衰老機制的分子水平研究進展

王博雯(綜述)，李應東，姚 凝(審校)

(甘肅中醫(yī)學院，蘭州730000)

衰老(senescense)又稱老化，是指生物體在其生命的后期所進行的全身性、多方面、循序漸進的退化過程，這種退化過程在整體水平、組織細胞水平及分子水平各個層次均有體現(xiàn)［1，2］。人類對衰老機制的研究始于整體水平和器官水平，主要表現(xiàn)為機體形態(tài)結構和功能方面出現(xiàn)的一系列退行性改變，細胞凋亡或壞死導致細胞數(shù)量減少，臟器萎縮，組織彈性減低等，從而進一步引起多種器官生理功能的逐步減退。隨著生命科學的飛速進展，衰老機制的細胞水平、分子水平的研究越來越深入，并且被認為是揭開衰老本質，防治老年病的重要環(huán)節(jié)［3］。人們也已經從多個物種找到了與衰老有關的基因，探討了衰老期間基因及其調控變化的特點，進一步研究了衰老與老年性疾病發(fā)生、發(fā)展的相關性［4］。深入研究和闡釋衰老機制的分子水平研究，對改善和預防老年性疾病的發(fā)生十分重要。

1 端粒與細胞衰老

端粒是存在于真核生物染色體末端的一種特殊結構，由進化上高度保守的DNA重復序列TTAGGG及相關蛋白質組成，它如同帽子一樣罩在染色體長臂上，包裹著染色體的頭部，防止染色體末端被酶解或兩條染色體的端區(qū)融合、丟失或重排，以維持染色體的穩(wěn)定性和完整性。

1973年，前蘇聯(lián)科學家Olovnikov提出人體細胞不能改變其DNA復制時染色體兩端的縮短，指出細胞在每次分裂過程中都會由于DNA聚合酶功能障礙而不能完全復制它們的染色體，導致復制的DNA序列有所丟失，最終造成細胞衰老死亡，推斷端粒丟失的原因很可能與端粒相關基因的致死性缺失有關，創(chuàng)造性地提出端粒的長度決定著細胞的壽命，被后人稱為衰老的“端粒學說”或“細胞有限分裂學說”［5］。

1992年，Harley等［6］發(fā)現(xiàn)體細胞的染色體端粒DNA會隨細胞分裂次數(shù)增加而不斷縮短，體細胞每傳代一次，端粒就縮短50～200 bp。與端粒長度和細胞衰老有關的最有力的試驗證據(jù)來自于人類的成纖維細胞，年輕人成纖維細胞內端粒的平均長度為18～25 kb，而老年人成纖維細胞內端粒的平均長度為8～10 kb，估計細胞每分裂一次，端?？s短50～100 bp［7］。張宗玉等［8］研究發(fā)現(xiàn)人胚肺二倍體成纖維細胞每增加一代齡，端粒長度減少約49 bp，同時還測定了人體外周血白細胞端區(qū)長度隨增齡變化，發(fā)現(xiàn)其長度平均每年減少約35 bp。隨著每一次的細胞分裂，染色體都會丟失一部分端粒序列，當其縮短到一個臨界長度，即末端限制性片段的長度時，細胞不再分裂，逐漸衰老直至死亡。因此，端粒又被稱為決定細胞衰老的“生物鐘”［9］。

2 端粒酶與細胞衰老

端粒酶又稱端粒末端轉移酶，是一種反轉錄酶，由RNA成分、催化亞單位和端粒酶相關蛋白1三個亞單位組成。近期研究表明，催化亞單位是端粒酶活性所必需的，是RNA依賴的DNA聚合酶，其自身攜帶模板。端粒酶的主要功能有:①通過自身的RNA模板，催化亞單位和輔助蛋白將端粒DNA添加到染色體末端。②維持和平衡端粒序列長度。③修復斷裂的染色體末端。斷裂的染色體末端即使沒有完整的端粒重復序列存在，但富含G、T的DNA存在，也能被端粒酶作為引物DNA而復制，以維持基因組遺傳的穩(wěn)定性［10］。

