茶尺蠖觸角高豐度氣味結(jié)合蛋白EoblOBP9、EoblOBP11的配基結(jié)合功能和模式差異研究

嚴(yán)玉婷，吳帆，張亞麗，傅曉斌，崔宏春，韓寶瑜，李紅亮

茶尺蠖觸角高豐度氣味結(jié)合蛋白OBP9、OBP11的配基結(jié)合功能和模式差異研究

嚴(yán)玉婷1，吳帆1，張亞麗2，傅曉斌1，崔宏春3，韓寶瑜1，李紅亮1*

1. 中國計量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州 310018；2. 中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江 杭州 310016；3. 杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024

茶尺蠖（Prout）是茶園重要的鱗翅目害蟲，雄雌成蟲能通過嗅覺系統(tǒng)感受和分辨外界環(huán)境的化學(xué)信息以助于其交尾和產(chǎn)卵地選擇等行為。在此過程中，成蟲觸角高豐度表達(dá)的氣味結(jié)合蛋白（Odorant-binding proteins，OBPs）可能發(fā)揮了重要作用。以茶尺蠖成蟲觸角高豐度表達(dá)的兩個OBPs即OBP9和OBP11為對象，首先發(fā)現(xiàn)二者cDNA編碼蛋白均含有OBPs家族的典型特征，即含有6個保守的半胱氨酸，等電點預(yù)測分別為酸性和堿性，表明二者在一級結(jié)構(gòu)性質(zhì)上存在差異；利用原核表達(dá)技術(shù)獲得重組蛋白，并免疫小鼠制備相應(yīng)的多克隆抗體，再利Western blot技術(shù)驗證了二者在雄性成蟲觸角特異表達(dá)；通過熒光競爭結(jié)合實驗分別測試二者與20種候選配基的結(jié)合力，結(jié)果表明二者均與兩個性信息素成分（順3,9-環(huán)氧-6,7-十八碳二烯與順-3,6,9-十八碳三烯）及一種植物揮發(fā)物成分（反-2-己烯醛）呈現(xiàn)較強的親和力。與此同時，二者也顯示出不同的配基結(jié)合譜，如OBP9與1-戊烯-3-醇、苯甲醇、苯乙酮和苯甲醛親和力較強，結(jié)合譜較寬；而OBP11與-萜品醇親和力較強，結(jié)合更顯專一，分子對接結(jié)果也支持該結(jié)論。此外，預(yù)測二者的活性位點均位于C端，也顯示出二者配基結(jié)合的共性。研究結(jié)果表明，盡管這兩個茶尺蠖OBPs均在成蟲觸角高豐度特異表達(dá)，但無論從結(jié)構(gòu)性質(zhì)上還是生化結(jié)合譜上，既有保守性又存在差異性，顯示出茶尺蠖觸角高豐度表達(dá)OBPs功能模式的豐富度和多樣性，這為解釋茶尺蠖嗅覺系統(tǒng)在面對復(fù)雜多變的外界環(huán)境的適應(yīng)機制提供了理論依據(jù)。

茶尺蠖；觸角高豐度；氣味結(jié)合蛋白；原核表達(dá)

在復(fù)雜的自然環(huán)境中，昆蟲的嗅覺系統(tǒng)在其識別和感知外界化學(xué)信息分子過程中發(fā)揮了重要作用。在昆蟲的嗅覺感器淋巴液中，充滿了大量的球性蛋白，如氣味結(jié)合蛋白（Odorant-binding proteins，OBPs）。OBPs能將外界化學(xué)氣味分子運輸至外周神經(jīng)樹突細(xì)胞膜上的氣味受體（Olfactory receptors，ORs），觸發(fā)電信號傳遞至腦部中樞，從而引發(fā)昆蟲相應(yīng)的行為和生理反應(yīng)[1]。由此可見，作為嗅覺系統(tǒng)的第一個參與者，OBPs發(fā)揮篩選和運載的重要作用。按在鱗翅目感受器上分布的不同，可將OBPs分為普通氣味蛋白（General odorant-binding proteins，GOBPs）、信息素結(jié)合蛋白（Pheromone-binding proteins，PBPs）和觸角結(jié)合蛋白（Antennal binding protein X，ABPX）等[2]，其中PBPs和GOBPs分別在和轉(zhuǎn)運植物揮發(fā)物和結(jié)合昆蟲信息素方面能發(fā)揮重要作用。

