加熱滅活對(duì)下呼吸道病毒抗原檢測(cè)結(jié)果影響的初步研究*

馮星星，陳俊伶，王艷春，賀曉麗

昆明市兒童醫(yī)院/云南省兒童重大疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室：1.檢驗(yàn)科； 2.感染二科；3.云南省兒科研究所，云南昆明 650028

兒童呼吸道感染是臨床上常見(jiàn)的兒科疾病，其中病毒是引起嬰幼兒發(fā)生急性下呼吸道感染的最主要病原體[1]，基層醫(yī)院常用的檢測(cè)方法為直接免疫熒光法(DFA)，該方法操作簡(jiǎn)單，在基層醫(yī)院廣泛開(kāi)展[2]；但該方法在處理標(biāo)本時(shí)可能具有潛在的病毒生物安全危害[3]。同時(shí)，自新型冠狀病毒肺炎疫情暴發(fā)以后，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)要求，感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后再進(jìn)行抗原檢測(cè)[4]。因此找到一種簡(jiǎn)單、有效滅活病毒的標(biāo)本前處理方法，降低檢驗(yàn)人員感染風(fēng)險(xiǎn)很重要。參考有關(guān)嚴(yán)重急性呼吸綜合征滅活效果的文章[5-7]，加熱是滅活病毒簡(jiǎn)單有效的方法。因此，本研究通過(guò)對(duì)下呼吸道痰液標(biāo)本分別通過(guò)未滅活和加熱滅活后行DFA檢測(cè)，比較滅活前后呼吸道病毒抗原檢測(cè)結(jié)果，探索標(biāo)本加熱滅活前處理，以期尋找提高實(shí)驗(yàn)室生物安全保障的方法，現(xiàn)初步研究報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2020年1月5日至4月29日昆明市兒童醫(yī)院住院部經(jīng)臨床確診為急性呼吸道感染、急性喘息性支氣管炎、急性扁桃體炎、急性支氣管炎、急性肺炎和急性重癥肺炎的64例患兒，其中男41例，女23例；年齡為11 d至10歲。

1.2儀器與試劑 7項(xiàng)呼吸道病毒檢測(cè)試劑盒(免疫熒光法)為上海貝西生物科技有限公司的產(chǎn)品。檢測(cè)項(xiàng)目有甲型流感病毒(IFA)、乙型流感病毒(IFB)、副流感病毒1型(PIV1)、副流感病毒2型(PIV2)、副流感病毒3型(PIV3)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)，包括熒光素標(biāo)記的單克隆抗體7種(RSV、ADV、IFA、IFB、PIV1、PIV2、PIV3)，濃縮洗滌磷酸鹽緩沖液(40×),封閉液，抗原對(duì)照玻片，另外需配備冷丙酮。所用儀器為奧林巴斯BX65熒光顯微鏡和可調(diào)控溫度水浴箱。

1.3標(biāo)本采集 患兒入院后由專業(yè)護(hù)士用一次性吸痰管抽吸痰液1.0～2.0 mL置于無(wú)菌培養(yǎng)管中，不得傾斜或顛覆，標(biāo)本采集后2 h內(nèi)送檢。

1.4操作方法

1.4.1標(biāo)本處理 檢驗(yàn)員按個(gè)人三級(jí)生物防護(hù)要求穿戴防護(hù)用品，在生物安全柜內(nèi)將臨床采集痰液標(biāo)本分成5份，一份不加熱滅活，直接用于常規(guī)7項(xiàng)呼吸道DFA檢測(cè)，另外4份分別于56 ℃、30 min，56 ℃、60 min，60 ℃、30 min，70 ℃、15 min在水浴箱中水浴滅活后再進(jìn)行常規(guī)7項(xiàng)呼吸道病毒抗原DFA檢測(cè)的常規(guī)操作。

