miR-542-3p對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞增殖和遷移的影響及機(jī)制研究

石曉嵐，趙 龍，王 寧，劉翠翠，王 靜，馬彩鈴

(西安市兒童醫(yī)院呼吸哮喘中心，陜西 西安710002)

我國(guó)哮喘患者大約在3000萬(wàn)，且一半以上的哮喘患者在兒童期發(fā)病[1]。兒童哮喘如未得到及時(shí)治療，可能會(huì)出現(xiàn)喘息、咳嗽等癥狀，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量，甚至威脅其生命。因此，闡明哮喘的發(fā)病機(jī)制，開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。近年來(lái)，非編碼RNA的作用已成為一個(gè)重要的研究領(lǐng)域，其中，微小核醣核酸(microRNAs，miRNAs)通過(guò)結(jié)合保守的種子序列來(lái)靶向信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種不同的疾病，如哮喘、肺病和癌癥[2-6]。據(jù)報(bào)道，miR-542-3p的過(guò)表達(dá)能抑制反式-7,8-二羥-9,10-環(huán)氧苯并芘[anti-benzo(a)pyrene-7,8-diol-9,10-epoxide，anti-BPDE]誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞16HBE-T的增殖和遷移[7]。但miR-542-3p在兒童哮喘中的作用及分子機(jī)制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)miR-542-3p通過(guò)IL-33/sST2信號(hào)通路來(lái)抑制脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)處理的BEAS-2B細(xì)胞的增殖和遷移，為研究治療兒童哮喘的新方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 MEM培養(yǎng)基(Gibco公司，美國(guó))；脂質(zhì)體RNAiMAX(Invitrogen，美國(guó))；Trizol試劑(Invitrogen，美國(guó))；TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara Bio，日本)；microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems，美國(guó))；SYBR Fast qPCR Mix(Takara Bio，日本)；內(nèi)參U6(廣州銳博生物科技公司)；酶活性測(cè)定試劑盒(Promega公司，美國(guó))；CCK8(同仁公司，日本)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒P0012A(上海碧云天公司)；5920R低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司，德國(guó))；酶標(biāo)儀(TZCAN公司，奧地利)。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：將人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B培養(yǎng)在含10%(V/V)胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，置于含5%CO2(V/V)的37 ℃培養(yǎng)箱中。LPS(0.1、1、10、100 μg/ml)處理BEAS-2B細(xì)胞24 h構(gòu)建哮喘模型。等體積DMSD處理BEAS-2B細(xì)胞作為未處理組(Untreated)。將密度為2×105的BEAS-2B細(xì)胞接種至6孔板上，待細(xì)胞融合度為80%時(shí)，用脂質(zhì)體RNAiMAX轉(zhuǎn)染mimic NC、inhibitor NC、miR-542-3p+pcDNA3.1至BEAS-2B作為空載組。轉(zhuǎn)染miR-542-3p mimic(miR-542-3p)、miR-542-3p-inhibitor，miR-542-3p+pcDNA3.1-IL-33至BEAS-2B作為實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測(cè)miR-542-3p、白細(xì)胞介素33(IL-33)、可溶性生長(zhǎng)刺激表達(dá)基因2蛋白(sST2)mRNA的表達(dá)：Trizol試劑提取總RNA，TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒或microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照SYBR Fast qPCR Mix試劑盒的說(shuō)明對(duì)LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B中的miR-542-3p、IL-33、sST2進(jìn)行PCR定量檢測(cè)，所需引物由Premier 6.0設(shè)計(jì)，并由北京擎科新業(yè)生物合成。以U6為miR-542-3p內(nèi)參，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為IL-33和sST2內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算其mRNA表達(dá)量。

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-542-3p和IL-33的靶向關(guān)系：利用生物信息學(xué)分析網(wǎng)站microRNA.org(http://www.microrna.org/microrna/getMirnaForm.do)預(yù)測(cè)IL-33上游的miRNA，并利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對(duì)基因進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)酶活性測(cè)定試劑盒的說(shuō)明，用PBS洗滌96孔板，然后向每個(gè)孔中加入100 μl的磷脂溶液，低速振蕩15 min后收集細(xì)胞裂解緩沖液。取20 μl細(xì)胞裂解100 μl熒光素酶檢測(cè)試劑II混合，用光度計(jì)測(cè)定熒光素酶活性值。然后加入100 μl的1×Stop & Glo溶液，均勻混合，測(cè)定海腎熒光素酶的活性值，報(bào)告基因的表達(dá)量是螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的比值。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力:將mimic NC、miR-542-3p、miR-542-3p+pcDNA3.1、miR-542-3p+pcDNA3.1-IL-33組細(xì)胞分別接種在96孔板，采用CCK8法分析細(xì)胞增殖情況。孵育24、48、72、96 h后，每孔加入10 μl CCK8溶液。再孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的OD值，每組重復(fù)3次。

