mL)在多種營(yíng)養(yǎng)菌絲轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(RPMI 1640培養(yǎng)基中添加20%胎牛血清)中培養(yǎng),在含不同濃度米諾環(huán)素的24孔組織培養(yǎng)板中,37 ℃搖床孵育,分別在不同時(shí)間點(diǎn)(0、6、12 h)采集真菌細(xì)胞,采用Image View Systems數(shù)字細(xì)胞成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。并計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中菌絲所占的比例。

    1.7浮游細(xì)胞和白念珠菌生物膜的代謝活性 添加100 μL細(xì)菌(1×106CFU/mL)液體到96孔培養(yǎng)板,于37 ℃黏附90 min后,吸樣槍輕輕移除未黏附的浮游細(xì)胞,再添加100 μL新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液,37 ℃培養(yǎng)24 h,直到成熟的生物膜成立。抽吸生物膜上清液,加入含不同濃度米諾環(huán)素的RPMI 1640培養(yǎng)液孵育24 h,顯微鏡下觀察生物膜的生長(zhǎng)情況,使用XTT試劑盒測(cè)量成熟生物膜細(xì)胞的代謝活性,用酶標(biāo)儀于570 nm處以空白孔調(diào)零測(cè)各孔吸光度(A)值。同樣,為了檢測(cè)米諾環(huán)素對(duì)浮游細(xì)胞的影響,在100 μL細(xì)菌液體中加入米諾環(huán)素,37 ℃搖床培養(yǎng)24 h,在570 nm處測(cè)量A值,觀察米諾環(huán)素對(duì)浮游細(xì)胞的作用。

    1.8米諾環(huán)素對(duì)白念珠菌生物膜細(xì)胞Caspase 3活性的影響 指數(shù)生長(zhǎng)期的白念珠菌懸液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106CFU/mL,用不同劑量的米諾環(huán)素處理,37 ℃孵育24 h,離心收集白念珠菌細(xì)胞,使用Caspase 3活性測(cè)試盒測(cè)定生物膜細(xì)胞Caspase 3活性。磷酸緩沖鹽溶液輕柔洗滌3次,棄上清液,加裂解液冰浴裂解;4 ℃離心10~15 min,加入反應(yīng)液、裂解液及AcDEVD-PNA,振蕩重懸沉淀,37 ℃孵育4 h,發(fā)現(xiàn)顏色有明顯變化時(shí),離心取上清液,用酶標(biāo)儀在405 nm測(cè)定其A值,計(jì)算米諾環(huán)素干預(yù)組白念珠菌細(xì)胞內(nèi)Caspase 3活性程度的相對(duì)值(即A米諾環(huán)素干預(yù)組/A對(duì)照組)。

    2 結(jié) 果

    2.1米諾環(huán)素對(duì)6種酵母菌作用的比較 米諾環(huán)素對(duì)酵母菌作用后產(chǎn)生抑菌圈直徑≥14 mm的菌種有3種,抑菌圈最大的是白念珠菌,且抑菌圈陽(yáng)性率最高,其次為葡萄牙假絲酵母菌和部分熱帶念珠菌;抑菌圈直徑<14 mm的菌種為部分熱帶念珠菌、擬平滑假絲酵母菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌;其中光滑念珠菌的抑菌圈直徑均<6 mm,表明米諾環(huán)素對(duì)光滑念珠菌沒(méi)有抑制作用。各酵母菌的抑菌圈直徑與14 mm比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

    表1 米諾環(huán)素對(duì)酵母菌作用后產(chǎn)生抑菌圈情況的比較

    2.2米諾環(huán)素對(duì)白念珠菌菌落形態(tài)的影響 在YPD固體培養(yǎng)基,對(duì)照組白念珠菌菌落表面出現(xiàn)寬型褶皺及白斑,顯示出明顯的絲狀結(jié)構(gòu);米諾環(huán)素干預(yù)組白念珠菌菌落表面相對(duì)光滑,褶皺及白斑明顯減少,絲狀結(jié)構(gòu)和菌落大小隨米諾環(huán)素濃度增加而減少,見(jiàn)圖1。

    注:白念珠菌ATCC 90028在不同濃度米諾環(huán)素的YPD固體培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)48 h。

    2.3米諾環(huán)素對(duì)白念珠菌菌絲生長(zhǎng)的影響 顯微鏡觀察結(jié)果表明,米諾環(huán)素抑制了白念珠菌由酵母形式向菌絲形式的轉(zhuǎn)化。6 h后,對(duì)照組有大量菌絲生長(zhǎng),而米諾環(huán)素干預(yù)組菌絲生長(zhǎng)均受到明顯抑制,256 μg/mL組此時(shí)菌絲所占比例最小,為13.33%±2.05%;在12 h后,對(duì)照組菌絲大量萌芽,菌絲數(shù)量及長(zhǎng)度明顯增加,米諾環(huán)素干預(yù)組菌絲增長(zhǎng)緩慢,其生長(zhǎng)明顯受抑制,256 μg/mL組此時(shí)菌絲所占比例最小,為15.00%±2.94%,米諾環(huán)素在256 μg/mL組展示出最佳抑制效果。見(jiàn)圖2。

