甜菜銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BvAMT1-3基因的克隆及生物信息學(xué)分析

魏多，劉銘曦，高卓，李佳佳，劉大麗，馬龍彪

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱 150080；3.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150025；4.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引言

氮素（N）是植物所需的一種重要營養(yǎng)物質(zhì)，在植物生長發(fā)育中起關(guān)鍵作用。氮是植物體內(nèi)許多重要有機(jī)化合物的組分，也是遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)[1]。氮不僅是蛋白質(zhì)、核酸、核蛋白、葉綠素和許多酶的組成成分，同時(shí)也參與合成一些維生素，生物堿和植物激素中也都含有氮[2-4]。植物吸收的氮素以銨態(tài)氮（）和硝態(tài)氮（）的形式為主，由于植物對(duì)兩種氮素的吸收和代謝水平不同，會(huì)使吸收不同氮素的植物在生長發(fā)育過程中產(chǎn)生較為明顯的差異[5]。植株體內(nèi)氮素的同化產(chǎn)物和營養(yǎng)水平也會(huì)對(duì)銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（AMT）的活性產(chǎn)生影響[6]。研究表明，同化銨態(tài)氮需要的能量低于硝態(tài)氮，因此植物缺氮時(shí)會(huì)優(yōu)先吸收銨態(tài)氮，而植物主要通過調(diào)控AMT 的合成來調(diào)控對(duì)氮的吸收[7-8]。農(nóng)作物根部銨轉(zhuǎn)運(yùn)因子的過度表達(dá)，對(duì)農(nóng)作物的生長有積極的影響，例如在微型番茄根部使AMT過表達(dá)，一方面可以提高農(nóng)作物的質(zhì)量，另一方面也能提高作物抵抗低氮脅迫的能力[9]。如今大多數(shù)銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要屬于AMT1和AMT2兩個(gè)基因家族[10]。

目前已經(jīng)從擬南芥、水稻、番茄、百脈根、油菜、山楊、苜蓿、綠藻、小麥、大豆、高粱等作物中都發(fā)現(xiàn)了銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的存在[11]。研究表明，擬南芥中含有6 個(gè)AMT基因，水稻里最少有12 個(gè)AMT基因[12]。AMT基因家族的表達(dá)活性受不同氮素形態(tài)和銨濃度的影響，當(dāng)NH4+濃度過高時(shí)會(huì)抑制植物葉片和根系的生長[13]。同時(shí)，缺氮也會(huì)對(duì)植物AMT基因的表達(dá)造成一定的影響。在低氮脅迫3 d 后，擬南芥中AtAMT1-1和AtAMT1-3的表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)[14-15]。

氮肥對(duì)作物的生長、產(chǎn)量和品質(zhì)起著重要作用，增加氮肥的施用量是提高產(chǎn)量的一個(gè)重要途徑[16-17]，但增施氮肥的同時(shí)也增加了環(huán)境污染[16,18]。因此，為了對(duì)銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的研究，提高氮素利用率，本試驗(yàn)利用RT-PCR方法克隆了甜菜BvAMT1-3基因，并采用生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)對(duì)該基因進(jìn)行了較為全面的分析，以期為培育對(duì)氮素吸收和利用效率高的甜菜品種及為BvAMT基因后續(xù)功能的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甜菜‘780016B/12 優(yōu)’，從國家甜菜種質(zhì)資源中期庫取得。準(zhǔn)備4 片真葉期的甜菜葉片組織來提取總RNA以供后續(xù)的試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取

采用Trizol（Invitrogen）法，從1 g 甜菜的葉片組織中提取得到總RNA。利用紫外分光光度計(jì)NavoVue plus在OD260和OD280下測(cè)定RNA 濃度及純度。1.0%Agarose electrophoresis進(jìn)一步檢測(cè)RNA的質(zhì)量。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA及PCR擴(kuò)增

取3μg總RNA，利用First strand cDNA synthesis kit（TOYOBO）將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)甜菜Beta vulgaris ammonium transporter 1-3（BvAMT1-3,LOC104899971）基因的堿基序列分別設(shè)計(jì)引物如下：

