馬尾松葉低極性部位的GC-MS分析及協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌活性研究

孔飛飛，鄭 巍，郭良君，金永生 （. 陸軍第七十二集團(tuán)軍醫(yī)院藥劑科，浙江 湖州 33000；. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室，上海 00433）

松科(Pinaceae)植物馬尾松(PinusmassonianaLamb.)主要產(chǎn)于江蘇、安徽、河南、陜西及長江中下游各省區(qū)，資源豐富[1]。松葉“味苦，溫；暖，無毒”，具有祛風(fēng)燥濕、殺蟲、止癢之功用。水煎、浸酒以外用或內(nèi)服[2]用于治風(fēng)濕痿痹、跌打損傷、濕瘡、疥癬、慢性氣管炎等癥以及預(yù)防感冒、流腦。文獻(xiàn)報(bào)道馬尾松葉中的主要化學(xué)成分為揮發(fā)油、黃酮、多糖、木脂素和樹脂等，現(xiàn)代藥理研究表明馬尾松葉提取物具有抗氧化、抗衰老、抑菌等多方面活性[3-15]。

近年來由于抗生素的濫用、器官移植、免疫抑制劑以及HIV患者的增多，深部真菌感染發(fā)病率逐年上升，其中白念珠菌是最主要的致病菌。氮唑類藥物氟康唑是臨床上首選的抗白念珠菌(Candida albicans)感染藥物。但是長期和重復(fù)給藥導(dǎo)致白念珠菌對(duì)氟康唑耐藥越來越強(qiáng)。目前聯(lián)合用藥是恢復(fù)耐藥真菌對(duì)治療藥物的敏感度，提高耐藥菌對(duì)氟康唑的敏感性，治療深部耐藥菌感染的一種有效的治療途徑。從天然活性成分中尋找與現(xiàn)有的抗真菌藥物聯(lián)合發(fā)揮協(xié)同作用的小分子化合物是近年來的研究方向之一[16-20]。本文選用接近“傳統(tǒng)水煎或浸酒法”的傳統(tǒng)中藥提取方法，用乙醇加熱提取后，石油醚再萃取的方法得到馬尾松葉低極性部位，通過測定馬尾松葉低極性部位協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌的MIC80值，同時(shí)，采用氣相色譜-質(zhì)譜的方法對(duì)低極性部位的化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，初步探究其聯(lián)合氟康唑的體外抗真菌活性。

1 材料

1.1 試劑與設(shè)備

Thermo Trace GC Ultra氣相色譜、Thermo DSQ Ⅱ質(zhì)譜、Xcalibur工作站(美國賽默飛世爾公司）；馬尾松葉(浙江東陽市，經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)黃寶康教授鑒定為馬尾松PinusmassonianaLamb.)；所有試劑均為分析純；水為重蒸水；載氣為高純氦氣。

氟康唑注射液（上海信誼金朱藥業(yè)有限公司）；黃芩素（上海歷鼎生物技術(shù)有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）；白念珠菌103（Candida albicans103，海軍軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院真菌室提供）。

1.2 馬尾松葉低極性部位的制備

取干燥馬尾松葉，粉碎，稱取二份，每份50.0 g，分別用150 ml石油醚和80%乙醇加熱回流提取1h，濾過；濾渣再分別用150 ml石油醚和80%乙醇加熱回流提取1 h，濾過。分別合并兩次濾液，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收溶劑，得石油醚提取物（簡稱醚提取物）2.5 g和80%乙醇提取物（簡稱醇提取物）8.0 g。取干燥后的醇提取物5.0 g，加入水100 ml混溶，獲得混懸液。混懸液用50 ml石油醚萃取3次，合并濃縮石油醚萃取液，獲得石油醚浸膏（簡稱醚浸膏）即馬尾松葉低極性部位0.8 g。取125 mg醚浸膏，置于100 ml量瓶中，加入80%甲醇，超聲、加熱使其幾近完全溶解，放置、冷卻；再加入80%甲醇定容，搖勻、放置；吸取1 ml定容后的浸膏液，微孔濾膜過濾后待測。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱TR - 35MS石英毛細(xì)管（30 m×0.25 mm，0.25 μm），程序升溫，起始溫度40 ℃，保持2 min后以10 ℃/min的速度升至300 ℃并保持5 min；汽化溫度250 ℃，進(jìn)樣量1 μl；分流比10∶1。載氣為高純氦氣，流速1.0 ml/min。離子源：EI源；離子源溫度為250 ℃；電子能量：70 eV；掃描范圍：50～650m/z。

