益心泰有效組分對擴張型心肌病心力衰竭兔心肌組織CaN、SERCA2a mRNA及蛋白表達水平的影響研究

李雅，魏佳明，李玉瑩，郭志華

隨著社會節(jié)奏加快和人口老齡化的加劇，心力衰竭在世界范圍造成的威脅日趨嚴重［1］。擴張型心肌?。╠ilated cardiomyopathy，DCM）是心力衰竭形成的主要原因之一［2］。研究顯示，鈣調神經磷酸酶（calcineurin，CaN）與擴張型心肌病心力衰竭形成機制密切相關［3-4］。CaN受心肌細胞［Ca2+］i濃度調節(jié)，而肌漿網鈣泵（sarcoplasmic reticulum Ca2+ATPase 2a，SERCA2a） 作為鈣轉運的關鍵酶，可以影響心肌細胞［Ca2+］i濃度。益心泰為臨床科研方，由黃芪、紅花、丹參、澤瀉、豬苓等藥伍用而成，功在益氣活血利水。前期研究表明，益心泰具有較好的抗心力衰竭作用［5-6］，其能改善氣促、疲倦、乏力、納呆等臨床癥狀，提高生活質量，且安全、有效，但其機制尚待進一步明確。中藥復方有效組分效應機制研究是當前一大熱點，有助于揭開復方有效的神秘面紗，更好地發(fā)揮中醫(yī)藥治療慢性疾病的優(yōu)勢作用［7］。本研究擬采用兔擴張型心肌病心力衰竭模型為研究對象，觀察益心泰有效組分（effective components of Yixintai，ECYXT）干預后的兔心肌組織形態(tài)學，血清心鈉肽（ANP）、腦鈉肽（BNP）水平，左心室射血分數(shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）和E峰與A峰的比值（E/A比值）等心功能情況，心肌細胞［Ca2+］i濃度，以及心肌組織CaN、SERCA2a mRNA及蛋白表達水平等的變化，深入研究ECYXT對兔擴張型心肌病心力衰竭模型的作用機制，為中醫(yī)藥防治擴張型心肌病心力衰竭提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2018年1月，選取120只健康新西蘭兔，普通級，重1.5～2.0 kg。于湖南太平生物科技有限公司購入，動物許可證編號：SCXK（湘）2015-0004，合格證號：NO.43608300000615，不限制食水，通風，室溫約23 ℃，濕度50%～60%，正常光/暗周期，分籠飼養(yǎng)。本研究經湖南中醫(yī)藥大學動物實驗倫理審查委員會批準（批準號：LL2018010801）。

1.2 實驗藥物 ECYXT：黃芪、丹參、紅花、豬苓、澤瀉等購于湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，按照3.0∶1.0∶1.5∶1.0∶1.0進行配比，采用系統(tǒng)溶劑法與大孔樹脂吸附法相結合，對益心泰復方中四個不同極性部位的藥效組分進行分離，根據(jù)最佳工藝條件，分離得到ECYXT提取液，冷凍干燥后獲得提取物（含總皂苷372.4 mg/g、總黃酮98.3 mg/g、總多糖445.8 mg/g）；氯沙坦鉀：50 mg/片（杭州默沙東制藥有限公司，H20000371）；丙基硫氧嘧啶：50 mg/片（蘇州東瑞制藥有限公司，H32020795）；烏拉坦（Sigma，94300）；0.9%氯化鈉溶液：500 ml/瓶（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，H51021158）。

1.3 實驗試劑與儀器 多聚甲醛（Sigma，16005）；蘇木精（Sigma，H9627）；伊紅（Sigma，E4009）；石蠟（河南天孚化工有限公司）；ANP ELISA檢測試劑盒（江萊生物，貨號：JL22215）；BNP ELISA檢測試劑盒（eBioscience，貨號：XY-1900）；CaN抗體（Abcam，貨 號：ab3673）；SERCA2a抗 體（Abcam， 貨 號：ab2861）；GAPDH抗體（Abcam，貨號：ab181602）；RIPA裂解液（北京索萊寶生物科技有限公司）；甲基磺 酰 氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）（ 北京索萊寶生物科技有限公司）；BSA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；反轉錄試劑盒（Takara，貨號：RR047A）；Trizol（Invitrogen，貨號：15596-026）；SYBR Premix EX Taq TM Ⅱ（Takara，貨號：DRR820A）；超聲心動圖機（西門子公司，貨號：Sequoia 512）；FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡（OLYMPUS公司）；鈣熒光探針Fluo3/AM（碧云天， 貨 號：S1056）；Pluronic-F127（Sigma， 貨 號：P2443）；DYY-7C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；SYSTEM GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；iQ5實時熒光定量 PCR儀（Bio-Rad公司）。