以cDNA 為模板，利用KOD-Plus-Neo高保真酶（TOYOBO）PCR擴(kuò)增該基因CDS全長。

1.2.3 克隆載體的構(gòu)建及目的基因鑒定

取2μLPCR 產(chǎn)物，于25 ℃連接到載體pEASY-Blunt 上，把連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入T1 感受態(tài)細(xì)胞，在含有IPTG 和X-gal的平板培養(yǎng)基進(jìn)行Amp抗性篩選，選擇陽性重組子質(zhì)粒DNA，利用BamHI和XhoI進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切和PCR 鑒定。把所獲得的電泳結(jié)果無誤差的樣品送至上海生工生物工程公司測(cè)序。將所得到的質(zhì)粒DNA 溶液置于-20 ℃保存用于進(jìn)一步試驗(yàn)。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

利用NCBI 的ORF finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析BvAMT1-3的開放閱讀框和CDS，運(yùn)用在線軟件pfam（http://pfam.xfam.org/）預(yù)測(cè)該基因所編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。Expasy 網(wǎng)站的Prot-Param（https://web.expasy.org/）在線計(jì)算氨基酸理化性質(zhì)，各項(xiàng)指標(biāo)包括：氨基酸數(shù)目、分子量、理論等電點(diǎn)和不穩(wěn)定指數(shù)。用NCBI 中的在線軟件BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行同源性分析。利用SignalP5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。通過TMHMM2.0 在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域。利用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行親疏水性的預(yù)測(cè)，通過PSORT（https://www.genscript.com/psort.html）預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.2.5 甜菜BvAMT1-3蛋白系統(tǒng)發(fā)生分析

將候選甜菜AMT 家族蛋白序列與擬南芥、菠菜、黃花蒿、番茄和水稻AMT 家族序列用ClustalX 和MEGA6.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)和Neighbor-Joining進(jìn)化樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜菜BvAMT1-3基因的克隆

根據(jù)Beta vulgaris ammonium transporter 1-3（BvAMT1-3，LOC104899971）基因的堿基序列，設(shè)計(jì)該基因CDS 兩端的特異性引物，并在起始密碼子和終止密碼子兩端分別引入BamHI 和XhoI 酶切位點(diǎn)。利用特異性引物來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在1.39 kb左右的位置獲得了BvAMT1-3目的條帶（圖1）。將此PCR產(chǎn)物與Marker顯示的標(biāo)準(zhǔn)條帶對(duì)比發(fā)現(xiàn)位置無誤，可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 BvAMT1-3 PCR擴(kuò)增電泳Fig.1 PCR amplification of BvAMT1-3 gene

將BvAMT1-3基因與克隆載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T1中，轉(zhuǎn)化完成后，采用藍(lán)白斑篩選與抗性篩選得到陽性克隆，并對(duì)所得的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，雙酶切后電泳檢測(cè)，表明在1%Agarose 凝膠的3.93 kb和1.39 kb 的位置上，獲得了相對(duì)應(yīng)于載體pEASY-Blunt 和目的基因片段BvAMT1-3的條帶（圖2）。通過與Marker標(biāo)準(zhǔn)條帶對(duì)比發(fā)現(xiàn)位置無誤差，可判斷連接正確。

圖2 pEASY-Blunt-BvAMT1-3重組質(zhì)粒的鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid of pEASYBlunt-BvAMT1-3

2.2 甜菜BvAMT1-3基因生物信息學(xué)分析

2.2.1 甜菜BvAMT1-3基因的序列分析

甜菜BvAMT1-3基因的CDS 全長為1 388 bp，編碼462 個(gè)氨基酸（圖3）。根據(jù)ProtParam 分析計(jì)算，該基因所編碼蛋白的分子量為49.729 kDa，等電點(diǎn)（Theoretical pI）為5.30。不穩(wěn)定系數(shù)分析表明，蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)（Instability index）小于40，屬于穩(wěn)定蛋白。根據(jù)SignalP-5.0 分析該蛋白沒有信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白。利用在線軟件SOPMA 和POSRT 對(duì)甜菜BvAMT1-3 二級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，結(jié)果表明BvAMT1-3蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)上，以α-螺旋為主，占44.16%，其次為無規(guī)則卷曲，占27.49%，而延伸鏈結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角所占比例較小（表1）。通過對(duì)甜菜BvAMT1-3基因跨膜結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)BvAMT1-3 含有9 個(gè)跨膜螺旋區(qū)，屬于跨膜蛋白（圖4），存在一個(gè)Ammonium transport保守結(jié)構(gòu)域，位置在15～442 aa（圖5）。

