CBX4和NET-1在原發(fā)性直腸癌中的表達(dá)變化及臨床意義*

王 凡，王明輝，王建勛，張四新

1.唐山市協(xié)和醫(yī)院普外科，河北唐山 063000;2.唐山市中醫(yī)醫(yī)院普外科，河北唐山 063000;3.安國(guó)市醫(yī)院普外科，河北安國(guó) 071200;4.解放軍陸軍第82集團(tuán)軍醫(yī)院普外科，河北保定 071000

直腸癌是臨床常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率和病死率均居中國(guó)惡性腫瘤第5位。據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計(jì)，中國(guó)每年新增結(jié)直腸癌病例數(shù)約37萬(wàn)，其中死亡例數(shù)高達(dá)19.1萬(wàn)，該病嚴(yán)重危害人們的身體健康[1-2]。因早期直腸癌臨床癥狀不明顯，容易導(dǎo)致多數(shù)患者未能及時(shí)診治，確診時(shí)往往已發(fā)展至中晚期，且易復(fù)發(fā)，預(yù)后差，治療過(guò)程非常痛苦[3]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國(guó)結(jié)直腸癌患者5年生存率僅為32%，遠(yuǎn)低于美國(guó)水平(64%)[4]，因而深入探究與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子標(biāo)志物，對(duì)疾病的早期確診、及時(shí)治療和預(yù)后改善具有重要價(jià)值。染色盒同源物4(CBX4)屬于PcG蛋白家族的成員，最初被證實(shí)具有E3連接酶活性，參與染色質(zhì)重組與轉(zhuǎn)錄抑制，近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，其還與癌癥的侵襲與遷移相關(guān)[5]，但當(dāng)前少有研究探討CBX4與腫瘤的關(guān)系。新四極體-1(NET-1)是新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤基因，與腫瘤細(xì)胞的分裂增殖、浸潤(rùn)遷移有關(guān)[6]，而其在直腸癌中的研究很少見(jiàn)。因此，本研究通過(guò)測(cè)定直腸癌組織中CBX4和NET-1表達(dá)水平，分析其與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，并對(duì)二者致癌作用的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取唐山市協(xié)和醫(yī)院在2013年4月至2015年7月收治的行手術(shù)切除的原發(fā)性直腸癌患者50例，手術(shù)過(guò)程中留取所有患者癌組織和癌旁正常直腸組織，其中男28例，女22例；年齡37～75歲，平均(55.22±8.14)歲；37～60歲有32例，>60～75歲有18例；吸煙27例，不吸煙23例；飲酒25例，不飲酒25例；TNM分期[7]：Ⅰ+Ⅱ期16例，Ⅲ+Ⅳ期34例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例；分化程度：高、中分化35例，低、無(wú)分化15例；腫瘤最大徑：≥5 cm 29例，<5 cm 21例；漿膜浸潤(rùn)36例，非漿膜浸潤(rùn)14例。本研究經(jīng)唐山市協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有患者及其家屬均支持本研究，并簽署知情同意書(shū)。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)臨床病理學(xué)診斷并確診為原發(fā)性直腸癌；(2)臨床病理資料完整、詳細(xì)；(3)行該手術(shù)前未接受任何針對(duì)性治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有其他惡性腫瘤；(2)合并有其他對(duì)患者生存期有影響的疾?。?3)病理資料缺失；(4)精神障礙，無(wú)法完成術(shù)后隨訪。

1.3儀器與試劑 兔抗人CBX4抗體(生產(chǎn)批號(hào)：FNab01331)、兔抗人NET-1抗體(生產(chǎn)批號(hào)：FNab05665)、兔抗人二抗(生產(chǎn)批號(hào)：FNab00119)均購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司；免疫組織化學(xué)染色試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：YDJ4123)購(gòu)自上海羽朵生物科技有限公司。生物顯微鏡(型號(hào)：BS200)購(gòu)自北京佳源興業(yè)科技有限公司；輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(型號(hào)：SPCC-315)購(gòu)自東莞市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司。