信息素和植物揮發(fā)物在昆蟲定位、取食、覓偶和產(chǎn)卵等行為方面起到了重要的調(diào)控作用[3]。自1959年Butenandt等[4]首次在家蠶（）雌蛾中鑒定出性信息素蠶蛾醇（Bombykol）以來，已經(jīng)鑒定出3?000多種昆蟲的性信息素[5]。作為茶樹中發(fā)生最普遍、為害最嚴(yán)重的鱗翅目害蟲之一，茶尺蠖（Prout）幼蟲具有暴食性，嚴(yán)重時可使茶樹光禿，嚴(yán)重影響茶葉產(chǎn)量和質(zhì)量[6-7]。目前化學(xué)防治不僅破壞生態(tài)平衡和污染環(huán)境，而且容易使害蟲抗藥性增加，從而引起農(nóng)藥超標(biāo)，因此利用信息素、植物揮發(fā)物生態(tài)調(diào)控技術(shù)等已成為茶尺蠖綠色防控的重要手段[8-10]。

茶尺蠖性信息素組分為主要性信息素和次要性信息素，分別為順3,9-環(huán)氧-6,7-十八碳二烯（3,9-6,7-epo-18: Hy）和順-3,6,9-十八碳三烯（3,6,9-18: Hy）[11]。另外某些植物揮發(fā)物也對茶尺蠖有引誘作用，如茶尺蠖成蟲對寄主植物薄荷、迷迭香、茶葉和吸毒草等氣味的趨性顯著[12]。茶尺蠖幼蟲危害茶樹后釋放植物揮發(fā)物苯甲醇、順-3-己酸己烯酯和順-3-己烯醛對茶尺蠖都有吸引作用，且加入順-乙酸-3-己烯酯可增強吸引力[9,13]。除了引誘作用外，某些植物揮發(fā)物能產(chǎn)生驅(qū)避作用，如高劑量薰衣草氣味能驅(qū)避茶尺蠖[12]；芳香類植物迷迭香會釋放順-3-馬鞭草烯醇、松油醇等植物揮發(fā)物，能夠驅(qū)避茶尺蠖成蟲產(chǎn)卵[14]等。盡管上述性信息素和植物揮發(fā)物具有引誘或者驅(qū)避茶尺蠖的能力已得到共識，但是尚不清晰茶尺蠖對這些結(jié)構(gòu)不同的化學(xué)信息分子的嗅覺感受機制，且昆蟲觸角中的OBPs是識別傳遞外界化學(xué)信息的第一個重要環(huán)節(jié)，因此有必要對茶尺蠖OBPs及其功能展開深入研究。

已報道茶尺蠖OBPs家族包括24個成員，其中OBP9和OBP11在茶尺蠖成蟲觸角中呈高豐度表達(dá)[15]，表明二者可能與茶尺蠖成蟲嗅覺感受功能密切相關(guān)。為了進(jìn)一步明確這兩個觸角高豐度表達(dá)基因的生理功能，本研究克隆了這兩個基因的cDNA序列，在獲得其蛋白的基礎(chǔ)上，研究重組蛋白與性信息素組分及供試植物揮發(fā)物的結(jié)合譜，并通過分子對接解析和比較其結(jié)合機制，為茶尺蠖觸角高豐度表達(dá)嗅覺感受機理提供參考，也為后續(xù)拓展開發(fā)新型生態(tài)調(diào)控信息素劑型奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

茶尺蠖幼蟲采自浙江省杭州市余杭區(qū)茶園，收集20頭新羽化后0～2?d的茶尺蠖雄蛾觸角，利用TRIzol提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后于–20℃冰箱保存?zhèn)溆?。同時收集20只雄蛾的頭、胸、腹、足和翅等組織用于Western blot。

pMD18-T載體、T4連接酶購于TaKaRa生物公司；pET-32a(+)載體為實驗室制備保存；1-NPN購自梯希愛（TCI）公司（純度>97%）；順3,9-環(huán)氧-6,7-十八碳二烯和順-3,6,9-十八碳三烯購自北京中捷四方生物科技股份有限公司（純度>90%）；氣味分子標(biāo)準(zhǔn)品購自上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司（純度>95%）；其他均為進(jìn)口或者國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 基因擴(kuò)增與進(jìn)化樹分析