1.4.2操作步驟 未滅活和加熱滅活后的痰液標(biāo)本中加入磷酸鹽緩沖液5～10 mL,在渦旋混勻器上輕微混勻,以1 500 r/min離心5 min,去除上清液留取沉淀，再用磷酸鹽緩沖液洗滌沉淀1～2 次，最后將沉淀液溶解在0.5～1.0 mL磷酸鹽緩沖液中，吸管輕輕吹打使其成為細(xì)胞懸液，移液器吸取25 μL細(xì)胞懸液于玻片上點(diǎn)樣共7點(diǎn)，分別用于檢測(cè)RSV、ADV、IFA、IFB、PIV1、PIV2，PIV3。玻片空氣中室溫干燥后，冷丙酮固定10 min，取出晾干。玻片上每個(gè)細(xì)胞點(diǎn)加1滴相應(yīng)的熒光抗體，必須完全覆蓋待測(cè)標(biāo)本，將載玻片放在濕盒中置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min，反應(yīng)時(shí)間到后，用事先配制好的磷酸鹽緩沖液浸泡洗滌。晾干后用封閉液封片，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.4.3檢測(cè)結(jié)果判斷 以200倍視野見(jiàn)到≥2個(gè)蘋果綠熒光細(xì)胞為陽(yáng)性，否則為陰性。試劑盒提供的陰性對(duì)照/陽(yáng)性對(duì)照處理同標(biāo)本處理流程。合格的標(biāo)本要求在放大倍數(shù)為200倍下，每個(gè)視野至少有2個(gè)上皮細(xì)胞。陰性結(jié)果為至少含有20個(gè)柱狀上皮細(xì)胞的標(biāo)本中無(wú)熒光染色。如果標(biāo)本中上皮細(xì)胞數(shù)量<20個(gè)則為標(biāo)本不合格，應(yīng)重新采樣再進(jìn)行檢測(cè)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，未滅活和加熱滅活方法之間的比較采用R×C或配對(duì)χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。一致性檢驗(yàn)計(jì)算Kappa值，當(dāng)Kappa值<0.50時(shí)一致性較差，0.50～0.75為一致性較好，>0.75時(shí)表示有極好的一致性。

2 結(jié) 果

2.1未滅活常規(guī)方法檢測(cè)標(biāo)本同加熱滅活后標(biāo)本結(jié)果比較 64份下呼吸道感染標(biāo)本中，未滅活常規(guī)方法檢出至少一種病原體陽(yáng)性39份，檢出率為60.9%(39/64)，其中RSV陽(yáng)性標(biāo)本檢出最多，為23份(35.9%)，其次檢出PIV3陽(yáng)性11份(17.2%)，ADV陽(yáng)性2份(3.1%)，PIV1 2份(3.1%)，IFA 2份(3.1%)，其中1份標(biāo)本為RSV和PIV3兩種病毒混合感染。以未滅活常規(guī)DFA檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，在未滅活常規(guī)方法呈陽(yáng)性結(jié)果的39份標(biāo)本中，經(jīng)56 ℃、30 min,56 ℃、60 min,60 ℃、30 min,70 ℃、15 min加熱滅活后均檢測(cè)為陽(yáng)性，不同溫度時(shí)間加熱滅活后的陽(yáng)性符合率均為100.0%(39/39)，未滅活常規(guī)方法呈陰性結(jié)果的25份標(biāo)本中，4種方法加熱滅活后均為陰性，陰性符合率為100.0%(25/25)，總符合率為100.0%(64/64)，加熱滅活同未滅活常規(guī)檢測(cè)方法一致性極好(Kappa=1.000)，且檢出結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2未滅活標(biāo)本同加熱滅活后標(biāo)本熒光顯微鏡下形態(tài)比較 DFA檢測(cè)呼吸道病毒抗原在56 ℃、30 min，56 ℃、60 min，60 ℃、30 min加熱后同未滅活常規(guī)方法比較，陽(yáng)性細(xì)胞熒光狀態(tài)、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)基本一致，沒(méi)有明顯差異，見(jiàn)圖1。70 ℃、15 min加熱后比較，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少明顯、陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度可見(jiàn)明顯下降，背景無(wú)黏液絲干擾，熒光滴度明顯下降，見(jiàn)圖2。

注：A為未滅活，B為56 ℃、30 min，C為56 ℃、60 min，D為60 ℃、30 min。

注：A為未滅活，B為70 ℃、15 min。

3 討 論

急性呼吸道感染是導(dǎo)致小兒發(fā)病和死亡的一個(gè)重要原因，其中絕大多數(shù)感染由病毒引起，由于這些病毒感染的臨床表現(xiàn)和流行特點(diǎn)相似，難以用臨床癥狀和常規(guī)檢測(cè)方法進(jìn)行病原鑒定區(qū)分[8]，所以對(duì)于引起呼吸道感染的病原體的早期鑒別診斷十分重要，及早干預(yù)、診斷與治療，可以降低急性呼吸道感染的發(fā)病率及病死率[9]。研究表明，采用DFA檢測(cè)7種呼吸道病毒抗原，特異度及靈敏度較高，能為小兒呼吸道病毒感染的早期診斷提供依據(jù)[10]，但是由于該方法采用的試驗(yàn)標(biāo)本為鼻咽拭子或下呼吸道灌洗液標(biāo)本，所以在試驗(yàn)處理標(biāo)本過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)生物安全危害，感染檢驗(yàn)人員，所以下呼吸道標(biāo)本的安全處理在實(shí)驗(yàn)室生物安全防護(hù)上顯得尤為重要。新型冠狀病毒肺炎疫情暴發(fā)以來(lái)，對(duì)新型冠狀病毒的檢測(cè)也給實(shí)驗(yàn)室生物安全帶來(lái)巨大風(fēng)險(xiǎn)，《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第八版)》指出冠狀病毒對(duì)紫外線和熱敏感[11]，因此本研究采用56 ℃、30 min，56 ℃、60 min，60 ℃、30 min，70 ℃、15 min加熱滅活前處理標(biāo)本，并同未滅活常規(guī)方法檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行比較，結(jié)果表明，加熱滅活后標(biāo)本陽(yáng)性符合率、陰性符合率具有極好的一致性(Kappa=1.000)，兩者檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

