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    環(huán)狀RNA Circ-RANBP1在胰腺癌組織中的表達(dá)及其對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

    2021-10-18 01:21:02李思思宋佳鴻何亞迎
    胃腸病學(xué) 2021年2期
    關(guān)鍵詞:結(jié)果顯示胰腺癌染色

    李思思 宋佳鴻 何亞迎 黃 英

    民航上海醫(yī)院消化內(nèi)科(200336)

    背景:大量研究表明,環(huán)狀RNA(circRNA)異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等密切相關(guān),是理想的診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。但circRNA在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚需進(jìn)一步探究。目的:探討circ-RANBP1在胰腺癌組織中的表達(dá)及其對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響。方法:以原位雜交法檢測circ-RANBP1在胰腺癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)。常規(guī)培養(yǎng)MIA PaCa-2細(xì)胞和SW 1990細(xì)胞,分別轉(zhuǎn)染circ-RANBP1敲低寡聚物和過表達(dá)質(zhì)粒,并設(shè)立相應(yīng)對照組。qRT-PCR法檢測circ-RANBP1在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。EdU實驗檢測circ-RANBP1對細(xì)胞增殖能力的影響。Transwell實驗檢測circ-RANBP1對細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。蛋白質(zhì)印跡法和免疫熒光染色檢測circ-RANBP1對細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進(jìn)程的影響。血管形成實驗評估circ-RANBP1表達(dá)對血管形成能力的影響。結(jié)果:Circ-RANBP1在胰腺癌組織中表達(dá)增高,且與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。Circ-RANBP1下調(diào)能抑制MIA PaCa-2細(xì)胞增殖,而circ-RANBP1過表達(dá)可促進(jìn)SW 1990細(xì)胞增殖。與對照組相比,敲低circ-RANBP1能抑制MIA PaCa-2細(xì)胞遷移和侵襲,而過表達(dá)circ-RANBP1可促進(jìn)SW 1990細(xì)胞遷移和侵襲。敲低circ-RANBP1可抑制EMT,過表達(dá)circ-RANBP1可促進(jìn)EMT。抑制circ-RANBP1表達(dá)可明顯降低血管形成能力,過表達(dá)則可明顯促進(jìn)血管形成。結(jié)論:Circ-RANBP1在胰腺癌組織中高表達(dá),并可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、EMT和血管形成。

    胰腺癌是一種常見的消化道惡性腫瘤,預(yù)后極差,五年生存率僅為9%[1]。然而,胰腺癌發(fā)病隱匿,缺乏有效的早期診斷方法,大多數(shù)胰腺癌患者發(fā)現(xiàn)即處于疾病晚期,失去手術(shù)治療的機(jī)會[2]。因此,尋找胰腺癌早期診斷和有效治療靶點(diǎn)仍是胰腺癌研究的重點(diǎn)。

    環(huán)狀RNA(circRNA)是由RNA反向剪接形成的一種共價閉合環(huán)狀非編碼RNA,主要由外顯子和(或)內(nèi)含子構(gòu)成,廣泛存在于真核細(xì)胞中[3]。與傳統(tǒng)線性RNA不同,circRNA缺乏5’端帽結(jié)構(gòu)和3’端Ploy(A)尾結(jié)構(gòu),因此能夠抵抗RNA核酸外切酶的降解,較線性RNA更穩(wěn)定[4]。同時,circRNA具有高度保守性和組織特異性,具備分子標(biāo)志物的潛能[5-7]。大量研究表明,circRNA異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等密切相關(guān)[8-11],是理想的診斷指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。但circRNA在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚需進(jìn)一步探究。本研究通過分析胰腺癌的circRNA GSE數(shù)據(jù)集(GSE69362、GSE79634),篩選出在胰腺癌中高表達(dá)的hsa_circ_0092314(circ-RANBP1),旨在探討其在胰腺癌組織中的表達(dá)及其對胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等細(xì)胞生物學(xué)過程的影響。

