甜菜BTB蛋白家族的挖掘與生物信息學分析

劉宇，楊巧，王曉丹，趙春雷，王希，李彥麗，賈海倫，丁廣洲，陳麗

（1.黑龍江大學現(xiàn)代農業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080；2.黑龍江省甜菜工程技術研究中心，哈爾濱 150080；3.國家糖料改良中心，哈爾濱 150080；4.黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150080；5.國家甜菜種質中期庫，哈爾濱 150080）

0 引言

世界糖產量每年約1.6億t，其中甜菜糖占20%左右，人均食糖消費量約為23 kg，由于中國和印度等人口稠密國家生活水平的提高，每年用糖的需求量在不斷增加。盡管甜菜是耐旱作物，但甜菜的生產區(qū)域正面向鹽堿、干旱、冷涼地區(qū)擴展[1]，面臨著嚴重不利外界條件的影響，各種生物脅迫和非生物脅迫都會使甜菜減產。所以，挖掘甜菜的抗性基因非常重要，可以為甜菜的抗性育種提供理論依據。

植物基因組中有許多轉錄因子家族，它們一般通過結合靶基因的啟動子激活或抑制其表達，在調節(jié)植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用[2-3]。BTB（Broad-complex,tramtrack,and bric-à-brac）家族就是這樣的一類轉錄因子，其特征是存在高度保守的BTB結構域，也被稱為POZ（痘病毒鋅指蛋白）結構域[4-5]。BTB蛋白一般由5 個α-螺旋（A1～A5）和3 個β-折疊（B1～B3）組成[6]，這有利于BTB 蛋白與其它蛋白進行互作，如BTB 蛋白能夠與E3 連接酶CULLIN3 相互作用，形成E3 泛素連接酶復合物的一部分參與目標蛋白的泛素化過程[7]。BTB蛋白家族除了包含BTB蛋白結構域外，還存在其他幾種蛋白結構域，如鋅指蛋白（TAZ）、Kelch、BTB和C端Kelch（BACK）、meprin and TRAFhomology（MATH）以及Ankyrin repeats（ANK），從而使BTB蛋白形成了不同亞家族，并發(fā)揮著不同的作用[4-5]。在這些亞家族中，BT-TAZ（BT）蛋白只存在于植物中，它的N 端是BTB 結構域，中心是TAZ結構域，C端是鈣調素結合域（CaMBD）[8-9]。

BTB蛋白在植物生長發(fā)育、抗逆性、蛋白質泛素化和降解、細胞骨架組成、離子通道及細胞周期調控等方面發(fā)揮著重要作用[10-11]?，F(xiàn)有的研究表明，含有BTB蛋白的ATETO1、ATEOL1和ATEOL2蛋白可以調節(jié)乙烯的合成[12]；含有BTB 的BT2 可以介導多種營養(yǎng)物質，并對脅迫和激素做出反應；含有ANK 和BTB 的ATBOP1蛋白，在植物的形態(tài)建成中起著關鍵的作用[13]。根據已有的研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥NPR1（非表達的發(fā)病機制的相關基因1）蛋白含有BTB 結構域，是誘導性系統(tǒng)抗性（ISR）和系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）信號通路的關鍵調節(jié)因子。植物中許多BTB蛋白家族成員參與了激素介導的植物相關信號的調控，如水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA3）[14]。AHT1（ABA-HYPERSENSITIVE BTB/POZ PROTE IN1）是一種含有BTB 的蛋白，對ABA 介導的抑制擬南芥萌發(fā)具有負調控作用[15]。另據報道，擬南芥中6 種BTB/POZ-MATH 蛋白（BPMS）參與ABA 反應，如調節(jié)萌發(fā)和氣孔關閉[16]。ATHB6（Homeobox-leucine zipper 轉錄因子）能負調控ABA 并參與BPMS 的泛素化和降解[15]。近年來，在許多植物物種中發(fā)現(xiàn)了BTB 家族成員，包括擬南芥[8]、水稻[17]、番茄[5]和蘋果[18-19]，但是關于甜菜BTB 家族的報道很少。然而，只有少數(shù)BTB 蛋白在功能上得到了驗證。本研究中，針對甜菜基因組對甜菜的BTB 家族進行挖掘，然后對甜菜的BTB 蛋白家族進行生物信息學分析，為后續(xù)研究其在甜菜的抗逆分子生物學機制中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 甜菜BTB家族基因的挖掘和蛋白的理化性質分析

利用SMART 數(shù)據庫（http://smart.embl-heidelberg.de/）獲得甜菜中所有包含BTB 結構域的蛋白；并通過NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Pfam 數(shù)據庫（http://pfam.sanger.ac.uk/）加以驗證，最終篩選出甜菜的BTB 蛋白家族，并獲得甜菜BTB 蛋白家族的基因序列和蛋白序列。利用擬南芥基因組數(shù)據庫（TAIR，https://www.arabidopsis.org/），獲得擬南芥BTB 基因序列和蛋白序列[20]。使用在線軟件pI/Mw（http://web.expasy.org/protparam/）對所獲得的49個甜菜BTB家族蛋白的理化性質進行分析。

