MAPKAPK5-AS1在肝癌中的臨床意義及通過AKT/mTOR通路調(diào)控增殖和轉(zhuǎn)移的機制研究*

周 健，韓龍江

1.重慶市榮昌區(qū)人民醫(yī)院肝膽外科，重慶 402460；2.重慶市萬盛經(jīng)開區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶 400800

一項全球性統(tǒng)計報告顯示，2018年有841 080例新發(fā)肝癌患者，占所有腫瘤的4.7%，排名第7位；2018年死于肝癌的患者為782 685例，占所有死于腫瘤患者的8.2%，排名第2位[1]。手術(shù)切除和化學(xué)療法是治療原發(fā)性肝癌的主要方法，但是由于肝組織中的血管豐富，極易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2]。研究顯示，肝癌的復(fù)發(fā)率高達80%[3]。尋找新的生物標(biāo)志物、探索肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機制具有重要的現(xiàn)實意義。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一系列不具有編碼功能的單鏈RNA，長度為200 nt至100 000 nt。lncRNA可以通過調(diào)節(jié)表觀遺傳、激活或干擾轉(zhuǎn)錄的作用調(diào)控基因表達[4]。此外，lncRNA可以像“海綿”一樣吸收微小RNA(miRNA)并抑制miRNA的功能，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達水平[5]。MAPKAPK5-AS1是新發(fā)現(xiàn)的一種與腫瘤有關(guān)的lncRNA，國內(nèi)有研究顯示，過表達MAPKAPK5-AS1后肺癌細胞的侵襲能力降低而凋亡率升高，說明了MAPKAPK5-AS1在肺癌中的調(diào)控作用[6]。也有研究顯示MAPKAPK5-AS1可以通過調(diào)控p21蛋白的表達水平誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞的增殖[7]。一項關(guān)于癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫和NCBI(GSE65485)數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)分析構(gòu)建了肝癌中的lncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中6個關(guān)鍵的lncRNA包括MAPKAPK5-AS1[8]，然而，MAPKAPK5-AS1與肝癌預(yù)后的關(guān)系及對肝癌細胞的調(diào)控作用和機制鮮見報道。本研究旨在探討MAPKAPK5-AS1在肝癌中的表達特點，并分析MAPKAPK5-AS1與肝癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，通過細胞實驗分析MAPKAPK5-AS1對肝癌細胞生物學(xué)行為的影響，并初步分析作用機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料來源 收集2013年1月至2015年1月的肝癌組織和對應(yīng)的距離腫瘤邊緣3 cm以上的癌旁正常組織標(biāo)本各90份，其中男70例，女20例；年齡32～77歲，平均(52.64±5.94)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)過病理學(xué)活檢確診為肝癌；(2)年齡20～80歲；(3)首次確診，無其他原發(fā)性腫瘤，標(biāo)本收集前未接受化療、放療、靶向療法等治療；(4)知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)腫瘤性質(zhì)、分期等臨床病理等無法確定；(2)基本資料缺失。所有標(biāo)本保存在-80 ℃環(huán)境下。通過RT-qPCR檢測各組織中MAPKAPK5-AS1的表達水平。本研究符合《赫爾辛基宣言》，并得到醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 人正常肝細胞MIHA和4株肝癌細胞系Huh7、LM3、7721和HepG2(ATCC，美國)；DMEM培養(yǎng)基血清和抗體(Invitrogen公司，美國)；MAPKAPK5-AS1 pcDNA3.1、shMAPKAPK5-AS1及相應(yīng)的陰性對照(GenePharma公司，中國)；LipofectamineTM2000(Invitrogen公司，美國)；TRIzol(Sigma公司，美國)；PrimeScript-RT和SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Takara公司，日本)；CCK-8試劑盒(Beyotime研究所，中國)；Transwell小室購自Becton Dickinson公司(美國)；FACSCanto Ⅱ流式細胞儀和Annexin V-FITC/碘化丙錠(PI)試劑盒(BD Biosciences公司，加拿大)；光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)；抗體AKT、mTOR和山羊抗兔IgG H&L二抗(Abcam公司，美國)；PVDF膜(Bio-Rad公司，美國)；化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒(Thermo Fisher公司，美國)。

1.3細胞培養(yǎng)、分組和轉(zhuǎn)染 將DMEM培養(yǎng)基中(37 ℃，5%的CO2)處于對數(shù)生長期的LM3細胞分為shNC組和shMAPKAPK5-AS1組，HepG2細胞分為vector-NC組和MAPKAPK5-AS1組。shMAPKAPK5-AS1組首先通過轉(zhuǎn)染100 pmol的3種不同的shMAPKAPK5-AS1(分別為sh1、sh2和sh3)沉默MAPKAPK5-AS1；MAPKAPK5-AS1組轉(zhuǎn)染100 pmol的MAPKAPK5-AS1 pcDNA3.1來過表達MAPKAPK5-AS1，利用LipofectamineTM2000進行轉(zhuǎn)染，shNC和vector-NC組分別轉(zhuǎn)染等量的空載質(zhì)粒作為對照，轉(zhuǎn)染條件為7 ℃，5%CO2，48 h。