    材料與方法

    一、細(xì)胞株、組織芯片和主要試劑

    人胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1、BxPC-3、CFPAC-1、HPDE6-C7、MIA PaCa-2、SW 1990、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫;胰腺癌組織芯片(TMA,含有30例胰腺癌組織和對應(yīng)癌旁正常組織)購于上海芯超生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素均購自美國Gibco公司;circ-RANBP1過表達(dá)質(zhì)粒(circ)、circ-RANBP1敲低寡聚物(si-circ)均由廣州吉賽生物科技有限公司合成;EdU試劑盒購于廣州銳博生物技術(shù)有限公司;脂質(zhì)體Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司;Trizol裂解液、逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司;蛋白酶K、RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司?;|(zhì)膠購自美國BD公司。E-cadherin、N-cadherin一抗均購自Cell Signaling Technology, Inc.。

    二、方法

    1.原位雜交(ISH)染色:Circ-RANBP1探針由廣州吉賽生物科技有限公司合成。根據(jù)實驗步驟對組織芯片進(jìn)行染色,ISH染色鏡檢結(jié)果由兩位經(jīng)驗豐富的病理科專家進(jìn)行判定,并依據(jù)染色強(qiáng)度和染色范圍進(jìn)行評分。染色強(qiáng)度:0分,無染色;1分,淡黃色;2分,棕黃色;3分,棕褐色;染色范圍:0分,0%~10%;1分,11%~25%;2分,26%~50%;3分,51%~75%;4分,76%~100%。總評分為染色強(qiáng)度與染色范圍之積,≤4分為circ-RANBP1低表達(dá),>4分表示circ-RANBP1高表達(dá)。

    2.細(xì)胞培養(yǎng):MIA PaCa-2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,SW 1990細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件均為37 ℃、5% CO2。細(xì)胞生長至融合度為80%~90%時進(jìn)行消化傳代。

    3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將MIA PaCa-2和SW 1990細(xì)胞分別接種于6孔板,當(dāng)細(xì)胞融合度為60%~70%時,應(yīng)用Lipofectamine 3000對MIA PaCa-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染circ-RANBP1敲低寡聚物及其對照物,對SW 1990細(xì)胞轉(zhuǎn)染circ-RANBP1過表達(dá)質(zhì)粒和空載質(zhì)粒,組別依次命名為si-circ組、si-NC組、circ組、vector組。轉(zhuǎn)染6 h后換液繼續(xù)培養(yǎng),轉(zhuǎn)染24 h后,用qRT-PCR驗證轉(zhuǎn)染效率。實驗重復(fù)3次。

    4.qRT-PCR法:加入Trizol試劑提取細(xì)胞內(nèi)總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,行實時熒光定量PCR。circ-RANBP1引物上游:5’-GCT GAT CTC TTC CCT GCT CA-3’,下游:5’-AGG CTC CGC AAC AAC TAA TG-3’;內(nèi)參GAPDH引物上游:5’-GGG AAG GTG AAG GTC GGA GT-3’, 下游:5’-GGG GTC ATT GAT GGC AAC A-3’。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用2-△△Ct法計算目的基因的相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

    5.EdU實驗:細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,收集并將細(xì)胞接種于96孔板中,按照說明書步驟對細(xì)胞進(jìn)行EdU標(biāo)記、Apollo染色、DNA染色、圖像采集和分析。實驗重復(fù)3次。

    6.Transwell實驗:細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,收集細(xì)胞并用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,接種于Transwell上室中,下室加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基,常規(guī)培養(yǎng)16 h。輕輕擦去上室內(nèi)的細(xì)胞,多聚甲醛固定,用0.1%結(jié)晶紫染色,隨后顯微鏡下拍照并采集圖像,隨機(jī)取5個視野統(tǒng)計遷移細(xì)胞數(shù),取均值。實驗重復(fù)3次。

    細(xì)胞侵襲實驗是在小室濾膜上包被基質(zhì)膠,其余步驟同上述細(xì)胞遷移實驗,顯微鏡下隨機(jī)取5個視野統(tǒng)計細(xì)胞數(shù),取均值。實驗重復(fù)3次。

