乳腺浸潤性導管癌中絲氨酸蛋白酶抑制劑A1表達及對預后判斷的臨床價值研究

李 歡，王世全，李 鐸

(錦州市婦嬰醫(yī)院乳腺科，遼寧 錦州 121000)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其中最常見的類型是浸潤性導管癌[1]，病變的形成涉及多種分子生物學因子的調控異常。絲氨酸蛋白酶抑制劑A1(Serine protease inhibitor A1，SerPinA1)是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的重要成員之一，正常機體的肝細胞內有微量合成，在炎性相關疾病時表達升高，對炎性因子平衡起一定的調控作用[2]。近年學者在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)SerPinA1表達升高，尤其是上皮源性惡性腫瘤的形成過程中[3]。SerPinA1可能對促進腫瘤細胞的增殖有作用。本研究基于乳腺浸潤性導管癌中SerPinA1的表達進行研究，探討其在不同臨床病理特征中的表達差別，分析其對預后的判斷價值，以期為臨床工作提供支持。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2015年1-12月期間確診為乳腺浸潤性導管癌的患者作為研究對象，共93例。病例納入標準：①均行根治性手術治療，術后經病理醫(yī)師確診，符合WHO中的病理診斷標準；②原發(fā)腫瘤；③臨床隨訪資料完整。排除標準：①術前行放、化療；②診斷有異議者或伴有其他惡性成分者；③雙原發(fā)癌或多原發(fā)癌?；颊呔鶠榕?，年齡31～84歲，平均(59.7±6.5)歲，其中組織學Ⅰ級12例，組織學Ⅱ級60例，組織學Ⅲ級21例。留取腫瘤組織作為研究組，留取距腫物邊緣>2 cm乳腺其他象限的非腫瘤性乳腺組織作為對照組。研究經醫(yī)院倫理委員會批準，符合《赫爾辛基宣言》的要求。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組化實驗：術后標本常規(guī)經中性福爾馬林固定、取材、脫水及石蠟包埋后，切取4 μm切片后置于膠片上，應用免疫組化二步法檢測SerPinA1、人類表皮生長因子受體2(HER-2)和Ki67的表達。SerPinA1的濃縮液、二抗和DAB均購自武漢博士德生物技術公司；HER-2和Ki67為工作液，購自北京中杉金橋生物技術公司。SerPinA1按不同配比濃度先行預實驗，選擇染色效果最佳的濃度(1∶250)用于正式實驗。實驗均手工操作，嚴格按說明書操作，操作均由同一病理技師完成，設陽性對照，減少人為誤差。

結果由兩位病理主治醫(yī)師應用盲法進行判讀。SerPinA1的顯色部位為上皮細胞的細胞漿。應用著色強度和陽性率二維評分法進行綜合評分。著色強度：無色為0分，弱為1分，中為2分，強為3分。陽性率：隨機選擇5個高倍(400倍)視野，計算陽性率，陽性率<5%為0分，5%～25%為1分，以26%～50%為2分，以51%～75%為3分，以>75%為4分。著色強度和陽性率的評分相乘為最終評分，總分范圍0～12分。以≤4分為陰性，以>4分為陽性。計算每張切片SerPinA1表達的陽性率。HER-2的判讀參考乳腺癌HER-2檢測指南(2019版)[4]，以陰性和+為陰性，以為陽性。對的病例行FISH檢測。Ki67的顯色部位是細胞核，以黃色-棕褐色為陽性，選擇熱點區(qū)進行觀察，共選擇3個400倍視野，計算陽性細胞百分率，取平均值，Ki67的陽性率亦稱為增殖指數(shù)。

1.2.2 熒光原位雜交(FISH)實驗：對腫瘤中免疫組化顯示HER-2為的病例行FISH檢測。步驟及判讀參考乳腺癌HER-2檢測指南(2019版)[4]。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，率的組間比較采用χ2檢驗，生存分析應用K-M生存分析，并應用Spearman相關分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 GEPIA數(shù)據(jù)庫中檢索結果 GEPIA數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)SerPinA1在乳腺浸潤性導管癌中的表達高于對照組(P<0.05)。見圖1。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫中檢索結果

2.2 兩組中SerPinA1陽性率比較 研究組中SerPinA1表達的陽性率明顯高于對照組。見表1(圖2)。

表1 兩組中SerPinA1表達陽性率比較[例(%)]

2.3 SerPinA1在研究組不同臨床病理特征分組中表達的比較 研究組中SerPinA1的表達在不同腫瘤最大徑、脈管癌栓、淋巴結轉移、HER-2表達和組織學分級的表達比較差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表2(圖3)。

