甲狀腺激素受體β基因?qū)Ζ碌矸蹣拥鞍?2誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥和細(xì)胞凋亡作用機(jī)制

康 濤,朱利娟,曹冰清,薛延莉,楊 謙

(1.陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安710068；2陜西省人民醫(yī)院麻醉科，陜西 西安710068)

阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。臨床上AD的特點(diǎn)是大量的淀粉樣蛋白刺激神經(jīng)元和突觸，誘發(fā)神經(jīng)炎癥，最終導(dǎo)致記憶喪失。β淀粉樣蛋白(Amyloid-β，Aβ)在大腦中的大量積累被認(rèn)為是AD發(fā)展的重要標(biāo)志，Aβ沉積在AD的發(fā)病機(jī)制中起著決定性的作用[2]，靶向Aβ斑塊的示蹤劑已被用于影像學(xué)臨床應(yīng)用及研究[3]。

甲狀腺激素受體β基因(Thrb)對(duì)神經(jīng)發(fā)育起著重要的調(diào)控作用。同時(shí)，Thrb在聽(tīng)覺(jué)和視覺(jué)功能中起著重要作用，是影響脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵介質(zhì)[4]。目前，關(guān)于Thrb對(duì)AD作用的研究報(bào)道較少，因此有必要對(duì)其在AD中的作用及作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探究。

Sirt3(Sirtuin 3)是哺乳動(dòng)物Sirtuin家族的成員，是一種依賴(lài)于NAD的組蛋白去乙?；福饕嬖谟诰€(xiàn)粒體中[5-6]。有報(bào)道稱(chēng)，Sirt3通過(guò)調(diào)節(jié)靶蛋白(包括能量代謝介質(zhì)和線(xiàn)粒體氧化還原應(yīng)激蛋白)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)[7]。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)Sirt3在Aβ誘導(dǎo)的AD中起著重要作用[8]。Salvatori等[9]報(bào)道稱(chēng)，Sirt3的降低與AD患者的線(xiàn)粒體功能障礙有關(guān)，Sirt3的表達(dá)隨著AD的進(jìn)展而降低。本試驗(yàn)旨在探究Thrb對(duì)Aβ42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的作用以及作用機(jī)制，從而為臨床上老年癡呆癥的治療提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 小膠質(zhì)細(xì)胞BV2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative Real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；兔抗鼠Thrb、兔抗鼠caspase-3、兔抗鼠caspase-9、兔抗鼠Sirt3、兔抗鼠FOX3a和鼠抗GAPDH購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PCR引物、pcDNA3.1-Thrb、si-Sirt3和si-FOX3a由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計(jì)、合成；二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司；PCR儀和iMark酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：小膠質(zhì)細(xì)胞BV2用含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：pcDNA3.1-Thrb以及si-Sirt3和si-FOX3均由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計(jì)、合成。根據(jù)Thrb的序列，設(shè)計(jì)合成PCR引物，擴(kuò)增Thrb基因全長(zhǎng)，連接于線(xiàn)性化的過(guò)表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上，形成可表達(dá)Thrb的同源重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-Thrb)。將細(xì)胞分為未處理組(Untreated)、空白對(duì)照組(Control)、陰性對(duì)照組(pcDNA3.1)、Thrb過(guò)表達(dá)組(pcDNA3.1-Thrb)及si-Sirt3和si-FOX3a。按照Lipofectamine 3000?說(shuō)明書(shū)將pcDNA3.1-Thrb及si-Sirt3和si-FOX3a按照以上分組轉(zhuǎn)染至BV2細(xì)胞中，置于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。孵育48 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 細(xì)胞增殖:將BV2細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；向培養(yǎng)板中加入不同濃度(5、10、20、40、80、160 μg/ml)的WST-8，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h；每孔加入20 μl CCK溶液，孵育24 h；酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的OD值。