圖3 甜菜BvAMT1-3基因序列信息Fig.3 Gene sequence of Beta vulgaris BvAMT1-3

續(xù)圖3 甜菜BvAMT1-3基因序列信息Continued Fig.3 Gene sequence of Beta vulgaris BvAMT1-3

圖4 BvAMT1-3蛋白的跨膜螺旋區(qū)分析Fig.4 Transmembrane helix region analysis of BvAMT1-3 protein

圖5 甜菜BvAMT1-3蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.5 Conserved domain assay of BvAMT1-3 protein

表1 BvAMT1-3 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和亞細(xì)胞定位Table 1 Secondary structure and subcellular localization of BvAMT1-3 protein

2.2.2 BvAMT1-3蛋白的親水性和疏水性預(yù)測(cè)

用ProtScale軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行疏水性/親水性分析，正值越大表示越疏水，負(fù)值越大表示越親水，介于+0.5～-0.5 之間的主要為兩性氨基酸。結(jié)果表明，BvAMT1-3 蛋白的疏水區(qū)域大于親水區(qū)域（圖6），預(yù)測(cè)該蛋白為疏水蛋白，這與ProtParam分析結(jié)果一致。

圖6 BvAMT1-3蛋白親疏水性預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of hydrophilicity and hydrophobicity of BvAMT1-3 protein

2.2.3 甜菜BvAMT1-3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

將甜菜BvAMT1-3 的氨基酸序列提交到SWISSMODEL 在線軟件，采用同源建模法，預(yù)測(cè)該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖7）。結(jié)果顯示，該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲、延伸鏈和α-螺旋構(gòu)成，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

圖7 BvAMT1-3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.7 Prediction for tertiary structure of BvAMT1-3 protein

2.2.4 甜菜BvAMT1-3基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

轉(zhuǎn)錄因子通過與啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用原件結(jié)合從而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，為進(jìn)一步預(yù)測(cè)甜菜BvAMT1-3基因可能潛在的功能，利用Plantcare在線軟件對(duì)甜菜BvAMT1-3基因啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，該基因共預(yù)測(cè)到了5 類順式作用元件（圖8），包含有參與干旱誘導(dǎo)、赤霉素、胚乳表達(dá)、光反應(yīng)、MeJA（茉莉酸乙酯）反應(yīng)等順式作用元件。

圖8 甜菜BvAMT1-3基因啟動(dòng)子區(qū)域分析Fig.8 Promoter region analysis of BvAMT1-3 gene

2.2.5 甜菜AMTs基因系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

通過系統(tǒng)進(jìn)化樹可以進(jìn)一步分析不同物種間AMTs基因家族的親緣關(guān)系，對(duì)選取的5 個(gè)甜菜AMTs、4 個(gè)黃花蒿AMTs、6 個(gè)擬南芥AMTs、4 個(gè)菠菜AMTs、5 個(gè)番茄AMTs和9 個(gè)水稻AMTs基因的氨基酸序列，利用MEGA7.0 進(jìn)行多重序列比對(duì)構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖9）。結(jié)果表明，來源于甜菜、擬南芥、菠菜、黃花蒿、番茄和水稻中的總共33 個(gè)AMTs基因被劃分為AMT1、AMT2 和AMT3 這3 個(gè)亞族，其中甜菜的5 個(gè)AMT基因分為AMT1和AMT3兩個(gè)亞家族。其中，僅有BvAMT3-3單獨(dú)位于AMT3亞家族；包括BvAMT1-3在內(nèi)的其余4個(gè)基因均為AMT1 亞家族。目的基因BvAMT1-3和SoAMT1-3聚為同一分支，表明BvAMT1-3與SoAMT1-3同源性較高。

圖9 甜菜與其它物種之間的AMT基因家族進(jìn)化樹Fig.9 Phylogenetic tree of the AMT genes family between Beta vulgaris and other species

3 討論與結(jié)論

甜菜作為我國主要的產(chǎn)糖作物，被廣泛種植于我國東北、西北和華北地區(qū)，是繼甘蔗之后的第二大產(chǎn)糖作物[19]。糖的作用是多方面的，除了能作為食物提供能量參與人體的日常代謝外，也普遍應(yīng)用于食品、釀酒、藥品生產(chǎn)等工業(yè)。氮素是植物生長發(fā)育所需的一種重要營養(yǎng)物質(zhì)，氮素是決定甜菜含糖的一個(gè)重要因素，甜菜通過銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（AMTs）調(diào)控對(duì)銨態(tài)氮的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。

銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)銨態(tài)氮在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制主要是通過H+-ATP供給的細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透差。AMTs不僅介導(dǎo)植株對(duì)的吸收，同時(shí)也調(diào)控的外排，通過這一機(jī)制來維持植物體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)[20]。而又可以通過反饋調(diào)節(jié)調(diào)控AMTs 的活性來控制植株氮代謝的平衡[21]。為了預(yù)測(cè)該基因的結(jié)構(gòu)和特性，本研究利用RT-PCR技術(shù)克隆了BvAMT1-3基因，并運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)該基因進(jìn)行了初步的分析。分析結(jié)果表明，甜菜中BvAMT1-3基因編碼462個(gè)氨基酸，介于431～532個(gè)，這與之前大多數(shù)植物AMT 蛋白氨基酸個(gè)數(shù)的研究結(jié)果相一致[22]。蛋白質(zhì)的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角是二級(jí)結(jié)構(gòu)中的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，是判斷蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定與否的關(guān)鍵，而無規(guī)則卷曲具有不穩(wěn)定性，甜菜BvAMT1-3蛋白中α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角所占的比例大于無規(guī)則卷曲，因此說明該蛋白為穩(wěn)定蛋白，也印證了理化性質(zhì)分析的結(jié)果正確。BvAMT1-3基因存在Ammonium transport 保守結(jié)構(gòu)域，這保證了BvAMT1-3 蛋白在轉(zhuǎn)運(yùn)銨鹽中發(fā)揮穩(wěn)定的作用。對(duì)甜菜中5 個(gè)AMTs基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，甜菜BvAMT1-3基因與菠菜SoAMT1-3具有高度同源性，這一結(jié)果可能與植物進(jìn)化史長久以來甜菜與菠菜的進(jìn)化有關(guān)。對(duì)BvAMT1-3基因啟動(dòng)子順式作用元件的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，含有參與干旱誘導(dǎo)、生長素、胚乳表達(dá)、光反應(yīng)、茉莉酸乙酯反應(yīng)等順式作用元件，說明該基因可能對(duì)甜菜生長和抗逆境脅迫有重要意義。

甜菜BvAMT1-3基因?qū)儆贏MT1亞族，有報(bào)道表明，在AMT基因中存在特定的保守磷酸化位點(diǎn)。這種磷酸化位點(diǎn)在水稻和擬南芥的AMT1 家族中都被發(fā)現(xiàn)存在，其中有6 個(gè)保守磷酸化位點(diǎn)存在于擬南芥At-AMT1-1基因中[23]。通過對(duì)擬南芥AtAMT1-1的研究發(fā)現(xiàn)其中含有8 個(gè)蛋白激酶C 磷酸化位點(diǎn)和3 個(gè)酪蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)[24]。這些磷酸化位點(diǎn)的存在保證了AMT1蛋白在銨態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)過程中與植物體內(nèi)各器官之間的信號(hào)傳導(dǎo)。研究表明，水葫蘆EcAMT1在受到氮脅迫時(shí)的表達(dá)量會(huì)上調(diào)，棉花根系中GhAMT1-3表達(dá)量在低氮處理3d后升高，這與擬南芥、水稻、番茄和百脈根中的AMT1受氮脅迫而促進(jìn)表達(dá)相匹配[25-26]，表明氮脅迫可能會(huì)促進(jìn)AMT1家族的基因表達(dá)。亞細(xì)胞定位顯示其位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，具有一定的轉(zhuǎn)運(yùn)功能。由此推斷，該基因編碼的蛋白可能會(huì)作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與到甜菜對(duì)氮素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)網(wǎng)絡(luò)中，在受到氮脅迫時(shí)，該基因的表達(dá)量上調(diào)，增加植株對(duì)銨態(tài)氮的吸收從而降低甜菜受氮脅迫的損害。

目前對(duì)甜菜銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究還處于起步階段，通過對(duì)甜菜BvAMT1-3基因進(jìn)行克隆和進(jìn)行生物信息學(xué)分析，可以對(duì)甜菜銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能進(jìn)行初步研究，為深入了解甜菜銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在氮脅迫下轉(zhuǎn)運(yùn)銨態(tài)氮的分子機(jī)制和今后的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。