miRNA與腫瘤耐藥關(guān)系的研究進(jìn)展

馬維娜(綜述)，王世明，原永芳(審校)

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第三人民醫(yī)院藥劑科，上海201900)

miRNA是一類廣泛存在于生物體內(nèi)、長(zhǎng)度在19～25 bp之間、高度保守的非編碼小RNA，通過堿基配對(duì)與相應(yīng)的靶mRNA的3'非編碼區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA降解或轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制。目前，人類基因組中確認(rèn)的miRNA約500個(gè)，至少有200多種與癌癥的發(fā)生有關(guān)，許多miRNA可能扮演著癌基因和抑癌基因的角色［1］。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生抗藥性，是導(dǎo)致化學(xué)治療失敗的主要原因之一，腫瘤細(xì)胞的耐藥性包括原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥。近年來(lái)，許多實(shí)驗(yàn)室證實(shí)miRNA的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生有著密切的關(guān)系，現(xiàn)就miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及與腫瘤耐藥的關(guān)系予以綜述。

1 miRNA與腫瘤

miRNA在生物學(xué)中起著重要的作用，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激耐受及生理新陳代謝。實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明，miRNA與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān)，miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的分期、進(jìn)展及代謝有關(guān)［2］。一些 miRNA 在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)降低，提示它們可能作為抑癌基因，這些miRNA 包 括 let-7、miR-15、miR-16、miR-17-5p、miR-29、miR-34、miR-124a、miR-127、miR-143、miR-145、miR-181等。在這些基因中，let-7家族研究較多，let-7發(fā)生突變的細(xì)胞不能進(jìn)入正常的細(xì)胞周期，不能在正確的時(shí)間進(jìn)行分化，肺癌組織中l(wèi)et-7表達(dá)水平降低，且低表達(dá)let-7的患者生存期縮短，這提示let-7可能是一個(gè)腫瘤抑制基因，并且可以作為腫瘤監(jiān)測(cè)和腫瘤預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物［3］。miR-15和 miR-16定位于人染色體13q14的LEU2區(qū)域內(nèi)，在人類慢性淋巴細(xì)胞白血病中充當(dāng)著抑癌基因的角色，是最早得到證實(shí)的與腫瘤有相關(guān)性的miRNA。后來(lái)有研究結(jié)果顯示，抗凋亡蛋白Bcl-2是miR-15a和miR-16-1的靶基因之一，miR-15a和miR-16-l可以從轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控Bcl-2表達(dá)。此研究結(jié)果提示，miR-15a和miR-16-1可以被用來(lái)治療過度表達(dá)Bcl-2的腫瘤。miR-34是另一種具有腫瘤抑制作用的重要miRNA，定位于人類染色體1p36，是一個(gè)在人類腫瘤(如神經(jīng)母細(xì)胞瘤)中常發(fā)生缺失的區(qū)帶［4］。miR-34家族成員(miR-34a和miR-34b/c)是抑癌基因p53的直接靶分子;而p53是人類最常見癌癥的突變基因之一，可以激活一系列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡及衰老。在多種癌細(xì)胞培養(yǎng)體系的體外研究中(如乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等)，無(wú)論是外源性還是生理性的應(yīng)激均可通過p53途徑引起miR-34的高表達(dá)。

其他的一些miRNA在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增加，提示它們具有致癌活性。已知的致癌活性miRNA包括miR-21、miR-155、miR-221、miR-222 和 miR-17-92 等。miR-21被認(rèn)為是經(jīng)典的癌基因miRNA，位于染色體17q23．2上的空泡膜蛋白基因的3'非編碼區(qū)，該區(qū)域經(jīng)常在神經(jīng)細(xì)胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌中表達(dá)增強(qiáng)。包括 miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1在內(nèi)的miR-17-92基因簇在多種腫瘤細(xì)胞中也顯示了致癌活性［5，6］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，加強(qiáng)miR-17-92基因簇和原癌基因的表達(dá)可以加快鼠B細(xì)胞淋巴瘤模型中腫瘤的生長(zhǎng)［7］。miR-155在多種腫瘤細(xì)胞中高水平表達(dá)，其在胰腺癌中的高表達(dá)與患者的低生存率密切相關(guān)。腫瘤組織中miR-155高表達(dá)患者比miR-155低表達(dá)患者的腫瘤相關(guān)性死亡風(fēng)險(xiǎn)高 6．2 倍［6，8］。miR-372 和 miR-373 可能是睪丸生殖細(xì)胞癌的癌基因，現(xiàn)已證明miR-372和miR-373通過抑制p53介導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制途徑或者直接抑制抑癌基因LATS2的表達(dá)，促進(jìn)增殖，從而促使睪丸胚胎細(xì)胞腫瘤的形成［9］。