    7.蛋白質(zhì)印跡法:取對數(shù)生長期的細(xì)胞,消化后接種于6孔板中,細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后加入RIPA裂解液,提取各組細(xì)胞的總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,E-cadherin、N-cadherin一抗工作濃度均為1∶1 000。以GAPDH作為內(nèi)參,ECL法顯影并保存圖像。實驗重復(fù)3次。

    8.免疫熒光染色:采用4%的多聚甲醛溶液將已爬好細(xì)胞的玻片進(jìn)行固定,5%的BSA封閉1 h后加入一抗(E-cadherin、N-cadherin一抗工作濃度均為1∶100),4 ℃孵育過夜。PBS漂洗后加入熒光二抗,室溫孵育1 h,PBS漂洗后加入DAPI染色液,顯微鏡下拍照并采集圖像。實驗重復(fù)3次。

    9.血管形成實驗:將轉(zhuǎn)染48 h的HUVEC接種6孔板中,待貼壁后,PBS洗滌,換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,收集上清液;提前將基質(zhì)膠鋪到預(yù)冷的96孔板中,每孔60 μL,37 ℃凝固30 min。將HUVEC消化離心后用預(yù)先收集的上清液重懸為 3×104/100 μL,每孔100 μL加入備用的96孔板,細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)6 h。顯微鏡下隨機(jī)取5個視野計數(shù)血管內(nèi)皮細(xì)胞成管數(shù)量。實驗重復(fù)3次。

    三、統(tǒng)計學(xué)分析

    結(jié) 果

    一、Circ-RANBP1在胰腺癌組織中的表達(dá)及其與胰腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

    與癌旁正常組織相比,circ-RANBP1在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著升高(6.97±0.58對3.70±0.49),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.321,P<0.05;圖1A-1B)。根據(jù)circ-RANBP1在胰腺癌組織中的表達(dá),將胰腺癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,結(jié)果顯示circ-RANBP1表達(dá)與胰腺癌患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、N分期、神經(jīng)侵犯、血管侵犯等無關(guān)(P>0.05),而與患者的T分期、M分期、AJCC分期密切相關(guān)(P<0.05;表1)。Kaplan-Meier生存分析顯示,高表達(dá)circ-RANBP1的胰腺癌患者生存期顯著低于低表達(dá)者(圖1C)。

    表1 Circ-RANBP1表達(dá)與胰腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系(n)

    A-B:胰腺癌和相應(yīng)癌旁正常組織中circ-RANBP1表達(dá)(ISH染色);C:Circ-RANBP1表達(dá)與胰腺癌患者生存期的關(guān)系(Kaplan-Meier生存分析)

    二、Circ-RANBP1在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)以及細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

    與正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞相比,circ-RANBP1在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高(圖2A)。篩選出circ-RANBP1表達(dá)相對較高的MIA PaCa-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-circ-RANBP1,circ-RANBP1表達(dá)相對較低的SW 1990細(xì)胞轉(zhuǎn)染circ-RANBP1過表達(dá)質(zhì)粒。結(jié)果顯示,與對照組相比,si-circ-RANBP1可顯著降低circ-RANBP1表達(dá)(P<0.05),而轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)??擅黠@提高circ-RANBP1表達(dá)(P<0.05;圖2B)。

    A:circ-RANBP1在不同胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá);B:驗證circ-RANBP1的敲低和過表達(dá)效率

    圖3 EdU實驗檢測circ-RANBP1對胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

    三、Circ-RANBP1對胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

    EdU實驗結(jié)果顯示,circ-RANBP1敲低后,MIA

    四、Circ-RANBP1對胰腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

    Transwell遷移實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,circ-RANBP1敲低組MIA PaCa-2細(xì)胞遷移數(shù)目顯著減少,而circ-RANBP1過表達(dá)組SW 1990細(xì)胞遷移數(shù)目明顯增多(P<0.05);Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示,circ-RANBP1敲低組MIA PaCa-2細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯少于對照組(P<0.05),circ-RANBP1過表達(dá)組SW 1990細(xì)胞侵襲數(shù)目顯著多于對照組(P<0.05;圖4)。表明circ-RANBP1可促進(jìn)細(xì)胞的遷移、侵襲能力。