1.2.4 細(xì)胞凋亡率的測(cè)定:對(duì)于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，收獲轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Thrb和對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1 48 h后的細(xì)胞，離心，并重懸于結(jié)合緩沖液中。然后，異硫氰酸熒光素(FITC)和PE-Texas Red溶液連續(xù)染色細(xì)胞，使用FACSCalibur TM流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.5 炎癥因子的測(cè)定:按照相應(yīng)的ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)BV2細(xì)胞中的一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的濃度。具體操作如下：準(zhǔn)備試劑、樣品；加入準(zhǔn)備好的樣品，37 ℃孵育30 min；洗板5次，加入酶標(biāo)試劑，37 ℃孵育30 min；洗板5次，加入顯色液A、B，37 ℃顯色10 min；加入終止液，讀OD值。

1.2.6 活性氧(ROS)的測(cè)定：將BV2細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；收集細(xì)胞，在37 ℃下用活性氧指示劑DCFH-DA(10 μmd/L)在PBS中培養(yǎng)30 min。使用流式細(xì)胞儀(BD Biosciences，CA)分析熒光。

1.2.7 RT-PCR:將BV2細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于12孔板，培養(yǎng)24 h后吸去上清液，收集細(xì)胞， Trizol法提取胃癌細(xì)胞株總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT-PCR檢測(cè)Thrb基因的mRNA表達(dá)。引物序列如下，Thrb正向序列：5’-ACGTAACGCTACTGGGACGTT-3’，反向序列：5’-AGTTAGGACGTATACGACAGG-3’；β-actin正向序列：5’-CTCACCATGGATGATGATATCGC-3’，反向序列：5’-AGGAATCCTTCTGACCACTGC-3’。以2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。β-actin為內(nèi)參。

1.2.8 Western blot:消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BV2細(xì)胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。48 h后收集各組細(xì)胞，收集細(xì)胞上清液，并消化下貼壁細(xì)胞，加RIPA裂解液于冰上裂解10 min，4 ℃、12000 r/min離心30 min(離心半徑9.5 cm)。上清液用BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白含量后，取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，130 V恒壓電泳2 h；濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；室溫下以含5%脫脂奶粉的Tris緩沖液粉筆PVDF膜1 h，裁剪后分別與一抗孵育，4 ℃過(guò)夜；TBST清洗膜8 min，重復(fù)4次，加相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h；TBST重復(fù)清洗膜4次，ECL試劑盒檢測(cè)蛋白表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1 Aβ42顯著抑制Thrb表達(dá)且具有劑量依賴(lài)性 RT-PCR和Western blot檢測(cè)BV2細(xì)胞經(jīng)不同濃度(50、100 ng/ml)的Aβ42誘導(dǎo)后Thrb的表達(dá)量。結(jié)果顯示，BV2經(jīng)Aβ42誘導(dǎo)后Thrb的mRNA和蛋白的表達(dá)量均顯著降低，且呈劑量依賴(lài)性(均P<0.05，圖1A﹑B)。

A：Thrb在Aβ42誘導(dǎo)后的BV2細(xì)胞中的mRNA表達(dá)量；B：Thrb在Aβ42誘導(dǎo)后的BV2細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量。

2.2 過(guò)表達(dá)Thrb緩解Aβ42誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞BV2的細(xì)胞凋亡 為了驗(yàn)證Thrb在小膠質(zhì)細(xì)胞BV2中的功能，我們?cè)贐V2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Thrb和對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1，后經(jīng)濃度為100 ng/ml的Aβ42處理。經(jīng)Aβ42處理后，細(xì)胞活力顯著降低，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Thrb則顯著提高細(xì)胞活力(均P<0.05，圖2A)；與Control組相比，pcDNA3.1-Thrb顯著降低細(xì)胞凋亡率(P<0.05，圖2B)；同樣的，pcDNA3.1-Thrb抑制了caspase-3和caspase-9的表達(dá)量(均P<0.05，圖2C)。由此說(shuō)明過(guò)表達(dá)Thrb緩解了Aβ42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞BV2的細(xì)胞凋亡。

A：過(guò)表達(dá)Thrb對(duì)細(xì)胞活力的影響；B：過(guò)表達(dá)Thrb對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；C：過(guò)表達(dá)Thrb對(duì)caspase-3和caspase-9表達(dá)量的影響。與 Untreated組比較，*P<0.05；與Control組比較，#P<0.05