1.2 甜菜BTB家族基因的結構分析

在Ensemblgenomes（http://ensemblgenomes.org/）下載已鑒定的甜菜BTB 家族的DNA 序列和CDS 序列，用GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）制作基因結構圖[21]。

1.3 甜菜BTB蛋白的二級結構和三級結構預測

將獲得的甜菜BTB 蛋白家族的蛋白序列利用SMART、NCBI Conserved Domain search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、Pfam（http://pfam.xfam.org/search）分析，最后利用TBtools預測的甜菜BTB蛋白家族的結構域，利用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）預測蛋白的三級結構。

1.4 甜菜BTB家族基因的染色體定位分析

在Ensemblgenomes（http://ensemblgenomes.org/）獲得基因的位置信息，通過MG2C（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）獲得甜菜BTB家族基因的染色體定位圖。

1.5 甜菜BTB蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

利用Clustal Omega program（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）對甜菜49 個BTB蛋白（BVRBs）及擬南芥80 個BTB蛋白（AtBTBs）進行多序列比對分析后，利用evolview（https://evolgenius.info/evolview-v2/#login）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復次數(shù)為1 000 次[22]，并結合Evolview 構建的甜菜與擬南芥系統(tǒng)發(fā)育樹最終確定蛋白結構域并對其進行分類。

2 結果與分析

2.1 甜菜BTB蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析

對甜菜49 個BTB 蛋白（BVRBs）和擬南芥80 個BTB 蛋白（AtBTBs）的氨基酸序列進行多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，根據文獻報道的擬南芥BTB 蛋白亞家族的分類，甜菜BTB 蛋白被分為9 個亞家族[19-20]：Ankyrin、Armadillo、MATH、NPH3、BACK、TAZ、TPR、BTB-only、Other，在同一亞家族中，甜菜和擬南芥BTB 蛋白的數(shù)量差異較大。其中NPH3 亞家族的數(shù)量最多，包含16 個甜菜BTB 家族基因，30 個擬南芥BTB 家族基因；TPR亞家族的數(shù)量最少，只包含1個甜菜BTB家族基因，3個擬南芥BTB家族基因（圖1）。

圖1 甜菜與擬南芥BTB家族的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of BTB family in Beta vulgaris L.and Arabidopsis thaliana

2.2 甜菜BTB蛋白的理化性質分析

由表1可以看出49個蛋白編碼的氨基酸數(shù)目為139～1 120個，其中BVRB_007930包含的氨基酸數(shù)目最多，為1 120 個，BVRB_3g058930 最少，只有139 個；49 個蛋白的等電點范圍在4.70～9.51，除了TAZ 亞家族與NPH3 亞家族部分的蛋白，其他家族等電點都分布在4.70～7.89，說明甜菜BTB 家族編碼的氨基酸大多數(shù)都為酸性氨基酸；除BVRB_7g159950、BVRB_05090外，其他蛋白的平均親疏水性都為負值，說明甜菜BTB蛋白家族大部分屬于親水性蛋白；49個BTB蛋白的磷酸化位點數(shù)目分布在3～25個，不同蛋白磷酸化位點數(shù)目差異很大，從3種磷酸化位點的數(shù)目上看，絲氨酸磷酸化位點數(shù)目最多，蘇氨酸磷酸化位點次之，酪氨酸最少；亞細胞定位預測的結果顯示，甜菜BTB 家族的大部分蛋白位于細胞核（36 個），剩余的蛋白分別位于細胞膜和葉綠體上；49 個蛋白的分子量為15 848.66～124 344.33 Da，除少數(shù)蛋白分子量過大或過小，大部分蛋白分子量范圍在50 000～80 000 Da。

表1 甜菜BTB 蛋白家族的理化性質分析Table 1 Physical and chemical properties of BTB protein family in sugar beet

續(xù)表1 Continued Table 1

2.3 甜菜BTB家族基因結構分析

甜菜BTB家族不同亞族的基因結構存在較大的差異，比如Other亞家族的基因結構較簡單，大部分成員都不含內含子；Armadillo 亞家族的內含子數(shù)量最多，含有18 個內含子；BACK 亞家族的內含子長度較長（圖2）。

圖2 甜菜BTB蛋白家族的基因結構Fig.2 The genetic structure of BTB protein family genes in sugar beet

2.4 甜菜BTB蛋白的二級結構與三級結構分析

結構域預測的結果顯示，甜菜BTB蛋白家族大多數(shù)含有2～3個結構域（圖3），不同的結構域可以行使不同的功能，說明甜菜BTB蛋白家族的功能具有多樣性。三級結構預測的結果顯示，甜菜BTB蛋白家族以α螺旋和β折疊為主（圖4），但不同亞家族的結構域數(shù)量存在著差異，這也是不同亞家族功能差異的原因之一。

