miR-376b-3p對HepG2細(xì)胞Ⅱ相代謝酶UGT2B7的調(diào)控

李 敏，江澤斌，鄭付春

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣東 汕頭 515041)

微RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的非編碼小RNA分子，也是最大的基因家族之一[1]。1993年，第一個miRNA lin-4被發(fā)現(xiàn)參與線蟲發(fā)育的調(diào)控[2]，隨后的20年間，成千上萬種miRNAs在動植物以及人體內(nèi)被相繼發(fā)現(xiàn)。miRNA的產(chǎn)生主要分為兩個階段：miRNA初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在細(xì)胞核中被核糖核酸酶Drosha處理成一個約70個核苷酸長度的前體mRNA；之后在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白exportin-5的作用下被轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)內(nèi)，進(jìn)而被Dicer酶切割成長約22個核苷酸的成熟miRNA。成熟miRNA可以與細(xì)胞內(nèi)的Argonaute蛋白等結(jié)合形成miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，與靶基因的3′-UTR區(qū)域特異性結(jié)合，引起靶基因mRNA的降解或翻譯抑制。人體中的miRNAs參與約30%基因的表達(dá)調(diào)控，與整個生命活動密切相關(guān)[3]。多個miRNA能同時調(diào)控同一個代謝酶，一個miRNA也能同時調(diào)控多種代謝酶。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(uridine diphosphate-glucuronyl transferase，UGT)是一類重要的Ⅱ相代謝酶，可以在內(nèi)源物和外源物分子上加入一個葡萄糖醛酸基團(tuán)，增加極性，利于其經(jīng)尿液與膽汁排泄，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。UGT2B7是UGT家族中重要的一員。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-376b-3p與癲癇患者丙戊酸鈉血藥濃度有相關(guān)性，從丙戊酸鈉的代謝酶中篩選出UGT2B7能被miR-376b-3p調(diào)控，且UGT2B7在丙戊酸鈉的主要代謝途徑中所占比例最高。本研究探討miR-376b-3p對HepG2細(xì)胞UGT2B7的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

HepG2細(xì)胞(廣州賽庫生物技術(shù)有限公司)，HEK293T細(xì)胞由牛永東老師饋贈，miR-376b-3p模擬物及陰性對照、miR-376b-3p抑制劑及陰性對照(上海誠鑫生物科技有限公司)，UGT2B7抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，GAPDH抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，qPCR試劑盒(寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(廣州致邦生物科技有限公司)，UGT2B7 3′-UTR野生型(WT)以及突變體(Mut)質(zhì)粒、miR-376b-3p質(zhì)粒、海腎熒光素酶報告基因質(zhì)粒(上海吉凱基因科技有限公司)，DMEM、胎牛血清、胰酶、青霉素—鏈霉素雙抗溶液(美國Hyclone公司)，ABI QS5熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，報告基因檢測儀(美國PROMEGA公司)。

1.2 方法

1.2.1 雙熒光素酶報告基因分析實驗分組為miR-376b-3p陰性對照+UGT2B7 3′-UTR WT組、miR-376b-3p+UGT2B7 3′-UTR WT 組、miR-376b-3p陰性對照+UGT2B7 3′-UTR Mut組、miR-376b-3p+UGT2B7 3′-UTR Mut組、miR-376b-3p陰性對照+UGT2B7 3′-UTR WT陰性對照組、miR-376b-3p+UGT2B7 3′-UTR WT陰性對照組(WT陰性對照也為Mut陰性對照)。將融合度為70%～80%的HEK293T細(xì)胞用胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按2×104個細(xì)胞/孔接種于白色96孔板，培養(yǎng)16～24 h后；每孔轉(zhuǎn)染25 ng WT/Mut質(zhì)粒，5 ng海腎熒光素酶報告基因質(zhì)粒，100 ng miR-376b-3p質(zhì)?；騧iR-376b-3p陰性對照質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒分別檢測螢火蟲熒光素的熒光強(qiáng)度和海腎熒光素的熒光強(qiáng)度，以螢火蟲與海腎熒光素?zé)晒鈴?qiáng)度的比值作為結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計。

1.2.2 實時PCR檢測HepG2細(xì)胞中UGT2B7的mRNA水平HepG2細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。使用miR-376b-3p模擬物或miR-376b-3p抑制劑以及陰性對照(30 nmol/L)與5 μL Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑形成脂質(zhì)體復(fù)合物，再用無抗生素的培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞(1×105～3×105個/mL)加入六孔板中，培養(yǎng)36 h后，使用Trizol裂解液進(jìn)行總RNA提取。PCR反應(yīng)條件：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，34 s，40個循環(huán)，以β-actin作為內(nèi)參基因檢測UGT2B7 mRNA的表達(dá)水平。

1.2.3 蛋白印跡法檢測HepG2細(xì)胞中UGT2B7的蛋白水平在六孔板中轉(zhuǎn)染miR-376b-3p模擬物或miR-376b-3p抑制劑以及陰性對照48 h后，使用PBS緩沖液洗3次，每孔加入50 μL裂解液，冰上裂解30 min，隨后12 000 r/min，4℃離心，收集上清液。采用BCA法蛋白定量，完成后將蛋白在沸水中變性5 min，冷卻后待使用。將蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，采用12%的分離膠，上樣量10 μg，電泳90 min，隨后采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)膜時間為90 min，再將條帶置于5%脫脂牛奶中封閉1 h，封閉結(jié)束后在4℃條件下孵育一抗過夜(UGT2B7抗體稀釋比例為1∶2 000，GAPDH抗體稀釋比例為1∶5 000)；第2天在室溫下孵育二抗1 h(UGT2B7 1∶40 000稀釋，GAPDH 1∶100 000稀釋)，加入發(fā)光液，在暗室中曝光，Gel-pro圖像分析軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以xˉ±s表示，2組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-376b-3p與UGT2B7 mRNA的結(jié)合