1.4直腸癌組織及癌旁正常直腸組織中CBX4和NET-1水平檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定CBX4和NET-1在原發(fā)性直腸癌組織及癌旁正常組織中表達(dá)水平，由同一病理科醫(yī)生獨(dú)立完成所有病理標(biāo)本的檢測(cè)。常規(guī)制作相應(yīng)石蠟標(biāo)本，約4.0 μm薄片，60 ℃烘干后依次用二甲苯及梯度乙醇脫蠟，3%過(guò)氧化氫滅活后修復(fù)組織抗原，滴加CBX4或NET-1單克隆抗體孵育過(guò)夜，滴加二抗，37 ℃孵育10 min，滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物，滴加配制的DAB顯色劑進(jìn)行顯色后，用蘇木素復(fù)染，梯度乙醇常規(guī)洗脫脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察拍照。用試劑盒提供的陽(yáng)性病理切片作為陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均由1名實(shí)驗(yàn)人員和2名專業(yè)醫(yī)師根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]獨(dú)立判斷評(píng)定，若結(jié)果不同，經(jīng)討論后共同決定。著色深度評(píng)定：CBX4和NET-1陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度依據(jù)陽(yáng)性著色深度進(jìn)行評(píng)分：樣品無(wú)染色記為0分，淺黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分。隨機(jī)選取8個(gè)高倍視野(×400)，按照著色細(xì)胞相對(duì)水平(即所占百分比)評(píng)分：<5%記為0分，5%～25%記為1分，>25%～50%記為2分，>50%～75%記為3分，>75%記為4分。根據(jù)二者乘積(著色深度評(píng)分×著色細(xì)胞相對(duì)含量)大小評(píng)定結(jié)果：0～3分為陰性(-)，>3～12分為陽(yáng)性(+)。其中陰性代表低表達(dá)，陽(yáng)性代表高表達(dá)。

1.5病例隨訪 對(duì)所有原發(fā)性直腸癌患者進(jìn)行常規(guī)隨訪，隨訪時(shí)間為0～60個(gè)月，平均(38.96±9.75)個(gè)月。隨訪以電話、復(fù)查的形式進(jìn)行，1次/月。隨訪截止時(shí)間為2020年7月31日，死亡患者以死亡日期作為隨訪截止時(shí)間，觀察并統(tǒng)計(jì)隨訪時(shí)間內(nèi)患者生存情況。本次研究隨訪率為100%，所有患者無(wú)一缺訪。

2 結(jié) 果

2.1CBX4和NET-1在原發(fā)性直腸癌患者癌組織及癌旁正常直腸組織中CBX4和NET-1陽(yáng)性表達(dá)水平比較 原發(fā)性直腸癌患者癌組織中CBX4陽(yáng)性表達(dá)率為74.00%，明顯高于癌旁組織的28.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NET-1陽(yáng)性表達(dá)率為68.00%，明顯高于癌旁正常組織的24.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

注：A為直腸癌組織CBX4陽(yáng)性；B為直腸癌組織CBX4陰性；C為直腸癌組織NET-1陽(yáng)性；D為直腸癌組織NET-1陰性；E為癌旁正常直腸組織CBX4陽(yáng)性；F為癌旁正常直腸組織CBX4陰性；G為癌旁正常直腸組織NET-1陽(yáng)性；H為癌旁正常直腸組織NET-1陰性。

表1 原發(fā)性直腸癌患者癌組織及癌旁正常直腸組織中CBX4和NET-1陽(yáng)性率比較[n(%)]

2.2CBX4和NET-1表達(dá)水平與直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 原發(fā)性直腸癌組織中的CBX4和NET-1表達(dá)水平在不同性別、年齡、吸煙、飲酒及腫瘤最大徑的患者之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而在不同TNM分期、不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、不同分化程度、有無(wú)漿膜浸潤(rùn)患者之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 CBX4和NET-1表達(dá)水平與直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3直腸癌組織中CBX4和NET-1表達(dá)的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，直腸癌組織中CBX4表達(dá)水平與NET-1表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.647，P<0.05)。

2.4CBX4和NET-1表達(dá)情況與原發(fā)性直腸癌患者生存率的關(guān)系 對(duì)50例患者進(jìn)行為期5年隨訪，存活16例，死亡34例，總生存率32.00%(16/50)。其中CBX4高表達(dá)患者5年生存率[21.62%(8/37)]明顯低于CBX4低表達(dá)患者5年生存率[61.54%(8/13)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.044，P=0.008)；NET-1高表達(dá)患者5年生存率[17.65%(6/34)]明顯低于NET-1低表達(dá)患者5年生存率[62.50%(10/16)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.059，P=0.002)。見(jiàn)圖2。

2.5影響原發(fā)性直腸癌患者預(yù)后危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析 以原發(fā)性直腸癌患者手術(shù)后隨訪5年的生存結(jié)局為因變量(1=存活，0=死亡)，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、漿膜浸潤(rùn)及CBX4、NET-1表達(dá)水平為自變量，Logistic分析結(jié)果顯示，TNM分期(Ⅲ+Ⅳ期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及CBX4、NET-1高表達(dá)都是影響原發(fā)性直腸癌患者預(yù)后的因素(P<0.05)。見(jiàn)表3。

注：A為CBX4表達(dá)情況與原發(fā)性直腸癌患者生存率的關(guān)系；B為NET-1表達(dá)情況與原發(fā)性直腸癌患者生存率的關(guān)系。

表3 影響原發(fā)性直腸癌患者預(yù)后危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析結(jié)果