根據(jù)OBP9、OBP11基因序列（GenBank登錄號分別為KT327214.1和KT327216.1）設(shè)計cDNA全長引物。以茶尺蠖雄蟲觸角cDNA第一鏈為模板擴(kuò)增，程序為94℃3?min；94℃45?s，60℃45?s（每循環(huán)降落1℃，至50℃后再20個循環(huán)），72℃45?s，共35個循環(huán)。目的片段純化后連接到pMD18-T載體上，選取陽性克隆測序驗證。獲得的序列經(jīng)BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）分析后利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行序列比對和進(jìn)化樹構(gòu)建（鄰接法）。

1.3 蛋白表達(dá)純化與免疫印跡

利用限制性酶切H和I對pMD18-T/OBP9、pMD18-T/OBP11進(jìn)行雙酶切，目的條帶膠回收后，用T4連接酶與pET-32a(+)質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，篩選陽性單克隆進(jìn)行序列鑒定，然后誘導(dǎo)表達(dá)。用鎳柱ProteinIsoTMNi-NTA Resin對目的蛋白進(jìn)行分離純化，SDS-PAGE檢測后透析獲得目的蛋白，免疫小鼠獲得OBP9、OBP11多克隆抗體。茶尺蠖觸角、頭、胸、腹、足和翅各取20?μL的總蛋白溶液經(jīng)SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離后，用Bio-Rad Transblot (Bio-Rad)將蛋白從膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；封閉液封閉120?min，TBST洗膜4次；再用制備的抗體（1︰500，/）4℃冰箱孵育過夜，TBST洗4次；再用HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1︰500，/）和膜常溫靜置6?h；按照超敏型辣根過氧化氫酶DAB顯色劑盒的說明對底物進(jìn)行顯色。

1.4 熒光競爭結(jié)合實驗

利用熒光分光光度計（島津RF5301，日本）測試重組蛋白OBP9、OBP11與1-NPN的熒光光譜，確定1-NPN是否適合作為熒光報告子。用熒光分光光度計記錄配基與1-NPN競爭結(jié)合重組蛋白的熒光數(shù)據(jù)，根據(jù)Scatchard方程[16]計算配基與蛋白的解離常數(shù)。

1.5 分子對接

從Swiss-Model Workspace中的蛋白三維晶體數(shù)據(jù)庫（PDB），預(yù)測獲得OBP9、OBP11的蛋白3D結(jié)構(gòu)。從NCBI的PubChem中下載獲得配基的3D結(jié)構(gòu)。將蛋白和配基的3D結(jié)構(gòu)一起導(dǎo)入到Molegro Virtual Docker（MVD 4.1，free trial）軟件中，尋找最佳對接模型，最后用Pymol軟件畫出3D分子對接圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列比對及進(jìn)化樹分析

本研究成功獲得了茶尺蠖OBP9、OBP11 cDNA序列全長，二者開放閱讀框大小分別為426?bp和429?bp，編碼141和142個氨基酸。其中OBP9編碼氨基酸序列含有酸性殘基達(dá)到20%（27個），呈酸性（預(yù)測等電點pI=4.3）；而OBP11編碼氨基酸序列含有堿性殘基達(dá)到38.7%（55個），呈堿性（預(yù)測等電點pI=8.1）。

序列比對結(jié)果表明，二者均含有6個保守的半胱氨酸，具有OBPs家族典型的特點（圖1），可形成3個二硫鍵，兩者的二級結(jié)構(gòu)主要為-螺旋。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示（圖2），OBP9和OBP11處在兩個分支上，其中OBP9與蘋果銀蛾OBP5（OBP5）相似度最高，達(dá)68.09%，OBP11與水稻稻縱卷葉螟GOBP2（GOBP2）相似度最高，達(dá)66.94%，表明二者存在序列進(jìn)化差異。

注：EoblOBP9和EoblOBP11用箭頭標(biāo)注。BmorOBP1（家蠶OBP1）；CsupOBP1（二化螟OBP1）；DpleOBP1（黑脈金斑蝶OBP1）；OfurOBP2（亞洲玉米螟OBP2）；CmedGOBP2（水稻稻縱卷葉螟GOBP2）；EoblOBP11（茶尺蠖OBP11）；AconOBP5（蘋果銀蛾OBP5）；EoblOBP9（茶尺蠖OBP9）；MsexASP3（煙草天蛾ASP3）；SinfOBP16（大螟OBP16）；DhouOBP1（柳杉毛蟲OBP1）；DpunOBP44（松毛蟲OBP44）；LtriOBP1（三葉斑潛蠅OBP1）；AcerASP2（中華蜜蜂ASP2）；EoblPBP2（茶尺蠖PBP2）；EoblGOBP1（茶尺蠖GOBP1）；EoblGOBP2（茶尺蠖GOBP2）。下同

