細(xì)顆粒物通過誘導(dǎo)小鼠γδT/Th17細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-17A加劇肺部炎癥

侯文肖，吳依娜，叢魯紅，李 濤，張洪春，段 軍★

（1.中日友好醫(yī)院 外科重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，北京100029；3.中日友好醫(yī)院 教育處，北京 100029；4.中日友好醫(yī)院 保健醫(yī)療部，北京 100029）

近年來，空氣環(huán)境污染對(duì)人類健康的影響越來越大，尤其是大氣顆粒物的影響已成為一個(gè)嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問題[1]。并且在過去的幾十年里，很多證據(jù)表明大氣顆粒物能夠誘發(fā)、加劇呼吸道疾病，如哮喘、慢阻肺、肺纖維化、甚至癌癥[2，3]。其實(shí)，細(xì)顆粒物（PM2.5）是能夠引起氣道傷害的主要空氣污染物[4]。它可以通過影響機(jī)體免疫系統(tǒng)導(dǎo)致炎性介質(zhì)的過度釋放及炎性因子聚集，產(chǎn)生炎性反應(yīng)擾亂肺組織局部微環(huán)境的穩(wěn)定，進(jìn)而造成組織損傷并且降低機(jī)體防御功能及修復(fù)能力?，F(xiàn)有證據(jù)表明[5，6]，白細(xì)胞介素17A（IL-17A）參與了肺損傷，但其對(duì)PM2.5 誘導(dǎo)的肺損傷作用機(jī)制仍然未知。在此，我們將明確IL-17A 在PM2.5 導(dǎo)致的肺損傷機(jī)制中可能產(chǎn)生的作用，并探討PM2.5 誘導(dǎo)的肺損傷小鼠模型中分泌IL-17A 的關(guān)鍵細(xì)胞類型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30 只C57BL/6J 雄性小鼠，6～7 周齡，體重20～30g，購(gòu)買自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

15 只IL-17A 基因敲除 （IL-17A-/-）C57BL/6J雄性小鼠6～8 周齡，體重25～35g，購(gòu)買自賽業(yè)（廣州） 生物科技有限公司。飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（SPF 級(jí)）。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中日友好醫(yī)院研究倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)過程符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究管理規(guī)定。

1.2 造模與分組

將15 只野生型小鼠作為對(duì)照組，另外15 只野生型小鼠和15 只IL-17A-/-小鼠作為實(shí)驗(yàn)組。將濃度為2mg/ml 的PM2.5 以氣管內(nèi)滴注方式進(jìn)行造模，造模持續(xù)9d，每3d 進(jìn)行一次氣管內(nèi)滴注，每只小鼠50μl。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組野生型、IL-17A-/-中各5 只小鼠分別在模型構(gòu)建的第3d、6d、9d 處死；然后將其肺組織和肺泡灌洗液進(jìn)行病理染色、RT-qPCR、流式和ELISA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Graphpad Prism 5 軟件作圖；計(jì)量資料符合正態(tài)分布，表示為χ±s。組間比較采用方差分析進(jìn)行兩兩比較；對(duì)于計(jì)量資料不符合正態(tài)性及方差齊性分布，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5 可刺激小鼠肺組織中γδT 和Th17 細(xì)胞數(shù)量增加（圖1，見封三）

圖1 A.實(shí)驗(yàn)組野生型小鼠和對(duì)照組小鼠肺組織的HE染色分析（×400）。B.肺泡灌洗液分析，左圖示總細(xì)胞數(shù)，右圖示中性粒細(xì)胞數(shù)，* 與對(duì)照組相比，P ＜0.05。C～F.流式細(xì)胞術(shù)分析在PM2.5造模后的第3d、6d、9d時(shí)IL-17A+細(xì)胞的數(shù)目。* 與第3d相比，P ＜0.05，# 與第6d相比，P ＜0.05。