1.4 動物分組及模型制備 參考文獻［5，8］，以阿霉素耳緣靜脈注射+丙基硫氧嘧啶灌胃復制兔擴張型心肌病心力衰竭模型。根據(jù)隨機數(shù)字表法，將20只實驗兔作正常對照組，其余100只進行造模處理。固定兔于手術臺，模型兔予以丙基硫氧嘧啶灌胃，劑量按兔每日進食量的0.2%，1次/d；并分別于每周三、周日下午耳緣靜脈注射阿霉素溶液1 mg/kg，濃度為1 mg/ml。正常對照組予以等次等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃及耳緣靜脈注射。連續(xù)造模8周。造模后第1天，行心臟超聲檢測顯示模型兔LVEF、LVFS、E/A比值較正常對照組顯著下降，伴有精神萎靡、水腫、抓起反抗下降、心率和呼吸頻率加快、耳溫降低及尿量減少等心力衰竭表現(xiàn)，提示造模成功。造模過程中，模型兔共死亡16只，均死于腹瀉。將造模成功的模型兔按完全隨機設計方法分為心力衰竭模型組（17只）、ECYXT低劑量組（17只）、ECYXT中劑量組（17只）、ECYXT高劑量組（17只）和氯沙坦鉀組（16只）。

1.5 干預方法 于造模后第1周開始灌胃，根據(jù)成人體表面積換算法，結合臨床用藥經驗和既往實驗研究，確定ECYXT低、中、高劑量組濃度分別為2.1 g/kg、4.2 g/kg、8.4 g/kg（相當于臨床劑量的2、4、8倍），給藥前予以蒸餾水稀釋后灌胃。氯沙坦鉀組（制成氯沙坦鉀懸液）2.75 mg/kg，正常對照組與心力衰竭模型組灌服同等容積的蒸餾水。6組灌胃量均為每次10 ml/kg，1次/d，連續(xù)4周。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 一般情況 觀察兔毛色、精神狀態(tài)、心率、呼吸頻率、耳溫、尿量、水腫等一般情況。

1.6.2 血清ANP、BNP水平檢測 采用ELISA法檢測血清ANP、BNP水平。麻醉兔，心臟采血，靜置，離心，稀釋，過夜，洗滌。加入待測血清樣品，反復孵育，洗滌，最后每孔加入0.05 ml 2M H2SO4，終止反應。使用酶標儀檢測450 nm處的光密度（OD）值并記錄。

1.6.3 心臟超聲檢測 麻醉滿意后將兔平臥位固定，運用西門子Sequoia 512超聲心動圖機，探頭頻率3～8 MHz，取心前區(qū)左心室長軸最大直徑處，M型超聲標記室間隔和左心室后壁收縮末與舒張末期心內膜位置，隨機軟件自動計算兔LVEF、LVFS及E/A比值等指標，取5個心動周期讀數(shù)平均值。

法國的成人教育有悠久的歷史。法國成人教育的創(chuàng)始人是法國著名哲學家、政治家和數(shù)學家孔多塞（Condorcet）。早在1792年4月法國大革命期間，孔多塞作為共和黨人，向憲法事務委員會提出永久教育意義上的公共教育?？锥嗳J為，所有人應享有普及、平等和永久教育的權利，同時，永久教育也必須被視為每個公民對社會的責任［1］。孔多塞的教育思想奠定了法國成人教育的基本理念之一——通過傳遞全面的知識體系，使成人能夠獲得正規(guī)的教育資格，從而成為專業(yè)人士［2］。