2 miRNA在腫瘤耐藥中的作用

化療是腫瘤治療的一個(gè)重要措施，但是，由于抗腫瘤藥物存在耐藥性，因此化療不能完全消除腫瘤細(xì)胞，這也是腫瘤再生的一個(gè)重要原因。近幾年研究表明，miRNA通過調(diào)控靶基因表達(dá)，影響細(xì)胞凋亡、增殖和分化，不僅與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，而且與腫瘤耐藥關(guān)系密切。miRNA的突變、異常表達(dá)和異常加工均會(huì)影響miRNA的正常功能，導(dǎo)致靶基因的蛋白表達(dá)水平異常。研究耐藥腫瘤細(xì)胞中miRNA的差異表達(dá)以及與耐藥相關(guān)基因之間的調(diào)控關(guān)系，對(duì)闡明耐藥機(jī)制具有重要意義。

2．1 miR-221和miR-222在抗雌性激素及腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)配體中的耐藥性 miR-221和miR-222是致癌的miRNA且容易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。比較對(duì)抗雌激素藥物氟維司群耐藥的MCF-7-FR細(xì)胞和對(duì)該藥物敏感的MCF-7親代細(xì)胞中miRNA、mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩種miRNA(miR-221和miR-222)表達(dá)上調(diào)，14 種 miRNA(包括 let-7i、miR-181a、miR-638、miR-204、miR-191、miR-346、miR-212、miR-328、miR-211、miR-424)下調(diào)，說明了 miR-221和 miR-222對(duì)抗雌激素的藥物耐藥［10］。研究表明，在對(duì)他莫昔芬耐藥的MCF-7細(xì)胞中，miR-221、miR-222和miR-181表達(dá)上調(diào)而miR-21、miR-342和miR-489表達(dá)下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)miR-221、miR-222能直接負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期抑制蛋白p27和ERa的表達(dá)，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫西芬及其他化療藥物的耐藥性。miR-221或miR-222的異常表達(dá)可通過抑制靶點(diǎn)p27Kip1使MCF-7親本細(xì)胞對(duì)他莫西芬耐藥，而在耐藥細(xì)胞中這種靶點(diǎn)可減少50%。此外，腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)配體參與腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，研究篩選出對(duì)腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)配體敏感性不同的4個(gè)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，通過比較它們?cè)趍iRNA表達(dá)譜上的區(qū)別，最終證實(shí)高表達(dá)的miR-221和miR-222通過下調(diào)P27kip1抑制了腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)配體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路［11］。

2．2 miRNA let-7家族及耐藥性 以往研究證實(shí)，miRNA中的“明星分子”let-7家族屬于抑癌基因，可直接下調(diào)原癌基因Ras及HMGA2的表達(dá)，并抑制細(xì)胞增殖，在腫瘤細(xì)胞中存在低表達(dá)現(xiàn)象。但Tsang等［12］的研究表明，let-7a通過下調(diào)細(xì)胞凋亡中的啟動(dòng)酶CASP3抑制了細(xì)胞凋亡，在A431和HepG2細(xì)胞中過表達(dá)，let-7a可增強(qiáng)它們對(duì)阿霉素、紫杉醇及干擾素γ的耐藥性，抑制let-7a則增加化療藥物引發(fā)的細(xì)胞凋亡。Yu等［13］通過對(duì)卵巢癌標(biāo)準(zhǔn)化療方案耐藥患者的miRNA芯片研究發(fā)現(xiàn)，let-7i在耐藥患者中表達(dá)明顯減少，并在細(xì)胞水平進(jìn)一步證實(shí)了let-7i下調(diào)與順鉑耐藥有關(guān)，提示調(diào)控Let-7i的表達(dá)有可能克服卵巢癌的耐藥性。