圖3 甜菜BTB蛋白家族的結構域分析Fig.3 Domain analysis of BTB protein family in sugar beet

圖4 甜菜BTB亞家族蛋白的三級結構預測Fig.4 Prediction of tertiary structure of sugar beet BTB subfamily protein

2.5 甜菜BTB家族基因染色體定位分析

由甜菜49個BTB基因的染色體定位（圖5）可看出，甜菜BTB家族成員呈不均勻分布，其成員主要分布在5、6、7號染色體上，而1、3、8號染色體上分布的基因最少，只含有2個BTB成員。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在5號和6號染色體上的BTB家族成員呈區(qū)域性分布，主要集中在染色體上的某段區(qū)域。

圖5 甜菜BTB蛋白家族基因的染色體定位Fig.5 The chromosome location of BTB protein family genes in sugar beet

3 討論與結論

目前在玉米中鑒定出BTB 家族蛋白70 條[23]，擬南芥中鑒定出80 個BTB 蛋白，水稻中鑒定出149 個BTB蛋白[6,17]，說明不同物種間BTB 蛋白數(shù)量存在較大差異。本研究從SMART 數(shù)據庫中共篩選到49 條完整的甜菜BTB 家族蛋白，并通過相關生物信息學工具對其進行了生物信息學分析。本研究結果表明：（1）將甜菜BTB的家族蛋白和擬南芥BTB的家族蛋白通過聚類分析法構建了系統(tǒng)進化樹，由于BTB家族的保守性，具有相似或者相同功能的基因位于同一組，可以分為Ankyrin、Armadillo、MATH、NPH3、BACK、TAZ、TPR、BTBonly、Other亞家族，同時也說明BTB 家族在進化上一直趨于保守，我們可以利用BTB家族的保守性來推測甜菜BTB 家族的功能。（2）不同亞族蛋白的染色體結構、結構域都存在著差異，染色體結構與基因的表達有關，結構域與蛋白的功能行使有關，推測各個亞族的功能有所不同。對49 個蛋白的理化性質分析結果表明，不同組別蛋白在編碼氨基酸數(shù)目、平均等電點等方面存在差異，這也可能決定了不同組別蛋白執(zhí)行不同生物學功能。（3）蛋白的磷酸化是調節(jié)和控制蛋白質活力和功能的重要機制，在細胞信號轉導過程中起著重要作用，有相關報道表明一些蛋白及其它轉錄因子蛋白可以通過磷酸化提高植物的抗逆能力[24]。本研究中49 個蛋白含有3～25 個磷酸化位點，說明每個BTB 蛋白的部分或全部磷酸化位點都有可能被特定的蛋白激酶磷酸化，從而響應外界的各種生物和非生物脅迫。（4）對49個甜菜BTB 蛋白的亞細胞定位預測結果表明，其中的36 個定位于細胞核上，其余的分別定位于葉綠體、細胞膜中，說明大多數(shù)蛋白都是在細胞核中對下游基因進行轉錄調控，以適應外界的環(huán)境變化，而定位在其它部位的蛋白則需通過進一步試驗來確定其功能。（5）染色體定位結果表明，甜菜BTB家族在甜菜的所有染色體上都存在，主要集中在5～7號染色體上，說明BTB家族廣泛參與甜菜的生理活動，是維持甜菜正常生命活動必不可少的蛋白家族。

近年來，有越來越多關于BTB蛋白參與植物應激反應的報道[2,25]，但甜菜BTB家族的報道很少，所以對甜菜BTB家族的研究還有很大的前景。BTB蛋白對植物的發(fā)育和抗逆性起著重要的作用，比如，BTB成員在配子體的發(fā)育[9]、激素和糖信號傳導[26]、葉衰老[27]、防御反應[28-29]和非生物應激反應[2]，包括鐵穩(wěn)態(tài)在內的營養(yǎng)[16]和硝酸鹽吸收中[25,30]都起著至關重要的作用。而且越高等的植物所含的BTB 蛋白越多，比如BTB 蛋白廣泛存在于高等開花植物和低等單細胞植物中，相反，單細胞藻類，特別是細小微胞藻（Micromonas pusilla）和綠色鞭毛藻（Ostreococcus lucimarinus），只能編碼較少的BTB 蛋白[31]。本文通過對甜菜BTB 家族的生物信息學分析，可為甜菜BTB 家族在冷、鹽、干旱脅迫與生長發(fā)育，以及生物脅迫反應中的功能及表達研究奠定基礎，下一步可先觀察BTB家族與甜菜的哪些抗性生理有關，然后對甜菜BTB家族進行克隆及功能驗證。