1.6.4 心肌組織形態(tài)學檢查 4%多聚甲醛固定組織，脫水，透明，浸蠟，包埋，切片（厚4～5 μm），烤片，HE染色，光鏡觀察并采圖。

1.6.5 心肌細胞［Ca2+］i濃度 采用熒光負載法測定。酶解法分離心肌細胞，2 000 rmp/min離心10 min后，棄上清液，細胞沉淀重懸于Joklik培養(yǎng)基，并放入培養(yǎng)瓶中，清洗細胞3次以無菌D'-Hanks液，添加Fluo3/AM（終濃度4 μm）和Pluronic-F127（終濃度0.05%），輕微震蕩孵育45 min，37 ℃，去除負載液，啟動共聚焦掃描顯微鏡，488 nm激光掃描，計算數(shù)據(jù)公式：［Ca2+］i=Kd〔（R-Rmin）/（Rmax-R）〕（Fmin/f=Fmax），其中Kd為解離常數(shù)，F(xiàn)為樣品的熒光強度值。

1.6.6 心肌組織CaN及SERCA2a蛋白檢測 采用Western blot法測定，液氮研磨心肌組織后，加入裂解液并置于冰上20 min使其充分裂解后，在4 ℃和12 000 rmp/min離心15 min后，保留上清液，用BCA法定量蛋白，制備SDS-PAGE濃縮膠與分離膠，上樣，電泳，轉膜，封閉，配一抗，上一抗（1∶500），上二抗（1∶2 000），顯影成像，利用Quantity-One圖像分析軟件分析各樣品目的條帶的灰度值，以看家基因GAPDH為內對照，計算CaN及SERCA2a蛋白條帶與GAPDH條帶灰度值之比，并將基礎數(shù)值（正常對照組）設置為1進行比較，從而得出各組最后結果。

1.6.7 心肌組織CaN及SERCA2a mRNA檢測 RTPCR法測定心肌組織CaN及SERCA2a mRNA水平，用TRIzol法提取總RNA，測OD值，檢驗RNA純度和濃度。逆轉錄合成cDNA：配置逆轉錄反應體系（20 μl），用去離子水1∶3稀釋后貯存于-20 ℃冰箱備用。引物設計與合成：CaN：F：5'-ACGGCAGACCCTACAAAG-3'；R：5'-CCCTCAAAGCCTCCATCC-3。SERCA2a：F：5'-T T C C C A C A A G T C C A A G A T-3'；R：5'-TCCTCCACAGCAGCCACCAAT-3'。PCR反應體系：配置逆轉錄反應體系（20 μl），置于PCR儀中，95 ℃30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，步驟 2～4 循環(huán)40次，72 ℃，10 min。PCR產物長度分別為391 bp（CaN）和204 bp（SERCA2a）。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學處理。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ECYXT對擴張型心肌病心力衰竭兔一般情況的影響 用藥后，觀察到ECYXT各劑量組和氯沙坦鉀組兔毛發(fā)枯槁和發(fā)黃、精神萎靡、水腫、少動少氣等情況均有所改善，心率和呼吸頻率較前平穩(wěn)，耳溫、尿量情況好轉；且ECYXY中、高劑量組和氯沙坦鉀組改善程度更為明顯，強于ECYXT低劑量組；心力衰竭模型組無好轉，并且其中部分實驗兔上述癥狀有所加重。整個用藥干預過程中，心力衰竭模型組和ECYXT低劑量組兔各死亡3只（均死于腹瀉），ECYXT中劑量組兔死亡2只（均死于腹瀉），ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組各死亡1只兔（均死于腹瀉），正常對照組無兔死亡。

2.2 ECYXT對擴張型心肌病心力衰竭兔血清ANP、BNP水平的影響 6組血清ANP、BNP水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。其中，ECYXT各劑量組、氯沙坦鉀組和正常對照組血清ANP、BNP水平均低于心力衰竭模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對照組血清ANP、BNP水平均低于ECYXT低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組3組間血清ANP、BNP水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 ECYXT對擴張型心肌病心力衰竭兔血清ANP、BNP水平的影響（±s，ng/ml）Table 1 Effects of effective components of Yixintai on serum ANP and BNP levels in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表1 ECYXT對擴張型心肌病心力衰竭兔血清ANP、BNP水平的影響（±s，ng/ml）Table 1 Effects of effective components of Yixintai on serum ANP and BNP levels in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