    注:與同時(shí)期對(duì)照組比較,aP<0.05。

    2.4米諾環(huán)素對(duì)白念珠菌生物膜和浮游細(xì)胞代謝活性的影響 XTT還原試驗(yàn)結(jié)果顯示,加入米諾環(huán)素后,白念珠菌生物膜代謝活性明顯下降。256 μg/mL組中,白念珠菌生物膜代謝活性為33%,隨著米諾環(huán)素濃度的增加,白念珠菌生物膜代謝活性下降趨于穩(wěn)定,米諾環(huán)素干預(yù)組各組與對(duì)照組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但米諾環(huán)素對(duì)白念珠菌浮游細(xì)胞代謝活性沒(méi)有明顯抑制作用,在不同米諾環(huán)素干預(yù)組中,其代謝活性?xún)H略有降低,米諾環(huán)素干預(yù)組各組與對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖3。

    2.5米諾環(huán)素對(duì)白念珠菌生物膜細(xì)胞Caspase 3活性的影響 與對(duì)照組比較,256 μg/mL組、512 μg/mL組、1 024 μg/mL組Caspase 3活性程度均升高(P<0.05),但米諾環(huán)素干預(yù)組各組間的Caspase 3活性程度比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表2。

    注:與同對(duì)照組比較,aP<0.05。

    表2 4組白念珠菌生物膜細(xì)胞Caspase 3活性比較

    3 討 論

    近年來(lái),由于環(huán)境和機(jī)體的不斷刺激導(dǎo)致真菌變化和突變,以及廣泛和長(zhǎng)期使用有限的抗真菌藥物,使白念珠菌耐藥性迅速增加,給白念珠菌感染患者的治療帶來(lái)了很大的困難。為了解決現(xiàn)有抗真菌藥物對(duì)于患者的臨床藥理治療的缺陷,研究者正在不斷尋找新的抗真菌藥物或現(xiàn)有抗真菌藥物的增敏劑,有研究者發(fā)現(xiàn),米諾環(huán)素聯(lián)合其他抗菌藥物對(duì)金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和白念珠菌均有加強(qiáng)抑制作用[2,7]。

    米諾環(huán)素為一種傳統(tǒng)的抗細(xì)菌藥物,本研究發(fā)現(xiàn),米諾環(huán)素對(duì)酵母菌顯示出不同的抑菌效果,但是目前米諾環(huán)素對(duì)假絲酵母菌屬的藥敏試驗(yàn)方法尚無(wú)操作標(biāo)準(zhǔn)及規(guī)范化,筆者通過(guò)紙片擴(kuò)散法結(jié)果發(fā)現(xiàn),米諾環(huán)素對(duì)白念珠菌、葡萄牙假絲酵母菌和部分熱帶念珠菌抑菌圈直徑均≥14 mm,表明米諾環(huán)素具有較強(qiáng)的抗酵母菌活性,其中對(duì)白念珠菌具有明顯的抑制作用。米諾環(huán)素對(duì)部分熱帶念珠菌、擬平滑假絲酵母菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌作用后產(chǎn)生抑菌圈直徑均<14 mm,說(shuō)明其對(duì)這幾種酵母菌無(wú)抑制作用,這可能與酵母菌的種類(lèi)、形態(tài)轉(zhuǎn)化和毒力有關(guān)[8],需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

    形態(tài)轉(zhuǎn)變?cè)谡婢锬さ纳飳W(xué)及其與宿主的相互作用中起著重要作用。ZHONG等[9]研究證實(shí),絲狀真菌在生長(zhǎng)形成生物膜過(guò)程中,其長(zhǎng)度和厚度直接影響菌絲的致病性,且二者呈正相關(guān)。白念珠菌的菌絲由于形態(tài)豐富多樣,其菌絲形式比酵母形式更難被宿主的防御系統(tǒng)所消除,故菌絲形式下致病性比酵母形式強(qiáng)[10]。本研究結(jié)果顯示,在YPD固體培養(yǎng)基,對(duì)照組白念珠菌菌落表面出現(xiàn)寬型褶皺,顯示出明顯的絲狀結(jié)構(gòu);加入米諾環(huán)素后白念珠菌菌落表面褶皺減少,相對(duì)光滑,且絲狀結(jié)構(gòu)隨米諾環(huán)素濃度增加而減少或是消失。本研究選取了3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行研究,分別為0、6、12 h。在不同時(shí)間點(diǎn),白念珠菌的菌絲形式和酵母形式所占比例不同。一般情況下,隨著白念珠菌生長(zhǎng),菌絲會(huì)隨之生長(zhǎng),菌絲所占比例增大。本研究結(jié)果顯示,在6 h后,對(duì)照組有大量菌絲生長(zhǎng),而在米諾環(huán)素干預(yù)組中,菌絲生長(zhǎng)均受到明顯抑制,12 h后對(duì)照組菌絲大量萌芽,菌絲數(shù)量及長(zhǎng)度明顯增加,而米諾環(huán)素干預(yù)組中,白念珠菌菌絲生長(zhǎng)仍明顯受到抑制,在米諾環(huán)素干預(yù)組各組之間,256 μg/mL組菌絲所占比例最小。提示米諾環(huán)素對(duì)白念珠菌菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用,明顯抑制了白念珠菌從酵母形式向菌絲形式的轉(zhuǎn)化,且256 μg/mL濃度的米諾環(huán)素對(duì)白念珠菌具有最佳抑制作用。SANAE[11]認(rèn)為這可能與芽孢相關(guān)基因HWP1、ECE1及ALS3下調(diào)密切相關(guān),米諾環(huán)素作用于白念珠菌菌絲生長(zhǎng)這一過(guò)程,與傳統(tǒng)的抗真菌藥物氟康唑、兩性霉素B作用于白念珠菌的過(guò)程大致相同[12-13]。