2.2 原核表達(dá)、蛋白純化與Western blot分析

利用原核表達(dá)技術(shù)構(gòu)建載體，并誘導(dǎo)獲得OBP9和OBP11重組蛋白，其中OBP9主要存在于感受態(tài)細(xì)胞裂解液的上清液中，而OBP11主要存在于包涵體中，經(jīng)鎳柱純化后獲得二者的重組蛋白分子量大小分別為35.9?kDa和36.3?kDa（含pET-32載體標(biāo)簽）（圖3）。

提取茶尺蠖雄成蟲不同組織蛋白，SDS-PAGE電泳顯示茶尺蠖雄蟲腹部和胸部的總蛋白含量較高（分別為圖4-A、圖4-C中的泳道4和7），觸角和翅的總蛋白含量相對較低（分別為圖4-A、圖4-C中的泳道2和6）。Western blot（圖4-B、圖4-D）顯示，無論是觸角（泳道2）還是重組蛋白（泳道8），均呈現(xiàn)明顯特異條帶，其他泳道中幾乎沒有，表明OBP9、OBP11蛋白特異地表達(dá)于茶尺蠖雄成蟲觸角中。

2.3 熒光競爭結(jié)合分析

OBP9與OBP11重組蛋白最大激發(fā)波長均為282?nm，最大發(fā)射波長均為335?nm。在蛋白溶液中逐漸增加1-NPN，記錄發(fā)射光譜最大強度，并根據(jù)Scatchard方程，計算出二者與1-NPN的結(jié)合位點數(shù)n分別為(0.924±0.168)和(0.874±0.107)，均接近于1；解離常數(shù)1-NPN分別為(6.603±2.351)、(4.412±1.544)?μmol·L-1（圖5-A、圖5-B）。熒光競爭結(jié)合實驗表明，在21種候選測試配基中，有7種配基可使OBP9蛋白熒光強度下降到50%以下，有5種配基可使OBP11蛋白熒光強度下降到50%以下（圖5-C、圖5-D），表明OBP9具有較OBP11更加廣泛的配基分子識別譜。

圖2 EoblOBP9和EoblOBP11與其他昆蟲氣味結(jié)合蛋白的NJ進(jìn)化樹

注：泳道1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2、3和7、8分別為未經(jīng)過和經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)的含有pET-32a(+)/EoblOBP9和pET-32a(+)/EoblOBP11重組質(zhì)粒的細(xì)菌裂解產(chǎn)物；泳道4、5和9、10分別為IPTG誘導(dǎo)過的細(xì)菌裂解上清液和包涵體溶解液；泳道6和11分別為透析后的EoblOBP9和EoblOBP11蛋白溶液

如表1所示，OBP9與植物揮發(fā)物1-戊烯-3-醇結(jié)合能力最強（D=2.293?μmol·L-1），與茶尺蠖主要性信息素成分順3,9-環(huán)氧-6,7-十八碳二烯和植物揮發(fā)物苯甲醇結(jié)合能力也較強（D＜2.5?μmol·L-1）；OBP11與茶尺蠖次要性信息素成分順-3,6,9-十八碳三烯的結(jié)合能力最強（D=2.338?mol·L-1），其次是反-2-己烯醛（D=3.032?μmol·L-1）。

注：A和B：右上角圖上有1-NPN的化學(xué)結(jié)構(gòu)，根據(jù)Scatchard方程線性化熒光光譜數(shù)據(jù)，EoblOBP9、EoblOBP11與1-NPN的結(jié)合分析。C和D配基和1-NPN與EoblOBP9、EoblOBP11重組蛋白的競爭結(jié)合

2.4 茶尺蠖EoblOBP9和EoblOBP11與測試配體的分子對接分析

OBP9和OBP11預(yù)測的3D結(jié)構(gòu)模型分別以岡比亞按蚊（）的OBP1蛋白（2erb.1.A）和OBP20蛋白（4f7f.4.A）為模板進(jìn)行構(gòu)建，序列相似度分別為37.19%和37.82%，QMEAN值分別為–1.40和–0.77。