在實(shí)驗(yàn)組野生型小鼠中，肺組織經(jīng)HE 染色后顯示被大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1A）。通過對(duì)肺泡灌洗液細(xì)胞統(tǒng)計(jì)分析提示：全細(xì)胞數(shù)量增加，中性粒細(xì)胞顯著增加（P＜0.05，圖1B）。在PM2.5 造模后的第3d、6d、9d，實(shí)驗(yàn)組野生型小鼠肺組織中γδT 和Th17 細(xì)胞的含量逐漸增加，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05，圖1D～1F），而對(duì)照組小鼠肺組織中γδT 和Th17 細(xì)胞的含量變化則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，圖1C、1E 和1F）。

2.2 PM2.5 可通過誘導(dǎo)小鼠肺組織中γδT 和Th17 細(xì)胞增加，刺激分泌IL-17A（圖2，見封三）

研究表明γδT 和Th17 細(xì)胞都可以分泌IL-17，Th17細(xì)胞在2005年被發(fā)現(xiàn)和命名，是在TGF-β 和IL-6 的共同誘導(dǎo)下由CD4+T 細(xì)胞分化而來，它最重要的效應(yīng)因子就是IL-17A[7～9]。因此，我們使用RT-qPCR 方法在實(shí)驗(yàn)組野生型模型建立的第3d、6d、9d 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組小鼠Th17 的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Th17 的mRNA 表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)（P＜0.05，圖2A）。通過ELISA 檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組野生型小鼠肺泡灌洗上清液中炎性因子IL-1β和TNF-α 的含量，結(jié)果表明與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組野生型小鼠在造模后第9d，IL-17A、IL-1β 和TNF-α 的含量顯著增加（P＜0.05，圖2B、2C）。同時(shí)，還應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)了2 組小鼠TNF-α 和IL-1β 的mRNA 表達(dá)水平（P＜0.05，圖2D），這也證實(shí)了ELISA 的結(jié)果。通過對(duì)IL-17A-/-小鼠肺組織HE 染色研究表明，與造模第9d 的實(shí)驗(yàn)組野生型小鼠相比，IL-17A-/-組小鼠肺組織中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少（圖2E）。與第9d 實(shí)驗(yàn)組野生型小鼠相比，IL-17A-/-組小鼠肺泡灌洗上清液中IL-1β 和TNF-α 的含量顯著降低（P＜0.05，圖2F），全細(xì)胞數(shù)量及中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.05，圖2G），并且TNF-α 和IL-1β 的mRNA 表達(dá)水平呈明顯降低趨勢(shì)（P＜0.05，圖2H）。

3 討論

近年來，流行病學(xué)數(shù)據(jù)[10]已經(jīng)表明，肺、心血管疾病以及癌癥的發(fā)病率和死亡率與我們?nèi)粘Ｉ钪車h(huán)境中PM2.5 的濃度有關(guān)，同時(shí)也帶來了較重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。并且即使短期內(nèi)PM2.5 濃度的升高也可能導(dǎo)致死亡率和發(fā)病率的增加[11]。PM2.5 通過沉降和擴(kuò)散過程沉積在肺實(shí)質(zhì)中，特別是肺泡中，也可以通過循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)心、肝、脾、腦[12]，導(dǎo)致全身多器官受損。因此，本實(shí)驗(yàn)研究旨在證明PM2.5 誘導(dǎo)肺部炎癥反應(yīng)的細(xì)胞機(jī)制。