2.3 過(guò)表達(dá)Thrb緩解Aβ42誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞BV2的炎癥和氧化應(yīng)激 如圖3所示，細(xì)胞經(jīng)Aβ42處理后，促炎因子IL-6、TNF-α和NO的水平均顯著升高，而pcDNA3.1-Thrb則顯著降低上述促炎因子的水平(均P<0.05，圖3A-C)；此外，與Control組相比，pcDNA3.1-Thrb顯著降低細(xì)胞中ROS的含量(P<0.05，圖3D)；pcDNA3.1-Thrb提高了細(xì)胞中NAD+和ATP的水平(均P<0.05，圖3E、F)。由此說(shuō)明過(guò)表達(dá)Thrb緩解了Aβ42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞BV2的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。

2.4 過(guò)表達(dá)Thrb促進(jìn)Sirt3和FOX3a表達(dá)及sh-Thrb抑制Sirt3和FOX3a的表達(dá) 如圖4所示，過(guò)表達(dá)Thrb顯著促進(jìn)Sirt3和FOX3a的表達(dá)(均P<0.05，圖4A)；與此相反，當(dāng)干擾Thrb的表達(dá)時(shí)，Sirt3和FOX3a的表達(dá)量均顯著降低(P<0.05，圖4B)；此外，細(xì)胞經(jīng)Aβ42誘導(dǎo)后Sirt3和FOX3a的蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05，圖4C)。

2.5 Sirt3/FOX3a參與Thrb對(duì)Aβ42誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制 為了進(jìn)一步探究Thrb對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞BV2作用的分子機(jī)制，我們?cè)贐V2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染sh-Sirt3或sh-FOX3a或pcDNA3.1-Thrb，檢測(cè)不同處理組細(xì)胞中細(xì)胞凋亡和炎癥因子以及ROS的含量。結(jié)果顯示，sh-Sirt3或sh-FOX3a均顯著抑制細(xì)胞活力(P<0.05，圖5A)；此外，sh-Sirt3或sh-FOX3a均促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P<0.05，圖5B)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，sh-Sirt3或sh-FOX3a顯著提高了細(xì)胞中IL-6的水平(均P<0.05，圖5C)；pcDNA3.1-Thrb降低了細(xì)胞中自由ROS的含量。然而sh-Sirt3或sh-FOX3a提高了細(xì)胞中ROS的水平，逆轉(zhuǎn)了pcDNA3.1-Thrb的抑制作用(均P<0.05，圖5D)。以上結(jié)果說(shuō)明Sirt3/FOX3a參與了Thrb對(duì)Aβ42誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制。

A：過(guò)表達(dá)Thrb對(duì)細(xì)胞中IL-6水平的影響；B：過(guò)表達(dá)Thrb對(duì)細(xì)胞中TNF-α水平的影響；C：過(guò)表達(dá)Thrb對(duì)細(xì)胞中NO水平的影響；D：過(guò)表達(dá)Thrb對(duì)細(xì)胞中ROS含量的影響；E：過(guò)表達(dá)Thrb對(duì)細(xì)胞中ATP水平的影響；F：過(guò)表達(dá)Thrb對(duì)細(xì)胞中NAD+水平的影響。與Untreated組比較，*P<0.05；與Control組比較，#P<0.05

A：過(guò)表達(dá)Thrb對(duì)Sirt3和FOX3a的表達(dá)量的影響；B：sh-Thrb對(duì)Sirt3和FOX3a表達(dá)量的影響；C：Aβ42誘導(dǎo)對(duì)Sirt3和FOX3a表達(dá)量的影響。與Control或Untreated組比較，*P<0.05；與pcDNA3.1或sh-RNA或50 ng/ml組比較，#P<0.05