    白念珠菌生物膜是一個(gè)復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu),可以增強(qiáng)其對(duì)常見(jiàn)的抗真菌藥物的耐藥性,也給白念珠菌感染的臨床治療增加了難度[14]。本研究XTT還原試驗(yàn)結(jié)果表明,米諾環(huán)素能明顯抑制白念珠菌生物膜代謝活性,256 μg/mL組生物膜代謝活性下降最明顯,此濃度下代謝活性?xún)H為33%,隨著米諾環(huán)素濃度的增加,其對(duì)生物膜代謝活性的抑制作用趨于穩(wěn)定。說(shuō)明米諾環(huán)素濃度為256 μg/mL時(shí)對(duì)生物膜代謝活性的抑制作用已達(dá)到或接近最佳效果,這可能與生物膜代謝及此濃度下菌絲所占比例最小有關(guān)。值得注意的是,對(duì)照組和米諾環(huán)素干預(yù)組浮游細(xì)胞的代謝活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),即米諾環(huán)素對(duì)白念珠菌浮游細(xì)胞的代謝活性無(wú)明顯抑制作用。

    Caspase家族可以改變自身分子構(gòu)象而自我激活,激發(fā)Caspase 3發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng),選擇性地切割多種細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核蛋白質(zhì),促進(jìn)廣泛的蛋白質(zhì)分解改變,最終啟初受損組織的細(xì)胞凋亡[15]。Caspase 3是Caspase一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵酶,是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、死亡的最終執(zhí)行者[16-19]。本研究結(jié)果顯示,加入米諾環(huán)素可明顯提高生物膜細(xì)胞內(nèi)Caspase 3活性,推測(cè)米諾環(huán)素對(duì)白念珠菌的凋亡作用是通過(guò)Caspase 3的作用導(dǎo)致其生物膜的凋亡。

    近年來(lái),有研究者發(fā)現(xiàn),米諾環(huán)素在與抗真菌藥物如氟康唑合用時(shí),可增強(qiáng)氟康唑穿透生物膜的能力,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放,可在減小氟康唑使用劑量的同時(shí)達(dá)到相同的抑菌效果,二者對(duì)白念珠菌的體外生長(zhǎng)產(chǎn)生協(xié)同抑制作用,其作用機(jī)制可能與環(huán)磷酸腺苷的水平及相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)[2]。此外,米諾環(huán)素與氟康唑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)新型隱球菌同樣表現(xiàn)出持續(xù)抑制細(xì)胞膜和抗真菌活性的作用[20],且在動(dòng)物模型中也發(fā)現(xiàn),米諾環(huán)素與氟康唑聯(lián)用能保護(hù)幼蟲(chóng)免受耐藥性新型隱球菌的感染[3]。本研究發(fā)現(xiàn),米諾環(huán)素對(duì)白念珠菌體外活性的抑制作用主要表現(xiàn)在抑制其菌絲生長(zhǎng)、激活Caspase 3活性,從而導(dǎo)致生物膜代謝活性下降和細(xì)胞凋亡,目前國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此,筆者推測(cè)米諾環(huán)素作用于真菌生物膜發(fā)揮其抗真菌活性的過(guò)程可能涉及多個(gè)通路及轉(zhuǎn)錄因子,其相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

    綜上所述,本研究證實(shí)了米諾環(huán)素對(duì)白念珠菌具有較強(qiáng)的抗生物膜活性及凋亡作用,提示米諾環(huán)素可能是一種有效的抗白念珠菌感染的藥物。這為米諾環(huán)素臨床治療白念珠菌感染提供了重要的試驗(yàn)依據(jù),具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。但需要更多的敏感株、耐藥株及動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)一步深入驗(yàn)證米諾環(huán)素的臨床適用性,對(duì)其深入研究對(duì)進(jìn)一步闡明白念珠菌耐藥的發(fā)生機(jī)制及尋找新型抗真菌藥物均有重要意義。

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