1.4生物信息學(xué)分析 利用工具網(wǎng)站GEPIA分析TCGA數(shù)據(jù)庫中MAPKAPK5-AS1在肝癌組織中的表達特點及其與TNM分期的關(guān)系，通過Kaplan-Meier分析不同MAPKAPK5-AS1表達水平與肝癌患者總生存率和無進展生存期之間的關(guān)系。

1.5檢測指標(biāo)和方法

1.5.1RT-qPCR 將肝癌組織或細胞系通過TRIzol獲得總RNA，分別通過PrimeScript-RT和SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄(37 ℃,15 min;85 ℃,5 s)和qPCR(95 ℃ 10 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min,40個循環(huán)；65 ℃ 45 s)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)用作內(nèi)參，通過2-ΔΔCt分析肝癌組織和細胞系中MAPKAPK5-AS1的相對表達水平。MAPKAPK5-AS1上游引物：5′-GGC GTC GTG AGG TAT GGA TGT TC-3′，下游引物5′-GCT TGA CCA CTT CTC GGC TGT G-3′；GAPDH上游引物：5′-CAA GGT CAT CCA TGA CAA CTT TG-3′，下游引物：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TAG-3′。

1.5.2CCK-8檢測增殖 將總體積為100 μL、總數(shù)量1×104的細胞接種在96孔板中。培養(yǎng)1、2、3、4、5 d后，添加10 μL的CCK-8，并在37 ℃下培養(yǎng)2 h染色。用酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度(A)。

1.5.3流式細胞術(shù)檢測凋亡 使用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測細胞凋亡率。根據(jù)說明書，細胞經(jīng)消化、洗滌后，分別加入5 μL的Annexin V-FITC和PI，并在黑暗中孵育15 min，然后通過流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.5.4劃痕愈合試驗檢測遷移 將接種于6孔板中的1×106個細胞培養(yǎng)至達到約90%的融合，然后使用200 μL的移液器槍頭垂直、均勻地做一道劃痕，洗去被劃掉的細胞并在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。通過光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，計算劃痕前緣移動距離百分比=前緣移動距離/劃痕寬度×100%。

1.5.5Transwell檢測侵襲 將基質(zhì)膠和完全培養(yǎng)基分別添加到Transwell的上部和下部腔室中。將1×104個細胞添加在上室中并孵育48 h。將入侵進入下室的細胞用20%甲醇固定并用0.1%結(jié)晶紫染色，計數(shù)進入5個視野中每個視野細胞數(shù)的平均值。

1.5.6Western blot檢測蛋白 通過細胞裂解液提取細胞或組織中的總蛋白，并通過BCA試劑盒檢測濃度。 通過SDS-PAGE(120 V，90 min)分離出30 μg的總蛋白。將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(90 V，90 min)，并加入5%的脫脂牛奶孵育1 h進行封閉。然后分別加入1∶500稀釋的anti-AKT和anti-mTOR并分別在4 ℃下孵育過夜。 然后將HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗以1∶5 000稀釋并加入到PVDF膜中并在室溫下添加2 h。GAPDH作為內(nèi)參，使用Image J 1.8.0軟件分析目標(biāo)蛋白條帶的灰度值計算相對表達水平。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 使用GraphPad Prism7.0進行統(tǒng)計分析。通過Kaplan-Meier分析臨床肝癌標(biāo)本中MAPKAPK5-AS1表達水平與預(yù)后的關(guān)系。采用χ2檢驗比較MAPKAPK5-AS1高表達和低表達的差異。組間的比較使用單因素方差析和Tukey檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1生物信息學(xué)分析結(jié)果 在TCGA數(shù)據(jù)庫中，MAPKAPK5-AS1在肝癌中的表達水平高于正常肝組織，并且不同TNM分期的肝癌組織中MAPKAPK5-AS1表達水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.28，P<0.001)，隨著分期的升高，MAPKAPK5-AS1水平也隨之升高。并且MAPKAPK5-AS1高表達的肝癌患者的生存率和無進展生存期均明顯低于MAPKAPK5-AS1低表達患者(P<0.001，P=0.037)。見圖1。