Harley等［11］提出了較為完備的端粒-端粒酶假說，認為正常細胞的端?？s短到一定程度時會啟動終止細胞分裂的信號，使細胞進入第一死亡期M1并退出細胞周期而老化;如果細胞被病毒轉染或某些抑癌基因發(fā)生突變，細胞可越過M1期而繼續(xù)分裂并進入第二死亡期M2，這時大部分細胞由于端粒太短而失去功能以致死亡。而極少數(shù)的細胞在此時激活了端粒酶，從而使端粒不再縮短，獲得無限增殖能力而成為永生化細胞。在正常體細胞中，端粒酶的活性很難測知，隨著細胞的分裂，端粒長度不斷縮短，從而使細胞老化。相反，在有端粒酶活性的細胞(如生殖細胞、腫瘤細胞和肝細胞)中由于端粒不斷得到補充延伸，因而細胞會表現(xiàn)出不死性［12］。

3 DNA修復能力與細胞衰老

有人認為DNA分子損傷的累積和修復能力的減退與衰老密切相關［13］。1999年，美國麻省理工學院Johnson等［14］把DNA損傷列為引起生物衰老的重要因素，且有人將此作為衰老的生物學年齡標志之一。人類細胞中的DNA在內環(huán)境(如自由基)和外環(huán)境(如陽光中的紫外線、化學物質)等有害因素作用下，DNA鏈受損而發(fā)生斷裂，以一條鏈斷裂最為多見。DNA鏈斷裂后則使遺傳信息不能準確地傳至下一代，但細胞具有一整套修復DNA鏈斷裂的酶系，從而得以保證遺傳信息由親代高保真地傳至下代。但DNA的這種修復能力隨增齡而減退，致基因表達異常，錯誤遺傳信息不斷累積，細胞功能逐漸減退，最終導致細胞衰老直至死亡。Waldstein等［15］利用紫外線誘發(fā)人外周血淋巴細胞DNA修復過程，發(fā)現(xiàn)年輕人供體細胞的DNA修復能力高于中、老年人供體細胞。Nette等［16］測定了人上皮角化細胞的DNA修復能力，發(fā)現(xiàn)其修復能力隨細胞供體年齡的增長而降低。韓宗超等［17］對大鼠衰老神經細胞DNA氧化損傷與修復進行研究，結果發(fā)現(xiàn)，無論是衰老細胞還是正常細胞，當DNA受損時，都具備一定的自我修復能力，但衰老神經元的DNA易損性增加，修復性能較差。這些研究均提示細胞DNA抗損傷能力下降與衰老過程存在因果關系。

4 衰老基因與細胞衰老

在人類細胞方面，衰老相關基因的研究，近年來有較大進展。20世紀90年代以來，紛紛報道人1、4、6、7、11、18號染色體與X染色體上各自存在著與衰老相關的基因。Smith等［18］領導的研究組利用細胞與細胞融合技術研究表明，至少有四套基因或基因通路與衰老有關。該研究組的Bryce等［19］發(fā)現(xiàn)了位于第4號染色體的一種稱為MORF4(mortality factor from chromosome 4)的基因與衰老密切相關。該基因在衰老和生長靜止細胞中高表達，它的突變可引起細胞永生化。此外，Sugawara等［20］與Klein等［21］曾分別報道人的第1號染色體長臂與X染色體有促進細胞衰老的基因，從人二倍體成纖維細胞篩選出了一種衰老協(xié)同基因，其在衰老細胞中的表達比年輕細胞高3倍，而且它的增高程度與細胞生長能力的降低密切相關。

5 長壽基因與細胞衰老

機體內存在一些與長壽或抗衰老有關的基因，目前已確定的與衰老或長壽有關的基因有10多種［4］，它們分別是 age-1、ras2p、lag-1、lac-1、daf-2、daf-16、daf-23、clk-1、spe-26、gro-1等。生物遺傳學家新近發(fā)現(xiàn)了兩類長壽基因:一類稱為蛋白質生物延長因子基因;一類稱為抗氧化酶類基因。這兩類基因可使生物體內代謝呈正氮平衡并保護人體組織免受自由基的損傷，延長人類壽命。Klotho基因是由Kuro-o等［22］在1997年研究自發(fā)性高血壓時發(fā)現(xiàn)的與抗衰老有關的基因。Klotho基因突變的小鼠會過早出現(xiàn)與人類衰老相似的癥狀，且壽命縮短，而其過度表達會使小鼠的壽命延長［23］。該基因主要表達于腎臟和腦組織，同時具有配體、受體和酶的功能，有調節(jié)鈣磷代謝、抗衰老、抗氧化、抗凋亡的作用，并以此實現(xiàn)對臟器的保護［24，25］。

