液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)快速測定嬰幼兒谷物食品中3種莨菪烷生物堿

胡 俠，付麗莎

(大連產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測研究院有限公司，遼寧 大連 116023)

阿托品、東莨菪堿和山莨菪堿均屬于莨菪烷類生物堿，含此類生物堿的植物分布廣泛，誤食它們能引起攝食者輕微的肝損傷，嚴(yán)重時(shí)可能對神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)造成損害，甚至出現(xiàn)內(nèi)分泌失調(diào)等癥狀[1]。隨著農(nóng)業(yè)機(jī)械化程度的發(fā)展，人們在收獲米粉、高粱、蕎麥等谷物時(shí)，含有莨菪烷類生物堿的植物混入原料中的風(fēng)險(xiǎn)增大，以這些原料加工成嬰幼兒谷物的加工食品，含有莨菪烷類生物堿的可能性加大。歐盟等國和地區(qū)允許莨菪烷類生物堿嬰幼兒谷物食品中的阿托品、東莨菪堿殘留限量為1.0 μg·kg-1。為保障嬰幼兒谷物食品產(chǎn)品質(zhì)量安全，建立嬰幼兒谷物食品中莨菪烷類生物堿殘留的檢測方法是非常必要的。

目前，國內(nèi)外莨菪烷類生物堿含量的測定方法有液相色譜法(HPLC)[2-5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[6]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-12](LC-MS/MS)和毛細(xì)管電泳法[13-14]等，主要集中在體液、藥物和藥用植物中莨菪烷類生物堿的測定，嬰幼兒谷物食品中3種莨菪烷類生物堿的測定方法還未見報(bào)道。因此，本研究以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法( LC-MS/MS) 為檢測手段，建立了嬰幼兒谷物食品中3種莨菪烷類生物堿的檢測方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 6460 Triple Quad LC/MS(Agilent公司)；CR21GIII高速離心機(jī)(日本Hitachi公司)；超聲波清洗儀(昆山禾創(chuàng)儀器有限公司)；N-EVAP-24氮吹儀(美國Organomation Associates公司)；固相萃取裝置(Supelco公司)；Sartorius arium61315 超純水發(fā)生器(德國Sartorius公司)；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為高純水，消旋山莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品 (上海源葉生物科技有限公司)，東莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品(J&K公司 )，阿托品標(biāo)準(zhǔn)品 (Dr.Ehrenstorfer公司 )

Oasis HLB(60 mg·3 mL-1)、PRIME HLB柱

(200 mg·6 mL-1，)、C18固相萃取柱(60 mg·3 mL-1)采自Waters公司。

樣品為市售嬰幼兒谷物食品(米粉、蕎麥面條和高粱面條)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取適量各標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇溶解，配成1000 mg·L-1的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃ 下避光保存，有效期6個(gè)月。移取各單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成10.0 mg·L-1的混合中間溶液，避光保存，有效期3個(gè)月。按照1.3操作方法所述制得空白樣品提取液，上機(jī)前制成合適濃度的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.5 g試樣于50 mL離心管中，加入5 mL 80%(v/v)乙腈水溶液，勻漿2 min，超聲10 min，在4℃下以10000 r·min-1離心3 min，轉(zhuǎn)移全部上清液于10 mL帶刻度比色管中備用。重復(fù)提取一次，合并提取液，用80%乙腈水溶液定容至10 mL，混勻備用。

取4.0 mL上清備用液于Oasis PRiME HLB柱上，流干后，收集流出液，于45℃下水浴中氮?dú)獯蹈?。?.0mL0.1%(v/v)甲酸水溶液復(fù)溶，溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后待測。

1.4 色譜條件

選用Agilent Poroshell 120EC-C18(2.7 μm，3.0 mm×75 mm)色譜柱；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A為0.1%(v/v)甲酸水溶液，B為0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～0.5 min，5% B；0.5～1.0 min，10% B；1.0～3.0 min，20% B；3.0～6.0 min，50% B；6.0～8.0 min，90% B；8.1～9.0 min，5% B；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：5μL 。

1.5 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，在ESI+掃描模式下檢測；掃描模式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)，霧化氣壓力：38 MPa；離子噴霧電壓：4000 V；干燥氣(N2)溫度：350℃；干燥氣流速：10 L·min-1；優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 3種莨菪烷類生物堿的質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

比較了水-甲醇或水-乙腈組成體系中酸(甲酸、乙酸)的種類及添加比例對分離3種莨菪烷類藥物的影響。實(shí)驗(yàn)表明：當(dāng)流動(dòng)相為水-乙腈時(shí)，在液相色譜分離系統(tǒng)中3種莨菪烷類藥物上的色譜行為優(yōu)于流動(dòng)相為水-甲醇時(shí)。當(dāng)流動(dòng)相為水-乙腈時(shí)，酸(甲酸、乙酸)的添加比例在0.05%，0.1%，0.2%，0.3%條件下，目標(biāo)化合物的色譜保留行為。結(jié)果顯示酸添加比例在0.1%以上時(shí)，3種莨菪烷類藥物的色譜行為沒有太大的變化，加甲酸時(shí)各化合物響應(yīng)信號更強(qiáng)、分離度更好、基線噪音較低。因此選擇0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈作流動(dòng)相。