組織損傷的炎癥反應(yīng)中，在巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞等抗原提成細(xì)胞作用下，輔助性T 細(xì)胞（Th 細(xì)胞）被激活，開啟細(xì)胞免疫。眾所周知，Th 細(xì)胞表面標(biāo)志物為CD4。初始CD4+T 細(xì)胞接受抗原刺激后，在不同的條件下可分化成不同亞型的T 細(xì)胞，執(zhí)行不同功能，如Th1 細(xì)胞、Th2 細(xì)胞。Th17細(xì)胞在21 世紀(jì)初被發(fā)現(xiàn)和命名，其與Th1 細(xì)胞、Th2 細(xì)胞不同，是在TGF-β 和IL-6 的共同誘導(dǎo)下由CD4+T 細(xì)胞分化而來。Th17 細(xì)胞主要分泌IL-17A（IL-17）、IL-17F、IL-21、IL-22，其中最重要的效應(yīng)因子是IL-17A[7]。IL-17A 具有強(qiáng)大的致炎性，參與腫瘤、感染和自身免疫性疾病等多種炎癥性疾病，其受體IL-17R 表達(dá)多種細(xì)胞表面，如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。IL-17A 與受體（IL-17R）結(jié)合后，可通過MAPK、NF-κB、ERK 等通路[8，9]，刺激多種細(xì)胞分泌多種促炎因子，如IL-6、IL-8、GM-CSF，從而導(dǎo)致炎癥的放大。但是，最近的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Th17細(xì)胞不是IL-17A 的唯一來源。IL-17A 也能夠由γδT 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和CD8 T 細(xì)胞分泌。

近年研究報(bào)道，IL-17A 參與肺臟損害，包括在哮喘、肺炎、慢性阻塞性肺疾病中[3，7，9，10]。Th17細(xì)胞來源的IL-17A 增加氣道高反應(yīng)性、加重哮喘[13]。在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中，IL-17A被認(rèn)為是纖維化過程高度依賴的分子[14]。國(guó)內(nèi)學(xué)者在既往研究COPD 的肺損傷模型中發(fā)現(xiàn)，肺組織中IL-17A 顯著升高，同時(shí)觀察到肺組織中γδT+細(xì)胞浸潤(rùn)增加[15]。在腎臟纖維化研究中，敲除IL-17A 基因后，病灶處的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，并且證明γδT+和Th17 細(xì)胞是IL-17A 共同的細(xì)胞來源，同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)證明IL-17A 劑量依賴性的促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞遷移。

我們發(fā)現(xiàn)，PM2.5 促進(jìn)γδT/ Th17 細(xì)胞中IL-17A 的分泌并加劇炎癥反應(yīng)。而且已知IL-17A 在肺損傷過程中存在大量表達(dá)[15，16]。有證據(jù)表明，γδT 細(xì)胞和Th17 細(xì)胞均分泌IL-17A，從而加劇炎癥反應(yīng)[16]。感染初期產(chǎn)生IL-17A 的最多是γδT細(xì)胞，這時(shí)Th17 細(xì)胞對(duì)IL-17A 主要起到一定保護(hù)性作用。Baldeviano 等[17]發(fā)現(xiàn)，IL-17A 能夠刺激擴(kuò)張型心肌病的發(fā)展，若抑制IL-17A 可以減少由心肌炎引起的心肌纖維化。Smith 等[18]人的研究發(fā)現(xiàn)，阻斷IL-17A 可以降低ApoE2/2 小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生率，Wilson 等[19]人也證明了BLM介導(dǎo)的肺纖維化依賴于IL-17A。

綜上所述，這項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明了PM2.5可以通過誘導(dǎo)小鼠γδT 和Th17 細(xì)胞分泌IL-17A，從而加劇肺部炎癥反應(yīng)。對(duì)于PM2.5 誘發(fā)和加重的多種呼吸系統(tǒng)疾病，目前還缺乏有效的防治手段。但我們對(duì)IL-17A 導(dǎo)致的肺損傷作用有了新的認(rèn)識(shí)，可針對(duì)PM2.5 誘發(fā)的肺部疾病尋求新的干預(yù)措施。有研究[20，21]發(fā)現(xiàn)固本止咳中藥可以減少肺組織中γδT 和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，為我們下一步研究中醫(yī)藥干預(yù)PM2.5 導(dǎo)致的肺損傷指明了方向。筆者認(rèn)為，深入而系統(tǒng)地研究空氣污染尤其是PM2.5 所致人體危害，特別是呼吸系統(tǒng)危害，具有重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值，對(duì)減輕社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)亦有積極作用。