結(jié)合位點如圖1A所示，miR-376b-3p與UGT2B7 3′-UTR的結(jié)合位點具有廣泛的種子配對且第1位核苷酸是A，在第16～20位也有結(jié)合。雙熒光素酶質(zhì)粒突變位點如圖1B所示。在HEK293T細(xì)胞中通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-376b-3p能否與UGT2B7 3′-UTR直接結(jié)合。如圖1C所示，與miR-376b-3p陰性對照組相比，共轉(zhuǎn)染miR-376b-3p與UGT2B7 3′-UTR WT組的熒光素酶活性降低13%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，共轉(zhuǎn)染 UGT2B7 3′-UTR Mut組的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 miR-376b-3p與UGT2B7 mRNA的結(jié)合

2.2 miR-376b-3p對UGT2B7 mRNA的調(diào)控

如圖2所示，與陰性對照組相比，miR-376b-3p模擬物組UGT2B7 mRNA水平下降44%，miR-376b-3p抑制劑組UGT2B7 mRNA水平升高41%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖2 miR-376b-3p模擬物和抑制劑對UGT2B7 mRNA表達(dá)的影響

2.3 miR-376b-3p對UGT2B7蛋白表達(dá)的調(diào)控

如圖3和圖4所示，與陰性對照組相比，miR-376b-3p模擬物組UGT2B7蛋白表達(dá)下降34%，miR-376b-3p抑制劑組蛋白表達(dá)升高67%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。肝藥酶抑制劑雙氯芬酸和肝藥酶誘導(dǎo)劑利福平作為免疫印跡法的陽性藥。

圖3 miR-376b-3p模擬物對UGT2B7蛋白表達(dá)的影響

圖4 miR-376b-3p抑制劑對UGT2B7蛋白表達(dá)的影響

3 討論

UGT廣泛分布在肝臟、腎臟、心臟、腦、皮膚等器官和組織中，其中在肝臟中活性最高，是生物體內(nèi)外源性物質(zhì)進(jìn)行Ⅱ相生物轉(zhuǎn)化主要的代謝酶。UGT參與約35%臨床用藥的代謝，35%被UGT代謝的臨床用藥是UGT2B7的底物[4]。UGT2B7在肝臟中高表達(dá)，對各種內(nèi)源性化合物包括膽汁酸、視黃酸、類固醇、鹽皮質(zhì)激素、糖皮質(zhì)激素、脂肪酸，以及外源性化合物包括致癌物質(zhì)，治療藥物如嗎啡、可待因[5]、鹽酸表柔比星[6]、丙戊酸[7]，及非甾體類抗炎藥具有高活性。迄今為止，人們已經(jīng)利用肝癌細(xì)胞系、人原代肝細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠等肝臟模型對UGT2B7的轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)行了深入研究[8]。已發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控UGT2B7表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子包括肝細(xì)胞的核因子1α[9]、HNF4α、尾相關(guān)同源框因子2[10]、紅細(xì)胞來源核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2、核內(nèi)X受體[11]、p53[12]和激活蛋白1[13]。隨著對miRNA研究的不斷深入，已經(jīng)證實miRNA不但在生理過程中發(fā)揮重要作用，而且在腫瘤發(fā)生和藥物代謝過程中也發(fā)揮重要的調(diào)控作用。miRNA可以直接調(diào)控藥物代謝酶UGT2B7的表達(dá)，也可以通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子而間接調(diào)控UGT2B7的表達(dá)。盡管UGT2B7的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控機(jī)制已得到充分研究，但它如何被miRNA調(diào)控還鮮有報道。

miRNA通常通過mRNA降解或翻譯抑制來抑制基因表達(dá)，具體作用機(jī)制取決于miRNA和靶mRNA之間序列互補(bǔ)的程度和性質(zhì)。本研究miR-376b-3p與UGT2B7 3′-UTR的結(jié)合位點具有廣泛的種子配對且第一位核苷酸是A，在第16～20位也有結(jié)合，這更有利于向mRNA降解途徑發(fā)展。本研究利用雙熒光素酶表明miR-376b-3p通過UGT2B7 3′-UTR的一個結(jié)合位點對UGT2B7進(jìn)行負(fù)調(diào)控。HepG2細(xì)胞癌性較低，有較完整的Ⅰ、Ⅱ相代謝酶的表達(dá)。本研究在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-376b-3p模擬物，UGT2B7 mRNA水平降低44%，轉(zhuǎn)染miR-376b-3p抑制劑，UGT2B7 mRNA水平升高41%，在蛋白水平上，轉(zhuǎn)染miR-376b-3p模擬物使UGT2B7蛋白水平下降34%，轉(zhuǎn)染miR-376b-3p抑制劑能使UGT2B7蛋白水平升高67%。這表明miR-376b-3p在UGT2B7 mRNA水平和蛋白表達(dá)水平上都有抑制作用。

綜上所述，miR-376b-3p能通過結(jié)合UGT2B7 3′-UTR負(fù)調(diào)控UGT2B7的mRNA和蛋白表達(dá)。miR-376b-3p可能通過調(diào)控UGT2B7，進(jìn)而影響丙戊酸鈉的血藥濃度，這或許是丙戊酸鈉個體差異性較大的部分原因。