2．3 miR-200c與腫瘤耐藥 miR-200c屬于miR-200家族，有研究顯示，miR-200c及其調(diào)控通路中的一些因子與腫瘤耐藥有關(guān)，能通過調(diào)控不同的靶點(diǎn)增加細(xì)胞對(duì)紫杉醇和表皮生長(zhǎng)因子抑制劑的藥物敏感度。miR-200c在低分化的子宮內(nèi)膜、乳腺巢癌細(xì)胞中呈低表達(dá)，若恢復(fù)miR-200c在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)能夠明顯增強(qiáng)其對(duì)紫杉醇等靶向作用于細(xì)胞微管化療藥物介導(dǎo)的凋亡，并發(fā)現(xiàn)miR-200c是通過抑制耐藥因子TUBB3的表達(dá)起調(diào)控作用［14］。最新研究通過實(shí)時(shí)熒光定量(RFQ-PCR)分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)順鉑耐藥的胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞株中miR-200c的表達(dá)比對(duì)順鉑敏感的SGC7901細(xì)胞株顯著降低。為進(jìn)一步觀察miR-200c在腫瘤細(xì)胞中對(duì)順鉑耐藥的可能作用，將miR-200c前體片段轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901/DDP細(xì)胞，通過RFQ-PCR分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中miR-200c的表達(dá)顯著增加，其對(duì)順鉑敏感度也出現(xiàn)了顯著的改變，miR-200c能夠增加SGC7901/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感度，因此可以認(rèn)為miR-200c在逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥過程中發(fā)揮著一定的作用［15］。

2．4 miR-27與腫瘤耐藥 另有報(bào)道m(xù)iR-27a在多藥耐藥基因高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，與耐藥關(guān)系密切［16］。最近研究采用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)卵巢癌A2780細(xì)胞及其紫杉醇耐藥細(xì)胞A2780/Taxol中miR-27a的表達(dá)水平。利用脂質(zhì)體lipofectamine 2000將成熟miR-27a的模擬物、阻遏物及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染A2780和A2780/Taxol細(xì)胞，實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MDRl基因mRNA的表達(dá);蛋白印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中P-gp和同源結(jié)構(gòu)域相關(guān)的蛋白激酶2蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，miR-27a在卵巢癌A2780/Taxol細(xì)胞中高表達(dá);轉(zhuǎn)染miR-27a阻遏物后A2780/Taxol細(xì)胞中MDRl基因和P-gp蛋白的表達(dá)均下降，對(duì)紫杉醇的敏感性增加，提示可以通過下調(diào)P-gp的表達(dá)和功能，增加A2780/Taxol細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性，部分逆轉(zhuǎn)耐藥;將miR-27a模擬物轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞后，MDRI mRNA表達(dá)水平明顯升高。表明miR-27a可能通過直接作用于某些下游靶基因，而間接調(diào)控MDR1及P-gp的表達(dá)和功能［17］。