    圖4 Transwell實驗驗證circ-RANBP1對胰腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

    五、Circ-RANBP1對細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響

    蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示,circ-RANBP1敲低能促進(jìn)上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá),抑制間皮標(biāo)志物N-cadherin表達(dá),而circ-RANBP1過表達(dá)能抑制E-cadherin表達(dá),促進(jìn)N-cadherin表達(dá)(圖5A);免疫熒光實驗進(jìn)一步證實了上述實驗結(jié)果(圖5B)。由此可見,circ-RANBP1能影響細(xì)胞的EMT。

    A:蛋白質(zhì)印跡法;B:免疫熒光法

    六、Circ-RANBP1對血管形成能力的影響

    圖6 Circ-RANBP1表達(dá)對血管形成能力的影響

    討 論

    CircRNA是非編碼RNA家族重要成員,以往被認(rèn)為是RNA異常剪切產(chǎn)生的基因副產(chǎn)物,無細(xì)胞生物學(xué)功能[12-13]。近年,隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展以及研究的深入,發(fā)現(xiàn)了越來越多的circRNA,且在細(xì)胞的生理和病理過程中發(fā)揮重要作用[14-15]。研究顯示,多種circRNA在胰腺癌中異常表達(dá),參與調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等細(xì)胞生物學(xué)行為[16-17],并可作為胰腺癌的診斷和預(yù)后指標(biāo)[18]。因此,深入研究胰腺癌相關(guān)circRNA不僅能夠豐富和完善胰腺癌的發(fā)病機(jī)制,而且可為尋找胰腺癌早期診斷和治療靶標(biāo)提供參考。

    本研究選取了與胰腺癌相關(guān)的circ-RANBP1作為研究對象,旨在探討其對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其作為潛在診斷標(biāo)志物的潛能。結(jié)果顯示circ-RANBP1在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織。進(jìn)一步分析顯示circ-RANBP1高表達(dá)與胰腺癌患者的TNM分期密切相關(guān)。Kaplan-Meier生存曲線分析表明,circ-RANBP1高表達(dá)與胰腺癌患者的生存期呈負(fù)相關(guān)。說明circ-RANBP1表達(dá)對評估胰腺癌患者的分期以及預(yù)后有重要參考價值。

    本研究通過qRT-PCR法發(fā)現(xiàn),circ-RANBP1在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高。為進(jìn)一步驗證circ-RANBP1對胰腺癌細(xì)胞功能的影響,通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)或下調(diào)circ-RANBP1表達(dá)。結(jié)果顯示circ-RANBP1表達(dá)降低后,胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力降低;而circ-RANBP1過表達(dá)后,細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力明顯升高。進(jìn)一步提示circ-RANBP1可能是胰腺癌潛在的治療靶點(diǎn)。

    EMT為腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的重要步驟,即上皮細(xì)胞通過改變其形態(tài)、修飾黏附分子,獲得遷移和侵襲行為[19-21]。大量研究表明,circRNA可通過調(diào)節(jié)EMT來影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[22-24]。本研究結(jié)果顯示,下調(diào)circ-RANBP1表達(dá)可抑制EMT,而上調(diào)circ-RANBP1表達(dá)可促進(jìn)EMT。此外,實體腫瘤的增殖需要大量的新生血管為其快速增長提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)和氧供[25]。本研究中,circ-RANBP1能促進(jìn)血管形成,為其在胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用提供了進(jìn)一步的證據(jù)。

    綜上所述,本研究證實了circ-RANBP1在胰腺癌組織中高表達(dá),并能調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,促進(jìn)EMT和血管形成,進(jìn)而發(fā)揮促癌作用。本研究結(jié)果有望為胰腺癌的診治提供更廣闊的前景。

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