注：ECYXT=益心泰有效組分，ANP=心鈉肽，BNP=腦鈉肽；與心力衰竭模型組比較，aP＜0.01；與ECYXT低劑量組比較，bP＜0.01

組別 只數(shù) ANP BNP心力衰竭模型組 14 155.40±4.16 60.71±1.68 ECYXT低劑量組 14 138.68±3.18a 51.92±1.50a ECYXT中劑量組 15 126.98±3.09ab 49.30±1.93ab ECYXT高劑量組 16 125.03±3.54ab 48.37±1.33ab氯沙坦鉀組 15 124.69±3.26ab 48.25±1.43ab正常對照組 20 62.19±1.67ab 34.22±0.96ab F值 1 808.587 581.42 P 值 ＜0.001 ＜0.001

2.3 ECYXT對擴張型心肌病心力衰竭兔心臟超聲指標的影響 6組LVEF、LVFS和E/A比值比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。其中，ECYXT各劑量組、氯沙坦鉀組和正常對照組LVEF、LVFS和E/A比值均高于心力衰竭模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對照組LVEF、LVFS和E/A比值均高于ECYXT低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組LVEF、LVFS和E/A比值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 ECYXT對擴張型心肌病心力衰竭兔心臟超聲指標的影響（±s）Table 2 Effects of effective components of Yixintai on echocardiographic indices in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表2 ECYXT對擴張型心肌病心力衰竭兔心臟超聲指標的影響（±s）Table 2 Effects of effective components of Yixintai on echocardiographic indices in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

注：LVEF=左心室射血分數(shù)，LVFS=左心室短軸縮短率，E/A比值=E峰與A峰比值；與心力衰竭模型組比較，aP＜0.01；與ECYXT低劑量組比較，bP＜0.01

組別 只數(shù) LVEF（%） LVFS（%） E/A比值心力衰竭模型組 14 37.26±1.06 24.87±0.71 0.60±0.02 ECYXT 低劑量組 14 49.08±1.36a 29.47±0.82a 0.68±0.02a ECYXT 中劑量組 15 59.93±1.98ab 33.99±0.97ab 1.22±0.03ab ECYXT 高劑量組 16 60.96±1.65ab 34.10±0.97ab 1.23±0.04ab氯沙坦鉀組 15 61.14±1.60ab 34.68±1.26ab 1.24±0.03ab正常對照組 20 70.08±1.99ab 40.36±0.94ab 1.49±0.04ab F值 744.73 483.21 1 940.07 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 ECYXT對擴張型心肌病心力衰竭兔心臟組織形態(tài)學的影響 心力衰竭模型組心肌細胞損傷出現(xiàn)水腫、壞死，胞核皺縮，間質變寬，少許炎性細胞浸潤，心肌纖維排列紊亂，部分斷裂。ECYXT各劑量組和氯沙坦鉀組心肌細胞損傷程度均較心力衰竭模型組有所減輕。ECYXT低劑量組心肌細胞分布紊亂，間質增寬，伴纖維斷裂，少許炎性細胞浸潤。ECYXT中劑量組心肌纖維排列大致正常，伴少量纖維斷裂，心肌細胞輕度水腫，間質變寬，少許炎性細胞浸潤。ECYXT高劑量組和氯沙坦鉀組心肌纖維排列正常，未見斷裂及水腫，少許炎性細胞浸潤。正常對照組心肌纖維排列正常，無斷裂、水腫，且間質無炎性細胞浸潤，見圖1。

圖1 ECYXT對擴張型心肌病心力衰竭兔心肌組織形態(tài)學的影響（HE×400）Figure 1 Effect of effective components of Yixintai on pathological changes of the myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