注：A為在TCGA數(shù)據(jù)庫中，MAPKAPK5-AS1在肝癌組織和正常組織中的表達水平比較；B為MAPKAPK5-AS1在TNM分期為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期腫瘤組織中的表達水平比較；C為通過Kaplan-Meier分析肝癌組織中MAPKAPK5-AS1表達水平與生存率之間的關(guān)系；D為通過Kaplan-Meier分析肝癌組織中MAPKAPK5-AS1表達水平與無進展生存期之間的關(guān)系。

2.2MAPKAPK5-AS1與肝癌患者的TNM分期、血管侵犯和不良預(yù)后有關(guān) 為了分析MAPKAPK5-AS1在肝癌中的臨床意義，收集了90份肝癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本。RT-qPCR結(jié)果顯示，MAPKAPK5-AS1在肝癌組織中的相對表達水平(2.47±0.62),明顯高于癌旁組織(1.00±0.29)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。根據(jù)MAPKAPK5-AS1表達水平將90份標(biāo)本分為低表達組和高表達組，結(jié)果表明，MAPKAPK5-AS1高表達與較高的TNM分期和血管侵犯有關(guān)(P<0.05)，見表1。生存分析結(jié)果還顯示，MAPKAPK5-AS1高表達的肝癌患者的生存率明顯低于MAPKAPK5-AS1低表達患者(P<0.05)，見圖2。

表1 MAPKAPK5-AS1與肝癌患者的臨床病理特征的關(guān)系(n)

注：通過Kaplan-Meier分析肝癌組織中MAPKAPK5-AS1表達水平與生存率之間的關(guān)系，P=0.009 6。

2.3MAPKAPK5-AS1沉默和過表達肝癌細胞模型的構(gòu)建 通過RT-qPCR檢測人正常肝細胞MIHA和4株肝癌細胞系Huh7、LM3、7721和HepG2中MAPKAPK5-AS1表達水平，發(fā)現(xiàn)4株肝癌細胞系中MAPKAPK5-AS1表達水平明顯高于人正常肝細胞(P<0.05)。其中LM3中MAPKAPK5-AS1表達水平最高，是MIHA的(4.06±0.58)倍；HepG2中MAPKAPK5-AS1表達水平相對最低，為MIHA的(2.25±0.24)倍。利用LM3細胞構(gòu)建MAPKAPK5-AS1沉默的細胞模型，轉(zhuǎn)染后細胞中MAPKAPK5-AS1的表達水平降低至shNC組的(0.24±0.04)。利用HepG2細胞構(gòu)建MAPKAPK5-AS1過表達的細胞模型，轉(zhuǎn)染后細胞中的MAPKAPK5-AS1的表達水平升高至vector-NC組的(2.64±0.31)倍。

2.4沉默MAPKAPK5-AS1對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 為分析MAPKAPK5-AS1對肝癌細胞的影響，將LM3細胞分為shNC組和shMAPKAPK5-AS1組(轉(zhuǎn)染sh1質(zhì)粒)，結(jié)果顯示，shMAPKAPK5-AS1組細胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯低于shNC組(P<0.05)，而shMAPKAPK5-AS1組的凋亡率明顯高于shNC組(P<0.05)，見圖3、表2。

圖3 沉默MAPKAPK5-AS1對肝癌細胞LM3增殖能力的影響

表2 沉默MAPKAPK5-AS1對肝癌細胞LM3凋亡、遷移和侵襲的影響

2.5過表達MAPKAPK5-AS1對肝癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響 為分析MAPKAPK5-AS1對肝癌細胞的影響，將HepG2細胞分為vector-NC組和MAPKAPK5-AS1組。結(jié)果顯示，MAPKAPK5-AS1組細胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯高于vector-NC組(P<0.05)，而MAPKAPK5-AS1組的凋亡率明顯低于vector-NC組(P<0.05)，見圖4、表3。

表3 過表達MAPKAPK5-AS1對肝癌細胞HepG2凋亡、遷移和侵襲的影響

圖4 過表達MAPKAPK5-AS1對肝癌細胞HepG2增殖能力的影響

2.6MAPKAPK5-AS1對肝癌細胞中AKT/mTOR通路的影響 進一步研究結(jié)果顯示，shMAPKAPK5-AS1組的AKT和mTOR蛋白水平明顯低于shNC組(P<0.05)；MAPKAPK5-AS1組的AKT和mTOR蛋白水平明顯高于vector-NC組(P<0.05)，見圖5。

注：A為Western blot檢測沉默MAPKAPK5-AS1對AKT/mTOR通路中蛋白表達水平的影響；B為Western blot檢測過表達MAPKAPK5-AS1對AKT/mTOR通路中蛋白表達水平的影響；與shNC組或與vector-NC組比較，aP<0.05。