3 討 論

直腸癌是一種原發(fā)于直腸黏膜的惡性腫瘤，屬于常見(jiàn)的潛在致死性疾病，該疾病高發(fā)人群為40歲以上男性，發(fā)病早期癥狀不明顯，隨著病情發(fā)展，臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹部腫塊、腸梗阻、低熱、乏力等，極大降低了患者的生活質(zhì)量。臨床治療直腸癌常以手術(shù)為主，但因其位置深入盆腔、解剖關(guān)系較復(fù)雜，致使手術(shù)難度增大，術(shù)后預(yù)后差且易復(fù)發(fā)，生存率低[9-10]。因此，臨床上尋找能有效預(yù)測(cè)直腸癌患者預(yù)后的指標(biāo)尤為重要，以便對(duì)患者提前干預(yù)，進(jìn)而改善預(yù)后，降低癌癥復(fù)發(fā)，延長(zhǎng)生存期，提高生存率。

PcG蛋白是一類在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、DNA修復(fù)及細(xì)胞分化、衰老、死亡中具有重要作用的蛋白，在哺乳動(dòng)物中主要由PcG蛋白復(fù)合體1(PRC1)和PRC2組成[11-13]。CBX4屬于PRC1核心成員之一，可通過(guò)增強(qiáng)低氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)和促進(jìn)血管的生成，增加原發(fā)性肝細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。陳鵬等[15]在研究microRNA-195通過(guò)抑制CBX4在肝癌中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，CBX4在肝癌中的過(guò)度表達(dá)可恢復(fù)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。上述結(jié)果均提示，CBX4在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中表達(dá)水平升高。宋秀道等[16]研究發(fā)現(xiàn)，CBX4與肝癌患者組織學(xué)分級(jí)、腫瘤轉(zhuǎn)移分期、微血管密度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及血行轉(zhuǎn)移有關(guān)，且是影響肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素，提示CBX4有可能成為判斷腫瘤患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。NET-1與腫瘤的表達(dá)有關(guān)，屬于四聚體超家族的成員之一，其廣泛參與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究表明，NET-1在多種惡性腫瘤中(如胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌等)表達(dá)水平明顯升高[17-19]。楊永江等[20]探討了NET-1在結(jié)腸癌中的表達(dá)水平、臨床意義和預(yù)后分析，結(jié)果顯示，NET-1蛋白在結(jié)腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，且其與腫瘤的TNM 分期、脈管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝轉(zhuǎn)移等病理參數(shù)密切相關(guān)；NET-1陽(yáng)性組的中位生存時(shí)間明顯短于陰性組，并且其表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者的預(yù)后相關(guān)，以上結(jié)果提示NET-1的異常表達(dá)在結(jié)腸癌病變的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，并與患者的生存期有關(guān)，是結(jié)腸癌潛在的生物學(xué)指標(biāo)。

本研究中原發(fā)性直腸癌組織中CBX4和NET-1陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織(74.00%、68.00%vs.28.00%、24.00%)，說(shuō)明在直腸癌組織中CBX4和NET-1表達(dá)上調(diào)，同郭飛等[4]結(jié)果顯示NET-1在直腸癌中呈高表達(dá)相一致，提示二者與原發(fā)性直腸癌有關(guān)。研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性直腸癌組織中的CBX4和NET-1表達(dá)水平在不同性別、年齡、不同吸煙、飲酒情況及不同腫瘤最大徑的患者之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在不同TNM分期、不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、不同分化程度、不同漿膜浸潤(rùn)情況患者之間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示CBX4和NET-1二者可能通過(guò)某種作用機(jī)制參與原發(fā)性直腸癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，但針對(duì)其具體機(jī)制仍有待后期深入探究，進(jìn)而為臨床診治予以科學(xué)依據(jù)支持。相關(guān)性分析顯示，CBX4和NET-1表達(dá)水平在直腸癌組織中呈正相關(guān)，也推測(cè)二者可能在疾病中具有協(xié)同作用，影響淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或腫瘤細(xì)胞增殖、遷移等，因此也提示臨床可將二者聯(lián)合檢測(cè)，提高診治準(zhǔn)確性；另外，術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn)，CBX4和NET-1高表達(dá)直腸癌患者5年生存率均明顯低于CBX4和NET-1低表達(dá)患者，提示二者呈高表達(dá)患者預(yù)后差，2項(xiàng)指標(biāo)可能成為評(píng)價(jià)患者預(yù)后的有效指標(biāo)。Logistic分析顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及CBX4、NET-1高表達(dá)都是影響直腸癌患者預(yù)后的因素，提示CBX4和NET-1高表達(dá)患者應(yīng)進(jìn)行定期檢查，及時(shí)發(fā)現(xiàn)、治療，降低預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)。本研究也受隨訪時(shí)間、樣本量少等因素限制，選取病例時(shí)間較早，結(jié)果存在一定不足，仍需大樣本、前瞻性研究進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果。

綜上所述，CBX4和NET-1在直腸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、漿膜浸潤(rùn)有關(guān)，且二者呈正相關(guān)，與生存率相關(guān)，影響患者預(yù)后，可能作為評(píng)價(jià)直腸癌患者預(yù)后的臨床指標(biāo)。