1.2.5 劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力:將mimicNC、miR-542-3p、miR-542-3p+pcDNA3.1，miR-542-3p+pcDNA3.1-IL-33組細(xì)胞分別接種在96孔板，采用劃痕法分析細(xì)胞遷移能力。轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞接種至6孔板中孵育(5×104個(gè)細(xì)胞/孔)。待細(xì)胞融合至90%～95%后，用無(wú)菌塑料微管尖端刮除單層細(xì)胞，孵育24 h。幾次清洗后，用X71倒置顯微鏡觀察傷口愈合情況并拍照(奧林巴斯公司)。

1.2.6 免疫印跡分析檢測(cè)蛋白表達(dá):將轉(zhuǎn)染成功mimic NC、miR-542-3p、inhibitor NC、miR-542-3p inhibitor的細(xì)胞在冰裂解液中裂解30 min，4 ℃ 12000 r/min離心10 min，提取蛋白質(zhì)。用10%(W/V)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白質(zhì)溶解，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。于Tris緩沖鹽水中，用5% (W/V)脫脂牛奶封閉PVDF膜，并與一抗(1∶1000)于4 ℃過(guò)夜孵育。用TBST清洗3次，每次5 min，然后用辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的二級(jí)抗兔抗體檢測(cè)細(xì)胞膜，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)條帶進(jìn)行可視化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，單因素方差分析(AVONA)進(jìn)行多組間比較，LSD法進(jìn)行兩兩比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-542-3p在LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B中的表達(dá) 用濃度為0.1、1、10和100 μg/ml的LPS分別處理BEAS-2B細(xì)胞24 h后檢驗(yàn)細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)BEAS-2B細(xì)胞活性隨著LPS濃度的增加呈遞減趨勢(shì)。因?yàn)锽EAS-2B細(xì)胞活性在1 μg/ml LPS處理下活性顯著下降，因此選用1 μg/ml LPS處理BEAS-2B細(xì)胞24 h構(gòu)建哮喘細(xì)胞模型(圖1A)。RT-PCR分析結(jié)果顯示，LPS處理抑制miR-542-3p在BEAS-2B中的表達(dá)(圖1B)。

注：與未處理組比較,*P<0.05

2.2 miR-542-3p對(duì)LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B增殖和遷移的影響 分別將mimic NC，miR-542-3p轉(zhuǎn)染至BEAS-2B，并進(jìn)行1 μg/ml LPS處理24 h。miR-542-3p顯著增加miR-542-3p表達(dá)，miR-542-3p inhibitor顯著抑制miR-542-3p表達(dá)，證明轉(zhuǎn)染成功(圖2A)。CCK-8和劃痕實(shí)驗(yàn)分析顯示，過(guò)表達(dá)miR-542-3p可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞增殖和遷移，而miR-542-3p inhibitor顯著促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞的增殖和遷移(圖2B、C)。

2.3 miR-542-3p與IL-33的相互關(guān)系 qRT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)1 μg/ml LPS處理24 h，BEAS-2B細(xì)胞中的IL-33和sST2的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(圖3A)。利用在線網(wǎng)站microRNA.org預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-542-3p具有與IL-33結(jié)合的位點(diǎn)(圖3B)。我們將含有miR-542-3p預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)或突變位點(diǎn)的IL-33-3’-UTR區(qū)域構(gòu)建至熒光素酶載體中，結(jié)果顯示miR-542-3p顯著抑制野生型熒光素的酶活性，但不影響突變型熒光素的酶活性(圖3C)。對(duì)miR-542-3p與IL-33進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示在LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞中，miR-542-3p與IL-33表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖3D)。免疫印跡分析和RT-PCR結(jié)果顯示，miR-542-3p可顯著降低IL-33的mRNA及蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量(圖3E、F)。