2.5 ECYXT對擴張型心肌病心力衰竭兔心肌細胞［Ca2+］i濃度的影響 6組心肌細胞［Ca2+］i濃度比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。其中，ECYXT各劑量組、氯沙坦鉀組和正常對照組心肌細胞［Ca2+］i濃度均低于心力衰竭模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對照組心肌細胞［Ca2+］i濃度均低于ECYXT低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組3組間心肌細胞［Ca2+］i濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 ECYXT對擴張型心肌病心力衰竭兔心肌細胞［Ca2+］i濃度的影響（±s，nm）Table 3 Effect of effective components of Yixintai on the concentration of［Ca2+］i in myocardial cells of the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表3 ECYXT對擴張型心肌病心力衰竭兔心肌細胞［Ca2+］i濃度的影響（±s，nm）Table 3 Effect of effective components of Yixintai on the concentration of［Ca2+］i in myocardial cells of the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

注：與心力衰竭模型組比較，aP＜0.01；與ECYXT低劑量組比較，bP＜0.01

組別 只數(shù) ［Ca2+］i心力衰竭模型組 14 219.77±6.38 ECYXT低劑量組 14 182.94±5.08a ECYXT中劑量組 15 157.88±3.17ab ECYXT高劑量組 16 156.57±3.61ab氯沙坦鉀組 15 155.08±4.29ab正常對照組 20 94.94±2.23ab F值 605.78 P值 ＜0.001

2.6 ECYXT對擴張型心肌病心力衰竭兔心肌組織CaN及SERCA2a蛋白表達水平的影響 6組心肌組織CaN及SERCA2a蛋白表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。其中，ECYXT各劑量組、氯沙坦鉀組和正常對照組心肌組織CaN蛋白表達水平低于心力衰竭模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對照組心肌組織CaN蛋白表達水平低于ECYXT低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組心肌組織CaN蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.01）；ECYXT各劑量組、氯沙坦鉀組和正常對照組心肌組織SERCA2a蛋白表達水平高于心力衰竭模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對照組心肌組織SERCA2a蛋白表達水平均高于ECYXT低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對照組心肌組織SERCA2a蛋白表達水平均高于ECYXT中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ECYXT高劑量組心肌組織SERCA2a蛋白表達水平與氯沙坦鉀組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2、表4。

圖2 ECYXT對擴張型心肌病心力衰竭兔心肌組織CaN及SERCA2a蛋白表達水平的影響Figure 2 Effects of effective components of Yixintai on CaN and SERCA2a protein expression levels of myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表4 ECYXT對擴張型心肌病心力衰竭兔心肌組織CaN及SERCA2a蛋白表達水平的影響（±s）Table 4 Effects of effective components of Yixintai on CaN and SERCA2a protein expression levels in myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表4 ECYXT對擴張型心肌病心力衰竭兔心肌組織CaN及SERCA2a蛋白表達水平的影響（±s）Table 4 Effects of effective components of Yixintai on CaN and SERCA2a protein expression levels in myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

注：CaN=鈣調神經磷酸酶，SERCA2a=肌漿網鈣泵；與心力衰竭模型組比較，aP＜0.01；與ECYXT低劑量組比較，bP＜0.01；與ECYXT中劑量組比較，cP＜0.01

組別 只數(shù) C a N蛋白 S E R C A 2 a蛋白心力衰竭模型組 1 4 4.2 6±0.2 1 0.1 7±0.0 2 E C Y X T低劑量組 1 4 2.8 8±0.1 8 a 0.2 8±0.0 3 a E C Y X T中劑量組 1 5 2.2 4±0.1 6 ab 0.3 4±0.0 3 ab E C Y X T高劑量組 1 6 2.2 1±0.1 4 ab 0.5 3±0.0 4 abc氯沙坦鉀組 1 5 2.2 0±0.1 0 ab 0.5 4±0.0 5 abc正常對照組 2 0 1.0 0±0.0 7 ab 1.0 0±0.0 6 abc F值 8 6 3.9 0 8 5 4.1 0 P值 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1