采用選定的流動(dòng)相和色譜柱，優(yōu)化梯度洗脫程序，所有待測物都得到良好峰形和較高靈敏度。山莨菪堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)為莨菪酸-6β羥基-3α-莨菪酯與阿托品相比在莨菪烷母核上多了一個(gè)6β羥基，因此山莨菪堿存在四個(gè)光學(xué)異構(gòu)體。消旋山莨菪堿有兩個(gè)光學(xué)異構(gòu)體， 所以在色譜柱上有2個(gè)色譜峰[15]。2.0μg·kg-1添加水平下，米粉中目標(biāo)化合物的總離子流色譜圖如圖1。

配制濃度為1.0 mg·L-1的3種莨菪烷類生物堿的標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇不同的電離模式，對各個(gè)目標(biāo)物進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，結(jié)果表明各個(gè)目標(biāo)化合物[M+H]+母離子相應(yīng)最高。 然后對各個(gè)目標(biāo)化合物進(jìn)行碰撞電壓、碰撞能進(jìn)行優(yōu)化，使選定的特征碎片離子強(qiáng)度達(dá)到最大。最后，對方法的噴霧電壓、干燥氣壓力、離子源溫度等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定各個(gè)目標(biāo)化合物最佳的質(zhì)譜條件，如圖1，其中1為消旋山莨菪堿，2為東莨菪堿 ，3為阿托品。

圖1 米粉中3種莨菪烷類藥物的總離子流圖

2.2 樣品提取與凈化條件的選擇

試驗(yàn)比較了甲醇、乙腈作為提取試劑，對3種莨菪烷類生物堿 提取效果，結(jié)果表明乙腈較甲醇具有較高的回收率。由于莨菪烷類生物堿親水性不同，在乙腈中加入一定比例的水可滿足莨菪烷類生物堿的提取需要。本研究選用體積分?jǐn)?shù)為 60%、80%、90% 的乙腈水溶液為提取試劑進(jìn)行提取試驗(yàn)。 結(jié)果表明：當(dāng)提取溶液中乙腈體積分?jǐn)?shù)為 80% 時(shí)，能兼顧3種莨菪烷類生物堿的提取效率，通過2 次分步提取，3種莨菪烷類生物堿均能獲得滿意的提取效果，回收率為86.8%～103.3%。

谷物類植物中成份復(fù)雜， 這些物質(zhì)不僅干擾LC-MS/MS分析，還會(huì)影響色譜柱的分辨率，甚至污染質(zhì)譜儀。菪烷類生物堿的凈化手段大多采用富集濃縮類型的 SPE方法，該類方法涉及溶劑替換、SPE柱的活化、上樣、淋洗和洗脫等操作步驟，耗費(fèi)時(shí)間較長。新型的親水親脂反相固相萃取吸附劑的Oasis PRiME HLB 可以在高比例的有機(jī)相條件下，可有效去除基質(zhì)中的蛋白類、磷脂類干擾物，達(dá)到對樣品進(jìn)行凈化的目的。按照1.3節(jié)方法獲得空白米粉提

取液3份，添加10.0 μg·kg-13種莨菪烷類藥物，分別取4 mL提取液通過C18、Oasis HLB和Oasis PRiME HLB小柱，收集流出液，于45℃下水浴中氮?dú)獯蹈?。分別用1.0mL0.1%(v/v)甲酸水溶液復(fù)溶，觀察復(fù)溶液顏色，結(jié)果表明通過Oasis PRiME HLB柱凈化的溶液最為清澈，且 3種莨菪烷類生物堿回收率最高，詳見表2。

2.3 線性關(guān)系

對 6 份空白米粉樣品進(jìn)行提取凈化并吹干，依次加入用 0.1%加酸水溶液配制成的 0、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg·L-1L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，充分溶解后制得系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，過濾后，在選定的儀器條件下進(jìn)行分析。以測得的各目標(biāo)物定量離子色譜峰面積 y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度 xμg·L-1為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，3種莨菪生物堿在1.0～50.0 μg·L-1內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系， 相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999，結(jié)果見表3。

表3 3種莨菪生物堿的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液線性方程、線性相關(guān)系數(shù)

2.4 方法的靈敏度和精密度

采用在空白米粉中添加目標(biāo)化合物的方法，依據(jù)特征離子色譜峰的 S/N>3為方法的檢出限， S/N>10為方法的定量限，得出阿托品、消旋山莨菪堿、東莨菪堿的檢出限為 0.5 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1。

以空白米粉為樣品，制備添加 1.0、2.0、10.0 μg·kg-13個(gè)水平的樣品進(jìn)行測定，每個(gè)添加水平重復(fù)測定 6個(gè)樣品，連續(xù) 3 d 重復(fù)操作，最終結(jié)果見表4。3種莨菪生物堿在空白米粉中的平均添加回收率為 86.8%～103.3%，日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10%，方法回收率和 RSD均符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范(GB/T27404-2008)的要求。

表4 米粉樣品中3種莨菪生物堿添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 實(shí)際樣品測定

實(shí)驗(yàn)對30例市售米粉、蕎麥面條和高粱面條進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明所有樣品中均未檢出3種莨菪生物堿。這可能與樣品的抽取數(shù)量少及樣品的來源單一有關(guān)，本方法可以作為方法儲(chǔ)備為以后的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測提供有力的技術(shù)保障。

3 結(jié) 語

樣品用80%乙腈提取后，經(jīng)固相萃取柱凈化、高效液相色譜分離、串聯(lián)四極桿質(zhì)譜檢測，成功建立了嬰幼兒谷物食品中3種莨菪生物堿的檢測方法。該方法具有快速簡便、靈敏度高等特點(diǎn)，為其他植物源性食品中莨菪生物堿的檢測提供了有利工具。