3 討 論

由于肝癌發(fā)病隱匿，缺乏早期特異性臨床指征，并且體檢在我國覆蓋范圍有限，導(dǎo)致大多數(shù)患者在確診時已經(jīng)處于晚期或發(fā)生了轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)根治的機會。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肝癌患者死亡的重要因素，但是關(guān)于肝癌轉(zhuǎn)移的機制仍不明確[9]。分析肝癌發(fā)生和進展的分子機制是發(fā)現(xiàn)診斷和治療肝癌新的靶標(biāo)的重要手段。

lncRNA在肝癌中的作用已經(jīng)被較多研究進行了驗證，如MCM3AP-AS1可以通過靶向miR-194-5p誘導(dǎo)肝癌進展[10]。lncRNA AY可以通過調(diào)控ITGAV基因的轉(zhuǎn)錄促進肝癌的轉(zhuǎn)移[11]。MAPKAPK5-AS1(Ensembl：ENSG00000234608)位于12號染色體(NC_000012.12)，LUAN等[12]的研究顯示，MAPKAPK5-AS1與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后有關(guān)，并且基因集富集分析結(jié)果顯示，該基因參與調(diào)控自噬。也有體外研究顯示，MAPKAPK5-AS1可以通過靶向let-7f-1-3p促進結(jié)直腸癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[13]。在本研究中，筆者首先進行生物信息學(xué)分析并發(fā)現(xiàn)了在肝癌組織中MAPKAPK5-AS1的表達水平明顯上調(diào)，并且高MAPKAPK5-AS1表達水平與較高的TNM分期、更低的生存率和低的無進展生存期有關(guān)，提示了MAPKAPK5-AS1的促癌作用。為了進一步分析MAPKAPK5-AS1的臨床意義，本研究收集了90份肝癌標(biāo)本和對應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本，RT-qPCR結(jié)果也顯示，MAPKAPK5-AS1在肝癌組織中明顯升高。此外，MAPKAPK5-AS1高表達與較高的TNM分期、血管侵犯和更低的生存率有關(guān)。這提示MAPKAPK5-AS1與肝癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，并且可能成為診斷和預(yù)測肝癌的生物標(biāo)志物。

為進一步分析MAPKAPK5-AS1對肝癌細胞的影響，本研究首先分析了人正常肝細胞MIHA和4株肝癌細胞系中MAPKAPK5-AS1的水平，與臨床研究結(jié)果和生物信息學(xué)的分析結(jié)果一致，MAPKAPK5-AS1在肝癌細胞系中過表達。然后分別利用LM3細胞和HepG2細胞構(gòu)建MAPKAPK5-AS1沉默和過表達的肝癌細胞模型，結(jié)果顯示，MAPKAPK5-AS1升高后，細胞的增殖、遷移和侵襲的能力也隨之升高，并且凋亡率降低；而沉默MAPKAPK5-AS1對肝癌細胞的影響與之相反。此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，過表達MAPKAPK5-AS1可以使細胞中AKT和mTOR蛋白的水平升高。AKT/mTOR通路是肝癌發(fā)生和進展的關(guān)鍵通路之一[14]，并且最近研究顯示AKT的表達會受到lncRNA的調(diào)控，KOIRALA等[15]的研究結(jié)果顯示lncRNA AK023948可以通過促進AKT的轉(zhuǎn)錄并最終引起AKT蛋白的升高，參與乳腺癌進展。也有研究顯示，lncRNA MEG3可以誘導(dǎo)AKT/mTOR 通路的抑制，從而緩解類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎性反應(yīng)[16]。lncRNA SNHG14可以通過使miR-21海綿化抑制miR-21對AKT的促進作用，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上誘導(dǎo)AKT的表達[17]。這提示MAPKAPK5-AS1對肝癌的促進作用可能與AKT/mTOR通路有關(guān)，MAPKAPK5-AS1可能通過與AKT和mTOR的基因的啟動子結(jié)合，促進其轉(zhuǎn)錄上調(diào)其表達水平；MAPKAPK5-AS1也可能通過對應(yīng)的miRNA在轉(zhuǎn)錄后的水平上誘導(dǎo)AKT和mTOR的過表達，從而發(fā)揮促進肝癌增殖和轉(zhuǎn)移以及抑制凋亡的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MAPKAPK5-AS1高表達與肝癌患者較高的TNM分期、血管侵犯和更低的生存率有關(guān)，并且MAPKAPK5-AS1可能通過促進AKT/mTOR通路促進肝癌增殖、轉(zhuǎn)移和抑制凋亡。關(guān)于MAPKAPK5-AS1在肝癌診斷和預(yù)后預(yù)測中的作用值得進一步擴大標(biāo)本分析，MAPKAPK5-AS1對肝癌的促進作用仍需要進一步的體內(nèi)試驗驗證，此外，MAPKAPK5-AS1調(diào)控AKT/mTOR通路的分子機制也需要深入研究。