加熱是滅活病毒的簡(jiǎn)單有效的方法，該方法不加入任何化學(xué)試劑，依靠控制溫度和時(shí)間，破壞病毒的高級(jí)結(jié)構(gòu)，使其蛋白不再具有生理活性，從而失去感染、致病和繁殖能力[12]。在檢驗(yàn)科實(shí)際工作中，涉及滅活標(biāo)本為痰液標(biāo)本的研究，更多關(guān)注的是加熱滅活對(duì)流感病毒核酸[13]、新型冠狀病毒核酸檢測(cè)[14]能力的影響，以及加熱滅活對(duì)分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)結(jié)果影響的相關(guān)研究，但分子技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件設(shè)備、儀器、人員素質(zhì)要求較高，并不適用于基層醫(yī)院開(kāi)展，而對(duì)于廣大基層醫(yī)院普遍開(kāi)展的DFA檢測(cè)下呼吸道病毒抗原加熱滅活的研究鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。檢驗(yàn)科實(shí)驗(yàn)室在采用DFA處理標(biāo)本時(shí)，需要預(yù)防標(biāo)本中存在的致病病毒可能帶來(lái)的生物安全危害[15]。目前，冠狀病毒理化特性多參考關(guān)于嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)病毒的研究，鄢心革等[5]研究指出，56 ℃下，60 min比30 min具有更好的滅活效果，30 min滅活效率為99.99%，60 min對(duì)SARS病毒滅活效率為100.00%，因此為防止滅活不徹底，筆者不推薦標(biāo)本進(jìn)行56 ℃、30 min加熱滅活處理。該文同時(shí)指出，滅活時(shí)間增加會(huì)導(dǎo)致SARS病毒抗原性降低，過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的滅活也會(huì)增加檢驗(yàn)報(bào)告時(shí)間，因此筆者也不推薦標(biāo)本56 ℃、60 min加熱滅活處理。鮑作義等[7]報(bào)道，經(jīng)過(guò)70 ℃、15 min加熱滅活的標(biāo)本檢測(cè)不出活SARS病毒。由于DFA檢測(cè)在結(jié)果判斷上依賴技術(shù)人員的主觀判斷，因?yàn)楸狙芯坑筛呗毞Q技師在熒光顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)比較，結(jié)果表明，陽(yáng)性結(jié)果標(biāo)本采用56 ℃、30 min，56 ℃、60 min，60 ℃、30 min加熱滅活后與未滅活前比較，陽(yáng)性細(xì)胞熒光狀態(tài)、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)基本一致，而采用70 ℃、15 min加熱滅活后，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少明顯、陽(yáng)性細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著下降，會(huì)嚴(yán)重影響DFA閱片，導(dǎo)致可能發(fā)出假陰性結(jié)果,原因可能為過(guò)高的溫度破壞了陽(yáng)性細(xì)胞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)導(dǎo)致抗原性降低，從而影響抗原抗體反應(yīng)，因此筆者不推薦為了節(jié)約檢驗(yàn)時(shí)間而采用70 ℃、15 min加熱滅活方法。RABENAU等[6]指出，60 ℃處理30 min后，SARS病毒完全滅活沒(méi)有任何殘留，同時(shí)此溫度時(shí)間滅活后不影響熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。因此筆者推薦DFA檢測(cè)采用60 ℃，30 min加熱滅活方法。本研究中筆者還發(fā)現(xiàn)，加熱滅活后在熒光顯微鏡下閱片，熒光背景比加熱滅活之前更加清晰干凈，有助于檢驗(yàn)人員對(duì)結(jié)果進(jìn)行主觀判斷，原因可能為加熱有助于痰液中的黏液絲液化，可有效避免黏液產(chǎn)生背景熒光對(duì)DFA結(jié)果判讀的影響。

綜上所述，加熱是滅活病毒簡(jiǎn)單有效的方法，實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行下呼吸道病毒抗原檢測(cè)實(shí)驗(yàn)時(shí)，建議對(duì)標(biāo)本采用加熱滅活后再進(jìn)行檢測(cè)，這樣有利于檢驗(yàn)人員主觀結(jié)果判斷，同時(shí)保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，而且降低實(shí)驗(yàn)室生物安全風(fēng)險(xiǎn)，有效避免實(shí)驗(yàn)室工作人員發(fā)生感染。