2.4 miR-542-3p/IL-33/sST2對(duì)LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B增殖和遷移的影響 分別將mimic NC、miR-542-3p、miR-542-3p+pcDNA3.1、miR-542-3p+pcDNA3.1-IL-33轉(zhuǎn)染至BEAS-2B，1 μg/ml LPS處理24 h后，檢測(cè)BEAS-2B細(xì)胞的增殖和遷移水平。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)IL-33可顯著提高miR-542-3p抑制的BEAS-2B細(xì)胞的增殖和遷移能力(圖4)。

3 討 論

哮喘是由多種炎性介質(zhì)或細(xì)胞因子導(dǎo)致的氣道高反應(yīng)慢性炎癥，不僅會(huì)引起慢性炎癥相關(guān)反應(yīng)，還會(huì)出現(xiàn)咳嗽、鼻塞、胸悶等氣道高敏性反應(yīng)，若病情加重，甚至?xí)斐刹豢赡娴臍獾廓M窄和氣道重建[8]。根據(jù)第三次中國(guó)城市兒童哮喘流行病學(xué)調(diào)查，我國(guó)兒童的哮喘患病率正以每十年50%的幅度增加。但患兒的較差配合度和國(guó)內(nèi)目前有限的診斷治療技術(shù)使很多哮喘患兒沒(méi)有及時(shí)接受正確有效的診療。因此對(duì)哮喘病理的研究和尋找治療兒童哮喘的靶標(biāo)分子非常重要。

miRNAs在各種體液(血液、尿液、痰、呼氣冷凝液、血清和血漿)中非常穩(wěn)定，因此對(duì)哮喘中miRNA功能的研究可能會(huì)使我們找到更多治療兒童哮喘的方法[9-10]。miR-542-3p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞[11]、肝細(xì)胞癌細(xì)胞[12]、卵巢癌細(xì)胞[13]中表達(dá)均下調(diào)。本研究通過(guò)對(duì)BEAS-2B進(jìn)行LPS處理，發(fā)現(xiàn)miR-542-3p在哮喘細(xì)胞模型中的表達(dá)顯著低于正常細(xì)胞。miR-542-3p抑制anti-BPDE誘導(dǎo)的16HBE-T細(xì)胞的增殖和遷移水平[14]。Liu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)控FTSJ2，miR-542-3p可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移。王躍等[15]在多種人胃癌細(xì)胞和胃腺癌組織中均發(fā)現(xiàn)miR-542-3p呈低表達(dá)狀態(tài)，且miR-542-3p可抑制胃腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。本研究發(fā)現(xiàn)miR-542-3p抑制LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B的增殖和遷移，與已有文獻(xiàn)中的研究結(jié)果相符。

注：與mimic NC組比較，*P<0.05；與miR542-3p+pcDNA3.1-IL-33組比較，#P<0.05

IL-33(也稱為IL-1F11或NF-HEV)是2005年新發(fā)現(xiàn)的哮喘啟動(dòng)因子，具有潛在的診斷及治療價(jià)值[16]。IL-33通常與其特異性受體ST2結(jié)合形成復(fù)合物來(lái)發(fā)揮作用。在哮喘發(fā)展過(guò)程中，IL-33/ST2通過(guò)激活Th2型免疫反應(yīng)，進(jìn)而誘發(fā)哮喘等過(guò)敏性疾病的發(fā)生[17]。研究顯示，重度支氣管哮喘病人的支氣管肺泡灌洗液中的IL-33、sST2的水平顯著高于輕度支氣管哮喘患者[18-19]，阻斷IL-33/sST2信號(hào)通路可緩解過(guò)敏性哮喘。本研究發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞中，IL-33和sST2均顯著高于未處理組，且miR-542-3p與IL-33表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。IL-33的過(guò)表達(dá)會(huì)減弱miR-542-3p對(duì)LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞的增殖和遷移能力抑制作用，表明miR-542-3p可能通過(guò)靶向IL-33/sST2抑制LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞的增殖和遷移。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-542-3p在LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，并且通過(guò)靶向IL-33/sST2來(lái)抑制LPS誘導(dǎo)的BEAS-2B的增殖和遷移，表明miR-542-3p可能將成為新的兒童哮喘治療靶點(diǎn)。