梔子苷的提取及酶促水解生產京尼平的研究

李曦杰,鄧月峰,王舉政,陽 杰,黃 晗,李大力

(南京理工大學 生物工程系，江蘇 南京 210094)

梔子是茜草科植物梔子的干燥成熟果實。最早記錄于《神農本草經》，經過現(xiàn)代研究分析，梔子中含有種類繁多的化學成分，梔子苷是梔子果實中的主要生物活性成分之一，屬于環(huán)烯醚萜類化合物，在杜仲和管花肉蓯蓉等植物也有發(fā)現(xiàn)[1-3]。梔子苷有抗炎、利膽、止痛、解熱、輕瀉和鎮(zhèn)靜等作用[4-6]，是梔子抗炎和治療扭挫傷的主要成分，同時其還在植物分類學方面及吲哚生物堿的合成中具有重要意義。梔子苷的提取一般分為兩步，首先需要將梔子果實中的有效成分進行粗提，再將粗提液進行分離純化以得到純度較高的梔子苷。粗提有效成分的技術一般為煎煮法、超聲提取法、回流法和浸提法等。從梔子果實中粗提出來梔子苷大都含有許多雜質，梔子苷的提純方法有活性炭除雜法、硅膠吸附法、鉛鹽沉淀法等。2008年，Liu通過運用柱層析的方法，在最優(yōu)條件下將提取液梔子苷的含量從50%提純至95%[7]。2005年，姚干等采用HPD 450大孔吸附樹脂純化粗提液也得到純度62%以上的梔子苷樣品[8]。梔子苷經β-葡萄糖苷酶水解可得到京尼平。京尼平是一種環(huán)烯醚萜類化合物，具有保肝利膽、抗癌、鎮(zhèn)痛、降血糖等作用，京尼平還可作為一種新型的天然交聯(lián)劑，能夠與蛋白質、明膠和殼聚糖等發(fā)生交聯(lián)反應從而制備生物材料，如梔子藍、梔子紅、凝膠膜等[9-11]。本研究用乙醇浸提梔子果實中的梔子苷，用AB-8大孔吸附樹脂層析純化梔子苷，用固定化β-葡萄糖苷酶對純化后的梔子苷進行酶促水解，獲得了富含京尼平的梔子苷水解液。

1 實驗材料和過程

1.1 材料與試劑

京尼平購自Aladdin公司。AB-8大孔樹脂購自安徽三星樹脂科技有限公司。梔子苷及其他試驗所用試劑均購自國藥集團。高效液相色譜儀為日本島津公司產品。

1.2 乙醇浸提

用分析天平稱取50 g梔子果實置于家用食品破碎機中，快速破碎5 min。將梔子粉加入400 mL50%乙醇中室溫浸泡48 h，使用尼龍濾布(400目)過濾，濾液收集用于后續(xù)純化。以200 mg·L-1比例加入明礬沉降雜質，5 h后用濾紙過濾，收集濾液。

1.3 大孔吸附樹脂純化梔子苷粗提液

將AB-8大孔吸附樹脂加入層析柱，用無水乙醇對層析柱進行淋洗，直至流出的無水乙醇滴入清水中無白色渾濁；用3個柱體積的去離子水洗滌層析柱；將用去離子水稀釋2倍的梔子苷浸取液以1 mL·min-1的流速進樣，上樣完成后使用2個柱體積的去離子水洗滌層析柱；先使用30%乙醇溶液進行洗脫，收集保存洗脫液，然后用50%乙醇溶液再次洗脫層析柱，保存洗脫液。

1.4 酶促水解梔子苷粗提液

參照Ouyang[12]等人的報道制備以殼聚糖為載體的β-葡萄糖苷酶(殼聚糖@β-葡萄糖苷酶)。將0.1 g殼聚糖@β-葡萄糖苷酶加至5 mL含有磷酸鹽緩沖液(pH 6.0，50 mM)中，隨后加入5 mL 50%乙醇洗脫物，50℃反應12 h后，離心分離殼聚糖@β-葡萄糖苷酶。上清液為梔子苷水解液。

1.5 TLC與HPLC分析

用薄層層析(TLC)定性檢測梔子苷和京尼平，展層劑為氯仿：甲醇= 4：1(v/v)。用高效液相色譜(HPLC)對梔子苷含以及京尼平含量進行定量分析，檢測波長為260 nm，流動相為甲醇：水= 40：60(v/v)，流速為0.4 mL·min-1。

2 實驗結果與分析

2.1 梔子苷的提取結果

梔子苷分離純化各步驟樣品的HPLC分析結果如圖1。從HPLC分析結果中可以看到，乙醇對梔子果實進行浸提，浸取液中雜質較多。30%乙醇洗脫層析柱，洗脫物中含大部分雜質，同時也含有少量梔子苷，而50%乙醇再次洗脫后，洗脫物中梔子苷的純度較高，雜質較少。計算得到50%乙醇洗脫物中梔子苷濃度為1.495%，梔子中梔子苷的提取收率為1.79%。經層析純化處理后的梔子苷液(右)與標準樣(左)的TLC結果如圖2，左側為梔子苷標準樣；右側為樹脂純化后的梔子苷，可觀察到AB-8大孔吸附樹脂層析對梔子苷純化效果較好。

圖1 梔子苷分離純化各步驟樣品的HPLC分析圖

圖2 梔子苷的TLC分析結果

2.2 酶水解梔子苷的結果

HPLC和TLC檢測殼聚糖@β-葡萄糖苷酶對梔子苷的水解反應液中梔子苷與京尼平的含量變化如圖3-4，圖4中左側為京尼平標準樣；中間為水解1h反應液；右側為水解12 h反應液。反應剛開始時溶液中無京尼平，反應進行1 h后，反應溶液中的梔子苷含量下降，京尼平生成。反應12 h后，反應液上清為含有大量京尼平的梔子苷水解液。

圖3 殼聚糖@β-葡萄糖苷酶水解純化梔子苷反應溶液HPLC分析

圖4 梔子苷酶促水解液的TLC分析結果

3 結 論

采用乙醇對梔子果實中的梔子苷進行浸提后，利用AB-8大孔吸附樹脂對梔子苷進行純化，獲得的梔子苷經殼聚糖@β-葡萄糖苷酶水解12 h后即可獲得富含京尼平的水解液?？呻x心去除殼聚糖@β-葡萄糖苷酶以避免蛋白對制備液的污染。這種制備京尼平的方法簡單有效且對環(huán)境友好。