從分子對接結(jié)果看，OBP9與兩個性信息素組分（順3,9-環(huán)氧-6,7-十八碳二烯和順-3,6,9-十八碳三烯）結(jié)合時提供主要能量的氨基酸殘基有Ile33、Leu72、Tyr98、Arg101、Thr102、Leu137、Tyr138和Phe139（圖6-A）；OBP11與這兩個性信息素組分結(jié)合時提供主要能量的氨基酸殘基有Leu27、Gly31、Tyr71、Tyr95、Leu131、Met140、Phe141和Ala142（圖6-B）。圖6-C和圖6-D顯示OBP9與供試配基分子的結(jié)合腔較OBP11更大，暗示OBP9能容納更多類型的氣味分子和更寬的配基結(jié)合譜；而OBP11對氣味的識別更具有專一性，結(jié)合譜較窄。對于植物揮發(fā)物來說，OBP9與苯甲醛、苯乙酮結(jié)合中提供更多能量為Tyr98、Thr102、Phe139，與反-2-己烯醛結(jié)合中提供更多能量為Tyr98、Leu137、Phe139，與苯甲醇的為Tyr98、Arg101、Leu137，與1-戊烯-3-醇的為Lys20、Asn56、Phe139；OBP11與反-2-己烯醛結(jié)合中提供更多能量為Val103、Leu131、Phe139，OBP11與-萜品醇結(jié)合中提供更多能量為Leu27、Phe141和Ala142。從分子對接三維圖（圖6-C、圖6-D）來看，兩個蛋白均有大量疏水性氨基酸在結(jié)合位點周圍，從而形成疏水結(jié)合腔。此外，在所有測試配基中，發(fā)現(xiàn)除與順-3,6,9-十八碳三烯結(jié)合無氫鍵外，其余配基與兩個蛋白的對接模型中都含有氫鍵（圖6-E、圖6-F）。

表1 EoblOBP9和EoblOBP 11與候選配基的競爭結(jié)合分析

注：A是EoblOBP9與Z3, Z9-6R, 7S-epo-18: Hy、Z3, Z6, Z9-18: Hy、Benzaldehyde、(E)-2-hexenal、1-Pentene-3-ol、Benzyl alcohol、Acetophenone結(jié)合時發(fā)揮重要作用的氨基酸殘基的能量值。圖B是EoblOBP11與Z3, Z9-6R, 7S-epo-18: Hy、Z3, Z6, Z9-18: Hy、α-Terpineol、Dibutyl phthalate、(E)-2-hexenal結(jié)合中有重要作用的氨基酸殘基的能量值。C圖D：EoblOBP9和EoblOBP11與Z3, Z9-6R, 7S-epo-18: Hy分子對接的最佳模型，紅色螺旋結(jié)構(gòu)的3D蛋白結(jié)構(gòu)與配體在疏水腔中相互作用。圖E和圖F：EoblOBP9和EoblOBP11與Z3, Z9-6R, 7S-epo-18: Hy的分子對接2D模型。黑色字體標(biāo)注了關(guān)鍵氨基酸殘基，青色虛線為氫鍵

3 討論

昆蟲OBPs是一類多功能蛋白，能作為載體結(jié)合和運輸性信息素和氣味分子到嗅覺神經(jīng)樹突末梢，引起昆蟲嗅覺反應(yīng)[17]。作為昆蟲主要嗅覺感受器官，觸角高豐度表達(dá)的OBPs極有可能參與昆蟲嗅覺反應(yīng)，本研究以觸角高豐度表達(dá)的OBP9和OBP11為對象，來研究其與信息素和茶樹揮發(fā)物的結(jié)合關(guān)系，并比較和解析了二者在配基生化結(jié)合功能的作用模式異同。