2 方法

2.1 抑菌實(shí)驗(yàn)方法

菌株選用臨床分離耐藥菌株白念珠菌103（氟康唑的MIC80＞128.0 μg/ml）。采用美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）提出的RPMI1640 培養(yǎng)基微量稀釋法，取無菌96孔板，于每排1號(hào)孔加RPMI1640液體培養(yǎng)基100 μl作空白對(duì)照；3～12號(hào)孔各加新鮮配制的菌液100 μl，菌液濃度范圍為（1～5）×103cfu/ml；2號(hào)孔分別加菌液160 μl和受試藥物溶液40 μl；12號(hào)孔不含藥物，只加菌液100 μl作陽性生長對(duì)照。2～11號(hào)孔進(jìn)行倍比稀釋，使各孔的最終藥物（醚提取物、醇提取物和醚浸膏）濃度分別為250.0、125.0、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98和0.49 μg/ml，對(duì)照品黃芩素濃度分別為128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5和0.25 μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1%，氟康唑溶液的終濃度為8.0 μg/ml。96孔板于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出，讀取受試藥物與氟康唑（8.0 μg/ml）聯(lián)用時(shí)的MIC80值。微量稀釋法測試結(jié)果見表1。

表1 馬尾松葉3種提取物與氟康唑聯(lián)用對(duì)體外白念珠菌103活性(MIC80)試驗(yàn)結(jié)果

協(xié)同藥效的判定采用聯(lián)合抑菌濃度分?jǐn)?shù)指數(shù)（FICI），即聯(lián)用抑菌時(shí)每種藥物所需最低抑菌濃度（MIC）與單用這種藥物抑菌時(shí)所需MIC的比值的和。當(dāng)FICI≤0.5時(shí)，兩種藥物的相互作用效果被定義為具有協(xié)同作用；當(dāng)FICI＞0.5時(shí)，認(rèn)為兩種藥物無相互作用。

2.2 色譜-質(zhì)譜分析方法

按“1.3”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)條件對(duì)馬尾松葉低極性部位進(jìn)行分析，25 min得到馬尾松葉低極性化學(xué)成分的總離子流圖（圖1）。共檢測出30個(gè)峰，通過檢索NIST08光譜數(shù)據(jù)庫，按60%以上匹配率（SI和RSI均大于600，最大值1 000），并結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律確定其化學(xué)成分。運(yùn)用峰面積歸一法通過Xcalibur化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，測得各個(gè)化學(xué)成分在石油醚部位中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。

圖1 馬尾松葉低極性化學(xué)成分總離子流圖

3 結(jié)果與分析

由表1可見，各受試藥物單用時(shí)，對(duì)照品黃芩素的MIC80為16.0 μg/ml，提示了其具有一定的抗菌活性，其他的化合物的MIC80均大于250 μg/ml。各受試藥物與氟康唑（8.0 μg/ml）聯(lián)用后，對(duì)照品黃芩素、醇提取物及醚浸膏的MIC80降至4.0～31.25 μg/ml，相應(yīng)的FICI值均小于0.5，顯示黃芩素、醇提取物、醚浸膏分別與氟康唑聯(lián)用對(duì)耐藥白念珠菌均具有協(xié)同活性，但醇提取物和醚浸膏的協(xié)同活性不及對(duì)照品黃芩素，醚浸膏協(xié)同活性小于醇提取物。醚提取物單用及與氟康唑聯(lián)用的MIC80均大于250 μg/ml，F(xiàn)ICI大于0.5，顯示其單用及與氟康唑聯(lián)用均沒有協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌活性。

如表2所示，本次GC-MS檢測出30種成分，鑒定出17個(gè)化合物。統(tǒng)計(jì)出本次所測馬尾松葉的低極性化學(xué)成分中含有烷烴4個(gè)（6.1%），甾烷類5個(gè)（4%），脂肪酸1個(gè)（0.75%），二萜5個(gè)（53.99%），其他峰均提示為聚硅氧烷（35.16%），其中含量較高的化學(xué)成分是：瑪瑙酸（8.38%，見圖2）、脫氫樅酸甲酯（8.41%，見圖3）。