3 討 論

AD是最常見(jiàn)的老年病之一，占70歲以上老年癡呆發(fā)病率的60%～70%[10]。Aβ在腦內(nèi)的積聚被認(rèn)為是AD發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要事件[11]。Aβ是一種含有39～43個(gè)氨基酸的多肽，由分泌酶水解β淀粉樣前體蛋白產(chǎn)生，最常見(jiàn)的亞型是Aβ40和Aβ42[12]。Aβ42毒性更強(qiáng)，易于聚集并引起神經(jīng)毒性[13]。Aβ42的神經(jīng)毒性作用在AD的進(jìn)展中起重要作用[14]。據(jù)報(bào)道，大鼠或猴大腦皮質(zhì)注射Aβ42后，注射部位出現(xiàn)組織壞死、外周神經(jīng)細(xì)胞丟失、角蛋白增生，且與劑量呈顯著相關(guān)性[15]。

Thrb在組織分化、生長(zhǎng)發(fā)育、保持代謝平衡及調(diào)節(jié)甲狀腺激素作用等方面具有重要作用[16]。此外，Thrb對(duì)神經(jīng)發(fā)育起著重要的調(diào)控作用，是影響脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)鍵介質(zhì)[17]。Ng等[18]研究發(fā)現(xiàn)Thrb的缺失引起小鼠和人的耳聾和甲亢，并導(dǎo)致甲狀腺激素抵抗綜合征，提示Thrb與神經(jīng)系統(tǒng)和感覺(jué)系統(tǒng)密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，Thrb可減輕Aβ42誘導(dǎo)的BV2功能障礙。有趣的是，Thrb能夠直接與Sirt3結(jié)合，通過(guò)調(diào)節(jié)Sirt3的表達(dá)來(lái)減輕AD的癥狀。

A：sh-Sirt3或sh-FOX3a對(duì)細(xì)胞活力的影響；B：sh-Sirt3或sh-FOX3a對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；C：sh-Sirt3或sh-FOX3a對(duì)細(xì)胞中IL-6水平的影響；D：sh-Sirt3或sh-FOX3a對(duì)細(xì)胞中ROS含量的影響。與未處理組比較，*P<0.05；與pcDNA3.1-Thrb組比較，#P<0.05；與pcDNA3.1-Thrb+sh-RNA組比較，$P<0.05

Sirt3主要定位于線(xiàn)粒體，參與多種生物學(xué)過(guò)程[19]。此外，Sirt3增強(qiáng)線(xiàn)粒體抗氧化谷胱甘肽的表達(dá)，減緩動(dòng)物衰老[20]。眾所周知，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體功能障礙是AD早期最重要的特征，包括線(xiàn)粒體呼吸酶活性降低、代謝功能障礙等[21-22]。Li等[23]發(fā)現(xiàn)在原代海馬神經(jīng)元和AβO處理的動(dòng)物模型中，HKL可以通過(guò)增強(qiáng)Sirt3的活性來(lái)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體功能，包括增加三磷酸腺苷水平和減少活性氧的產(chǎn)生。先前的研究報(bào)道，Sirt3廣泛參與調(diào)節(jié)阿爾茨海默病，并在其發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[24]。Salvatori等[9]報(bào)道稱(chēng)，Sirt3的降低與AD患者的線(xiàn)粒體功能障礙有關(guān)，Sirt3的表達(dá)隨著AD的進(jìn)展而降低。

在本研究發(fā)現(xiàn)，Aβ42顯著抑制Thrb表達(dá)且具有劑量依賴(lài)性；過(guò)表達(dá)Thrb顯著降低Aβ42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞BV2的細(xì)胞凋亡率和炎癥因子的水平，并顯著緩解Aβ42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞BV2的氧化應(yīng)激；進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，Thrb顯著促進(jìn)Sirt3和FOX3a的表達(dá)且Sirt3/FOX3a參與了Thrb對(duì)Aβ42誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制。由以上結(jié)果說(shuō)明Thrb能夠緩解小膠質(zhì)細(xì)胞BV2氧化應(yīng)激和凋亡，降低細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)控Sirt3/FOX3a信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究證明Thrb顯著降低Aβ42誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞BV2的細(xì)胞凋亡率，并顯著緩解細(xì)胞氧化應(yīng)激，其作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)控Sirt3/FOX3a信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這一結(jié)果能夠?yàn)榘柶澓ＤY的臨床治療和診斷提供分子基礎(chǔ)。