氨基酸序列和多序列聯(lián)配分析顯示，二者均具有昆蟲OBPs典型序列特征（圖1），且系統(tǒng)發(fā)育樹顯示二者能和多種昆蟲OBPs具有較近的發(fā)育關(guān)系，然而二者也處在不同系統(tǒng)分支（圖2）。有報道顯示，OBP9和OBP11高豐度特異地表達(dá)于茶尺蠖成蟲觸角上[15]，本研究利用Western blot技術(shù)進(jìn)一步證實了兩個蛋白能在茶尺蠖雄蟲觸角中特異表達(dá)，這表明二者極有可能參與了茶尺蠖雄成蟲的嗅覺識別。在競爭性熒光結(jié)合實驗中，兩個蛋白均與順3,9-環(huán)氧-6,7-十八碳二烯和順-3,6,9-十八碳三烯這兩種性信息素產(chǎn)生了較高的結(jié)合能力，甚至高于茶尺蠖PBP2[18]，而且相較而言，OBP9與主要性信息素順3,9-環(huán)氧-6,7-十八碳二烯結(jié)合能力強，而OBP11與次要性信息素順-3,6,9-十八碳三烯結(jié)合能力強（表1），表明二者在參與茶尺蠖性信息素多元成分的識別過程中可能有互補的作用。

與供試茶樹揮發(fā)物配基的結(jié)合實驗中，OBP9和OBP11對不同的化學(xué)配基呈現(xiàn)極具規(guī)律性的配基結(jié)合譜。如對反-2-己烯醛，二者均會有較強的結(jié)和能力；然而，對1-戊烯-3-醇、苯甲醇、苯乙酮和苯甲醛，OBP9的親和力較強，OBP11卻不結(jié)合；對于-萜品醇，OBP11的親和力較強，而OBP9卻不結(jié)合（表1）。相比較而言，OBP9配基結(jié)合譜更寬，而OBP11更專一，分子對接結(jié)果也解釋了可能的原因，即OBP9的結(jié)合腔較OBP11更大（圖6-A和圖6-B）。在前期研究中，發(fā)現(xiàn)茶尺蠖成蟲觸角中高表達(dá)的GOBP2也能與反-2-己烯醛、苯甲醛和苯乙酮等多種茶樹揮發(fā)物結(jié)合[16]，本研究中的OBP9與GOBP2顯示了相似的配基結(jié)合譜，表明茶尺蠖OBPs具有與茶樹揮發(fā)物親和力強的共同特征。

在所測試的植物揮發(fā)性物質(zhì)中，反-2-己烯醛作為植物受外界刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種綠葉性氣味，不僅能對小貫小綠葉蟬（）[19]和褐梗天牛（）[20]產(chǎn)生引誘作用，而且還能刺激多音天蠶（）雌蛾釋放性信息素從而引誘雄蛾[21]，可見反-2-己烯醛作為能夠普遍引誘多種昆蟲的重要植物活性成分，茶尺蠖這3種OBPs（GOBP2、OBP9、OBP11）與之都有較強的親和力，表明茶尺蠖對該重要植物活性成分識別的高度協(xié)調(diào)性和一致性。對于另外的幾種植物揮發(fā)物，如苯甲醛是在茶樹受到茶蚜、茶尺蠖幼蟲危害后可釋放的，能吸引草瓢蟲和天敵寄生蜂[22-23]，只能與OBP9和GOBP2結(jié)合，而與OBP11不結(jié)合；-萜品醇是植物被寄主為害后自身產(chǎn)生的能夠引誘寄生蜂等天敵[24]，僅與OBP11的親和力較強；而對其他的12種供試配基均不結(jié)合，表明不同茶尺蠖的OBPs對于不同的化學(xué)配基具有功能上的選擇性，而這種選擇性與蛋白的內(nèi)部空間結(jié)構(gòu)可能存在一定的關(guān)系。

對于等電點偏酸性的OBP9（pI=4.3）而言，本研究發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象，即其結(jié)合位點除了多數(shù)的非極性氨基酸外，存在兩個堿性氨基酸Arg101和Lys20（圖6-A）。這種現(xiàn)象與東亞飛蝗（）OBP1（pI=4.4）中的關(guān)鍵位點Arg10和His107的狀況[25]非常相似，即在N端和C端分別有一個堿性氨基酸參與了配基結(jié)合，這個特征是否是所有酸性O(shè)BPs的共有的結(jié)合模式還需要進(jìn)一步驗證；而等電點偏堿性的OBP11（pI=8.1），只是和OBP9其他結(jié)合位點較類似，即活性中心分布著大量的非極性氨基酸殘基（圖6），而這些非極性殘基形成的疏水性結(jié)合腔，能有效驅(qū)動與疏水性配基的結(jié)合[26]。此外，本研究顯示，兩個蛋白C端的部分殘基，如OBP9的Leu137、Tyr138、Phe139和OBP11的Phe141、Ala142等，都參與了結(jié)合腔的生成（圖6-A和圖6-B），類似地情況也出現(xiàn)在岡比亞按蚊的OBP1[27]和茶尺蠖PBP2[28]中。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，除了順3,9-環(huán)氧-6,7-十八碳二烯外，OBP9與OBP11兩個蛋白與其他親和力較強的配基均預(yù)測能形成氫鍵，暗示氫鍵可能在二者與配基結(jié)合過程中發(fā)揮重要作用，這與草地螟（）的GOBP1[29]和梨小食心蟲（）的GOBP2[30]與配基結(jié)合的情況也非常類似。