圖 2 瑪瑙酸/貝殼杉萘甲酸

圖3 脫氫樅酸甲酯

表2 馬尾松葉低極性化學(xué)成分分析結(jié)果

4 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)馬尾松葉提取物具有抗真菌活性：馬尾松葉石油醚、氯仿等溶劑的提取物以及不同比例的乙醇水提取物可以抑制曲霉、青霉、啤酒酵母的生長；馬尾松葉乙醇提取物對(duì)枯萎病、灰霉菌有顯著的抑菌活性；馬尾松葉水提物對(duì)白色念珠菌有較弱抑菌性[21-25]。但馬尾松葉提取物對(duì)氟康唑耐藥白念珠菌的協(xié)同抗菌活性未見報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，馬尾松葉的醇提取物和醚浸膏單獨(dú)使用時(shí)均不及黃芩素，沒有抗耐藥白念珠菌活性，但聯(lián)用氟康唑（8 μg/ml）后，醇提取物和醚浸膏均表現(xiàn)出協(xié)同活性，醇提取物的活性更好，而醚提取物無論是單獨(dú)使用還是聯(lián)用氟康唑都沒有抗耐藥白念珠菌活性。醚浸膏與醚提取物相比，提取方法的改變，導(dǎo)致了提取物抑菌效果的有無。醚浸膏的活性應(yīng)該源于乙醇加熱提取獲得的更豐富、含量更高的化學(xué)成分，盡管醚浸膏的主要成分也是低極性成分，但與醚提取物相比無論在含量和組成上均應(yīng)不同。醚提取物含有更豐富的揮發(fā)油等低極性成分，但是可能缺少了一些重要的活性抗真菌成分，導(dǎo)致其沒有協(xié)同抗耐藥真菌作用。我們進(jìn)一步對(duì)活性部位醚浸膏進(jìn)行了GC-MS化學(xué)成分分析，結(jié)果表明，其化學(xué)成分與文獻(xiàn)報(bào)道的采用水蒸氣和超臨界CO2提取法獲得的馬尾松葉揮發(fā)油成分相比差異大?；钚圆课幻呀嘀谢衔锝Y(jié)構(gòu)類型和數(shù)量比文獻(xiàn)報(bào)道的直接提取的揮發(fā)油少，且沒有以蒎烯、莰烯為主的單萜和以石竹烯等為主的倍半萜，僅有烷烴類少量化合物重合[26-31]?；钚圆课幻呀嗖捎昧艘掖技訜崽崛『?，再經(jīng)石油醚萃取得到，加熱提取可能導(dǎo)致了蒎烯、莰烯、石竹烯等低沸點(diǎn)萜類化合物的丟失，但分子量更大的二萜類化學(xué)成分含量升高（53.99%）。二萜類化學(xué)成分中脫氫樅酸甲酯、海松酸甲酯是主要化學(xué)成分，兩者也是松香酸的主要成分。有文獻(xiàn)報(bào)道松香酸具有抗赤霉菌、灰霉菌等多種抗真菌活性[32-35]。因此，醚浸膏中的二萜類化合物可能是其協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌作用的重要活性成分，值得進(jìn)一步研究。此外，Zuzana研究發(fā)現(xiàn)云杉提取物中的β-谷甾醇抑制微生物生長，同時(shí)低濃度的脫氫樅酸甲酯破壞細(xì)胞壁，兩者相互協(xié)同可能是云杉提取物對(duì)青霉菌、鏈格孢菌、米根霉的抑菌活性的關(guān)鍵[36]。本研究獲得的醚浸膏中也含有豐富的樹脂酸（13.03%）和甾烷（4%）。樹脂酸和甾烷的協(xié)同可能也是醚浸膏具有協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌活性的原因，這一點(diǎn)也值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本文首次報(bào)道了馬尾松葉乙醇提取物以及馬尾松葉低極性部位具有協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌作用，并首次對(duì)馬尾松葉低極性部位進(jìn)行了GC-MS分析，鑒別的化合物除了烷烴、脂肪酸、脫氫樅酸甲酯外其它11種成分都是首次從該植物中發(fā)現(xiàn)，豐富了馬尾松葉的化學(xué)成分。