3 以miRNA為靶點(diǎn)增加藥物敏感性

最近的研究表明，大豆異黃酮、3，3'-二吲哚甲烷、吲哚-3-甲醇、姜黃素、兒茶素酸酯等天然提取物可以改變特定miRNA的表達(dá)［18-22］?？紤]到這些天然提取物的相對(duì)無(wú)毒性特征，以miRNA為靶點(diǎn)，應(yīng)用這些天然提取物并結(jié)合傳統(tǒng)的化療方法，可能是一種新的安全并且療效更好的治療方案。Sun等［21］報(bào)道了防治腫瘤的天然提取物——姜黃素，能夠改變胰腺腫瘤細(xì)胞中的miRNA表達(dá)譜，他們發(fā)現(xiàn)可以用姜黃素上調(diào)miR-22的表達(dá)或者用pre-miR-22s轉(zhuǎn)染來(lái)抑制其靶基因SP1的轉(zhuǎn)錄因子和雌激素受體1的表達(dá)。另一種天然提取物:吲哚-3-甲醇，能夠上調(diào)miR-21 的靶基因 PTEN、PDCD4 和 RECK［20］，因此通過吲哚-3-甲醇上調(diào)miR-21靶基因的表達(dá)可能是提高藥物敏感性的一種新策略。Tsang等［22］最近報(bào)道了兒茶素酸酯在人腫瘤細(xì)胞miRNA表達(dá)中的作用，發(fā)現(xiàn)兒茶素酸酯能夠上調(diào)miR-16且下調(diào)Bcl-2的表達(dá)。因?yàn)閙iR-16具有增加腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性這一作用，兒茶素酸酯可能是通過上調(diào)miR-16的表達(dá)增加了藥物的敏感性。Li等［19］研究了大豆異黃酮和3，3'-二吲哚甲烷對(duì)胰腺癌細(xì)胞中miRNA的作用，這些細(xì)胞對(duì)吉西他濱耐藥，發(fā)現(xiàn)通過pre-miR-200轉(zhuǎn)染使得miR-200再表達(dá)，或者應(yīng)用異黃酮或3，3'-二吲哚甲烷治療對(duì)吉西他濱耐藥的腫瘤，能引起miR-200的上調(diào)以及 ZEB1、slug、波形蛋白的下調(diào)，同樣，異黃酮和3，3-二吲哚基甲烷也能誘發(fā)let-7的表達(dá)，用吉西他濱治療miR-200b轉(zhuǎn)染的腫瘤耐藥細(xì)胞可使腫瘤生長(zhǎng)抑制率達(dá)到20．8%～38．2%。腫瘤耐藥細(xì)胞經(jīng)3，3'-二吲哚甲烷預(yù)處理后生長(zhǎng)抑制率提高14．8%～17．4%，通過異黃酮預(yù)處理后生長(zhǎng)抑制率提高 15．4%～17．1%［19］。因此，傳統(tǒng)的化療方案結(jié)合異黃酮或3，3'-二吲哚甲烷治療是治療胰腺癌一個(gè)新的較好的方案。

4 小結(jié)與展望

miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤的耐藥和預(yù)后中發(fā)揮著重要作用。但對(duì)miRNA的了解還非常有限，開發(fā)基于miRNA的診療手段還需要更多、更詳盡的研究。近年來(lái)的研究證實(shí)了miRNA在抗腫瘤藥物的敏感性和耐藥性中起了重要的作用，miRNA的異常表達(dá)能降低抗腫瘤藥物，如吉西他濱、多西他賽、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、他莫昔芬等對(duì)腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)。因此，以特定的miRNA為治療靶點(diǎn)，通過比較miRNA表達(dá)譜，與腫瘤細(xì)胞耐藥性密切相關(guān)的特定miRNA將被識(shí)別，這可能為新的靶向治療方案開辟途徑，從而改善治療效果。某些天然產(chǎn)物，如異黃酮、3，3'-二吲哚甲烷、吲哚-3-甲醇、姜黃素、兒茶素酸酯或其他尚未開發(fā)的天然提取物等也許會(huì)成為以miRNA為靶點(diǎn)的新的治療藥物。值得注意的是，除了能改變藥物敏感性的特定miRNA，一些研究表明其他的非編碼RNA、穹隆體RNA，也能調(diào)節(jié)抗腫瘤藥物的耐藥性［23］。人穹隆體RNA產(chǎn)生的一些小RNA(svRNA)與miRNA相似，也能調(diào)節(jié)基因表達(dá)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)svRNAb能下調(diào)CYP3A4的表達(dá)，CYP3A4是藥物代謝中的關(guān)鍵酶，能改變腫瘤細(xì)胞的耐藥性［23］，這提示這種新發(fā)現(xiàn)的小分子與miRNA相似，或許與部分的體內(nèi)耐藥有關(guān)聯(lián)。因此認(rèn)為，尚有許多抗癌藥物耐藥的調(diào)控機(jī)制有待發(fā)現(xiàn)，以這些小RNA為靶點(diǎn)開發(fā)新的治療方案正被提上日程，相信會(huì)有很好的發(fā)展前景。

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