2.7 ECYXT對心力衰竭兔心肌組織CaN及SERCA2a mRNA表達水平的影響 6組心肌組織CaN及SERCA2a mRNA表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。其中，ECYXT各劑量組、氯沙坦鉀組和正常對照組心肌組織CaN mRNA表達水平低于心力衰竭模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對照組心肌組織CaN mRNA表達水平低于ECYXT低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組心肌組織CaN mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.01）；ECYXT各劑量組、氯沙坦鉀組和正常對照組心肌組織SERCA2a mRNA表達水平高于心力衰竭模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對照組心肌組織SERCA2a mRNA表達水平均高于ECYXT低劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ECYXT高劑量組、氯沙坦鉀組、正常對照組心肌組織SERCA2a mRNA表達水平均高于ECYXT中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；ECYXT高劑量組心肌組織SERCA2a mRNA表達水平與氯沙坦鉀組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.01），見表5。

表5 ECYXT對心力衰竭兔心肌組織CaN及SERCA2a mRNA表達水平的影響（±s）Table 5 Effects of effective components of Yixintai on CaN and SERCA2a mRNA expression levels of myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

表5 ECYXT對心力衰竭兔心肌組織CaN及SERCA2a mRNA表達水平的影響（±s）Table 5 Effects of effective components of Yixintai on CaN and SERCA2a mRNA expression levels of myocardial tissue in the rabbit model of heart failure induced by dilated cardiomyopathy

注：與心力衰竭模型組比較，aP＜0.01；與ECYXT低劑量組比較，bP＜0.01；與ECYXT中劑量組比較，cP＜0.01

組別 只數(shù) CaN mRNA SERCA2a mRNA心力衰竭模型組 14 2.67±0.09 0.27±0.01 ECYXT低劑量組 14 2.58±0.09a 0.36±0.02a ECYXT中劑量組 15 1.68±0.07ab 0.57±0.03ab ECYXT高劑量組 16 1.67±0.08ab 0.69±0.03abc氯沙坦鉀組 15 1.65±0.07ab 0.71±0.03abc正常對照組 20 1.10±0.06ab 1.06±0.08abc F值 899.65 714.33 P 值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

擴張型心肌病是一種病因不明的異質性心臟病，目前對其機理尚不清楚，是心力衰竭常見的三大原發(fā)病之一。中醫(yī)藥通過整體辨證，治療該類患者療效得到肯定［9-10］，值得深入挖掘。

本研究采用阿霉素耳緣靜脈注射+丙基硫氧嘧啶灌胃制作兔擴張型心肌病心力衰竭模型，具備操作簡便、易于表現(xiàn)疾病特點的優(yōu)勢，但實驗過程中兔因腹瀉致死比例較高，對實驗過程中所有死亡兔進行解剖，發(fā)現(xiàn)存在不同程度的胸腔、腹腔積液及肝脾腫大，考慮與阿霉素導致腸炎的不良反應相關。本研究實驗結果顯示，與正常對照組比較，心力衰竭模型組血清ANP、BNP水平升高（P＜0.01），LVEF、LVFS和E/A比值降低（P＜0.01），提示擴張型心肌病心力衰竭兔的心功能下降。與心力衰竭模型組比較，ECYXT各劑量組和氯沙坦鉀組血清ANP、BNP水平降低（P＜0.01），LVEF、LVFS和E/A比值升高（P＜0.01），心肌細胞［Ca2+］i濃度及心肌組織CaN mRNA及蛋白表達水平降低（P＜0.01），心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白表達水平升高（P＜0.01），說明ECYXT能提高心功能，下調Ca2+濃度，提高心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白表達水平，降低心肌組織CaN mRNA及蛋白表達水平。且心肌組織形態(tài)學比較發(fā)現(xiàn)ECYXT各劑量組和氯沙坦鉀組均能不同程度改善心肌細胞損傷。與ECYXT低劑量組比較，ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組和氯沙坦鉀組血清ANP、BNP水平降低（P＜0.01），LVEF、LVFS和E/A比值升高（P＜0.01），心肌細胞［Ca2+］i濃度及心肌組織CaN mRNA及蛋白表達水平降低（P＜0.01），心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白表達水平升高（P＜0.01）。表明ECYXT中劑量組和ECYXT高劑量組的療效優(yōu)于ECYXT低劑量組。與ECYXT中劑量組比較，ECYXT高劑量組和氯沙坦鉀組心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白表達水平升高（P＜0.01），其余指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明ECYXT高劑量組調節(jié)心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白的表達能力優(yōu)于ECYXT低劑量組。ECYXT高劑量組與氯沙坦鉀組比較，各項指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示ECYXT高劑量組在對以上各項指標的調節(jié)上與氯沙坦鉀組具備同等效果。