表2 SerPinA1在研究組不同臨床病理特征分組中表達的比較[例(%)]

圖3 研究組中HER-2陽性的表達(FISH法，×1000)

2.4 研究組中SerPinA1與Ki67的相關性 研究組中Ki67增殖指數(shù)表達范圍是5%～80%，平均(34.3±5.4)%。Spearman相關分析顯示SerPinA1與Ki67呈正相關性(r=0.66，P=0.021)。見圖4、5。

圖4 研究組中Ki67的表達(IHC 二步法，× 200)

圖5 研究組中SerPinA1與Ki67的相關性

2.5 研究組中SerPinA1的表達與生存時間的關系 患者均行術后60個月生存時間的隨訪，截止時間點為2020年12月31日。其中生存56例，死亡33例，失訪4例。行K-M生存分析顯示SerPinA1的表達與生存時間相關(χ2=4.32，P=0.019)，即SerPinA1高表達的患者生存時間短，預后差。見圖6。

圖6 SerPinA1與生存時間的關系

3 討 論

乳腺浸潤性導管癌的病變形成與基因表達失調有關[5]。SerPin是眾多腫瘤相關基因中的成員，目前共發(fā)現(xiàn)有9個家族，其中最重要的因子是SerPinA1，也是學者關注最多的因子，具有高度的保守結構。研究認為SerPinA1在細胞外基質的降解(調節(jié)MMPs)、炎性因子的釋放和細胞的轉換中起著關鍵作用[6-7]。SerPinA1主要在肝細胞內合成，其在肝細胞中表達較高，具有急性時相蛋白的作用，但是在人體其它正常上皮成份中表達極少[8]。研究顯示在惡性轉變的上皮細胞中SerPinA1的表達可以升高[9-12]。SerPinA1高表達可以增加腫瘤細胞的增殖、出芽，抑制腫瘤細胞的凋亡，增強腫瘤細胞的遷移[13-15]。SerPinA1通過保守機制抑制靶酶，SerPinA1可作為“捕鼠器”的作用，其中的蛋白酶是“小鼠”，當?shù)鞍酌缸R別誘導因子后形成可逆的復合物，形成對凋亡的抑制作用[11]。

本研究結果顯示乳腺浸潤性導管癌中SerPinA1的表達明顯高于對照組，提示SerPinA1在腫瘤性病變時分泌增加，參與腫瘤的形成。結果顯示腫瘤中SerPinA1的表達在不同腫瘤最大徑、淋巴結轉移、脈管癌栓及組織學分級的表達中差異有統(tǒng)計學意義，提示SerPinA1參與腫瘤的生長和細胞增殖，對腫瘤的局部侵襲和直接蔓延有重要的促進作用。SerPinA1在正常乳腺上皮細胞中表達極低，但在上皮細胞惡變過程中SerPinA1的表達明顯升高，可能與腫瘤微環(huán)境中的低氧和低pH值有關，這些因素均能誘導腫瘤細胞分泌更多的SerPinA1。SerPinA1高表達能促進腫瘤細胞的增殖作用，并能使腫瘤細胞逃避化療藥物的影響，使腫瘤細胞具有旺熾性增殖的特征，腫瘤細胞增殖加速，腫瘤生長加速[16]。也有觀點顯示SerPinA1通過磷酸化調節(jié)細胞周期蛋白D1(CyclinD1)與CyclinD3的活性，使細胞處于高度活躍狀態(tài)[17-19]。SerPinA1能促進染色體的重塑，也是其調節(jié)腫瘤形成的重要因素之一。SerPinA1對MMPs的調節(jié)可能是對轉移調控的重要途徑，SerPinA1高表達可以引起基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9的分泌，使細胞外基質和基底膜有效降解，為轉移提供必要的條件[20]。研究顯示SerPinA1的表達與HER-2表達密切相關，提示SerPinA1可能與基于HER-2為靶點的治療有關。相關分析顯示SerPinA1與Ki67指數(shù)呈正相關性，證實了SerPinA1對腫瘤細胞繁殖及腫瘤生長的促進作用。本實驗觀察到SerPinA1的表達與生存時間相關，提示檢測SerPinA1的表達可能對判斷預后有一定價值，即SerPinA1高表達的患者預后差，但是SerPinA1作為預后因子尚需要進行大樣本、多因素及多中心的分析后進一步證實。

綜上所述，SerPinA1在乳腺浸潤性導管癌組織中表達升高，與腫瘤的形成和進展有關。術后檢測SerPinA1的表達對判斷預后有一定價值。