總而言之，本研究結(jié)果表明，作為兩個茶尺蠖觸角高豐度表達(dá)的OBPs，不僅顯示了配基結(jié)合的普遍性規(guī)律，即與重要性信息素成分和關(guān)鍵植物揮發(fā)物成分的普遍高親和力[1-2]，而且也體現(xiàn)出了差異性的配基結(jié)合譜，這種差異與其空間結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[17]，從而為茶尺蠖對植物寄主揮發(fā)物的嗅覺選擇性機制提供了理論依據(jù)。

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Study on the Differences in Ligand-binding Function and Mode of the Antennal High-abundance Odorant-binding ProteinsOBP9 andOBP11 of the Tea Geometrid,Prout

YAN Yuting1, WU Fan1, ZHANG Yali2, FU Xiaobin1, CUI Hongchun3, HAN Baoyu1, LI Hongliang1*

1. College of Life Science, China Jiliang University/Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection and Quarantine, Hangzhou 310018, China; 2. Hangzhou Tea Research Institute, China Coop., Hangzhou 310016, China;3. Hangzhou Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310024, China

As an important lepidopteran pest in tea gardens, the male and female adults ofProut can perceive and distinguish the chemical information of the external environment through the olfactory system, which helps its behaviors such as mating and selection of oviposition locations. In this process, Odorant-binding proteins (OBPs) highly expressed in the antennae of adults may play an important role. In view of this, this study focused on the two OBPs high expressed in the antennae of the adult tea geometrid, namelyOBP9 andOBP 11. First, it was found that bothOBP9 andOBP11 contain six conserved cysteines, the typical characteristics of the OBPs family, while the isoelectric points are predicted to be acidic and basic, respectively, indicating their difference in the primary structural properties. Both recombinant proteins were obtained using prokaryotic expression technology, and the corresponding polyclonal antibodies were prepared by immunizing mice. It was verified that they were indeed expressed specifically in the antennae of male adults by Western blot. Their binding abilities with 20 candidate ligands were tested by fluorescence competitive binding experiments, and the results show that both of them were compatible with the two sex pheromone components (3,Z9-6,7-epo-18: Hy and3,6,9-18: Hy) and a plant volatile component (trans-2-hexenal) has a strong affinity. Meanwhile, two OBPs also showed different ligand binding spectra. For example,OBP9 had a strong affinity with 1-penten-3-ol, benzyl alcohol, acetophenone and benzaldehyde, indicating that the binding profiles were wider; whileOBP11 had a strong affinity with-terpineol with a more specific binding mode. Molecular docking analysis also supports this conclusion. In addition, it was predicted that the active sites of both proteins are located at the C-terminus, which also shows the commonality of ligand binding. In conclusion, this study shows that although both OBPs were specifically expressed in the adult tea geometrid with high abundance, they are both conservative and different in terms of structural properties and biochemical binding profiles. The general characters and significant differences are coexist, showing the high abundance and diversities of the OBPs. This can also explain an adaptation mechanism of the tea geometrid olfactory system in the face of the complex and changeable external environment.

Prout, antennal high-abundance, odorant-binding protein, prokaryotic expression

S571；S435.711

A

1000-369X(2021)05-643-11

2021-01-26

2021-04-05

國家自然科學(xué)基金（31772544、32000331）、浙江省自然科學(xué)基金（LQ21C030007）、科技部基礎(chǔ)資源調(diào)查專項（2018FY100405）、浙江省重點計劃項目（2020C02026）

嚴(yán)玉婷，女，碩士研究生，主要從事昆蟲生化與分子生物學(xué)方面的研究。*通信作者：hlli@cjlu.edu.cn

（責(zé)任編輯：趙鋒）