Ca2+循環(huán)在心肌細胞的收縮和舒張過程中起著至關重要的作用，［Ca2+］i濃度升高會導致舒張期肌肉收縮受損和收縮期延長，與心力衰竭的病理生理密切相關。肌漿網作為儲存Ca2+的細胞器，肌漿網功能紊亂導致Ca2+循環(huán)和心肌細胞功能紊亂。SERCA2a是肌漿網鈣ATP酶（SERCA）在心臟中的主要表達形式，是心肌細胞［Ca2+］i濃度的主要決定因素。SERCA2a活性下降是心臟收縮不良、心肌細胞擴大進而造成心力衰竭的主要原因之一。正常情況下，興奮-收縮耦聯(lián)啟動，當心肌細胞［Ca2+］i處于高濃度時，SERCA2a被激活，胞質內Ca2+被泵回內質網或通過細胞膜鈉鈣交換器泵出胞外，心肌細胞［Ca2+］i濃度下降，恢復靜息電位。心力衰竭時，SERCA2a含量下降，不能將胞質內Ca2+泵回內質網或泵出胞外，導致心肌收縮功能下降［11］，心肌細胞［Ca2+］i濃度升高。因此，增加SERCA2a的活性成為治療多種慢性心臟病的潛在療法之一［12］。CaN作為一種絲/蘇氨酸磷酸酶，可以通過干涉心肌細胞重構、功能重構及心肌細胞凋亡等多途徑影響心力衰竭。CaN活性與心肌細胞［Ca2+］i濃度密切相關［13］，當心肌細胞［Ca2+］i濃度增加時可激活CaN，上調其mRNA及蛋白表達［14］，經過一系列反應引起心肌重構。通過抑制心肌細胞［Ca2+］i濃度進而提高CaN活性及蛋白表達、改善心力衰竭的療效得到證實［15］。本研究結果顯示，ECYXT提高了兔擴張型心肌病心力衰竭模型心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白表達水平，降低了心肌細胞［Ca2+］i濃度及心肌組織CaN mRNA及蛋白表達水平，其機制可能為ECYXT通過提高心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白表達水平，進而降低心肌細胞［Ca2+］i濃度，并基于此，下調了心肌組織CaN mRNA及蛋白表達水平。但比較ECYXT中劑量組、ECYXT高劑量組和氯沙坦鉀組對心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白表達水平的變化與心肌細胞［Ca2+］i濃度和心肌組織CaN mRNA及蛋白表達水平的變化出現(xiàn)不一致，說明SERCA2a與心肌細胞［Ca2+］i濃度之間的調節(jié)可能并非簡單的對應關系，或者與藥物劑量的變化有關，其機制尚待進一步研究。

綜上所述，本研究通過觀察ECYXT對兔擴張型心肌病心力衰竭模型進行干預，比較各組兔心肌組織形態(tài)學，血清ANP、BNP水平，LVEF、LVFS和E/A比值，心肌細胞［Ca2+］i濃度，心肌組織CaN、SERCA2a mRNA及蛋白表達水平等指標發(fā)現(xiàn)，ECYXT能提高心功能，其機制可能是通過提高心肌組織SERCA2a mRNA及蛋白表達水平，降低心肌細胞［Ca2+］i濃度，抑制心肌組織CaN mRNA及其蛋白表達，改善心肌重構，進而改善心力衰竭。

作者貢獻：李雅進行文章的構思與設計，研究的實施與可行性分析，統(tǒng)計學處理及結果的分析與解釋，撰寫論文；李玉瑩進行數(shù)據(jù)收集；魏佳明進行數(shù)據(jù)整理，論文修訂；郭志華負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。