6 p16基因與細胞衰老

pl6基因是近年來發(fā)現(xiàn)與衰老有關的調節(jié)基因，位于人類染色體9p21，在衰老的成纖維細胞、T淋巴細胞、角質細胞、上皮細胞、內皮細胞等細胞中表達增強。因其存在一個基因序列為GAAGGT的負調控元件，而年輕細胞中所含的相對分子質量為24×103的蛋白質因子可與此負調控元件結合，抑制p16基因表達(衰老細胞中缺乏此因子)，故 p16高表達［26］。有研究表明［27，28］，p16基因水平的升高是衰老即端粒持續(xù)性縮短的誘因，而非衰老的結果。抑制p16的表達DNA修復能力增強，端?？s短速度延緩，細胞衰老程度減輕，壽命延長。p16基因不僅可影響細胞壽命和端粒(細胞的生物鐘)長度，還被看作是人類細胞衰老遺傳控制程序中的主要環(huán)節(jié)之一。它促進衰老的分子機制是通過調節(jié)RB蛋白的活性，而非激活端粒酶起作用。RB蛋白是細胞周期G1/S期的調控因子，能與轉錄因子e2F(轉錄因子的一種)結合，阻斷DNA復制，抑制多種生命必需基因表達。p16基因所編碼的p16蛋白能夠抑制細胞周期依賴性激酶CDK4(為細胞周期依賴性激酶的一種)的活性，使靶蛋白不能被磷酸化，未被磷酸化或低磷酸化的RB蛋白與e2F結合，抑制其活力而引起細胞周期停滯［29，30］。

7 線粒體DNA損傷與細胞衰老

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)缺失突變與衰老關系的研究也是國內外研究衰老機制的熱點之一。mtDNA是細胞核外遺傳物質，為雙鏈閉合環(huán)狀結構，由16 569 bp組成［31］。mtDNA約占細胞總DNA的0.5%，不含內含子，約10%的線粒體蛋白質由其編碼，包括呼吸鏈中一些重要酶的亞基。在線粒體氧化磷酸化生成人ATP過程中，有1%～4%攝入的氧轉化為氧自由基，故線粒體是氧自由基產生的主要場所。線粒體DNA是裸露的，缺乏組蛋白和DNA結合蛋白的保護，易受氧自由基損傷，且損傷后因缺乏修復系統(tǒng)而不易被修復。因此，mtDNA突變率高，是核內DNA的10～100倍［32］。mtDNA損傷后可引起呼吸鏈有關蛋白質亞單位的合成障礙，形成有缺陷的呼吸鏈，呼吸鏈功能因此而受損，導致機體細胞ATP合成水平降低，提供給細胞的能量不足，從而出現(xiàn)一系列衰老表現(xiàn)，尤其是心、腦等以ATP為主要能源的代謝旺盛器官表現(xiàn)尤甚［33］。呼吸鏈功能下降，進一步引起自由基堆積，加重mtDNA損傷。隨增齡等因素，mtDNA突變累積，形成惡性循環(huán)，從而加速細胞衰老。

研究表明［34］，與衰老有關的mtDNA的突變有5種:①大片缺失;②點突變;③插入;④D-loop區(qū)小的串聯(lián)重復;⑤DNA重排。報道較多的是點突變和片段缺失。Michikawa等［35］研究發(fā)現(xiàn)，老年人成纖維細胞線粒體基因組DNA復制區(qū)點突變率較年輕人高。Cooper等［36］發(fā)現(xiàn)，人體骨骼肌mtDNA 5.0 kb片段丟失率21歲時僅為10－5，78歲時升至2×10－4;正常老年人心血管組織中還存在7.4 kb片段丟失，丟失頻率亦隨增齡而增加。Cortopassi等［37］發(fā)現(xiàn)成人心臟、肌肉和腦的mtDNA都存在一些片段缺失，但胎腦和胎心則無此現(xiàn)象，無論是點突變還是片段缺失，其頻率均隨增齡而增加。mtDNA片段丟失還與某些老年病有關，如2型糖尿病、帕金森病和阿爾茨海默病等［38］。

8 結語

細胞衰老機制復雜，導致衰老的因素也是多方面的，不存在走向衰老的統(tǒng)一通路，各種加速衰老的因素通過各自的途徑，導致細胞和機體某一功能的塌陷，繼而引起細胞和機體功能全面的塌陷，這可能是衰老的普遍機制［39］。無論是從整體水平，還是細胞與分子水平，各種學說相互之間并非對立，它們互為因果、相互補充或同時作用，但都有其局限性?？梢灶A料，深入探討衰老機制的新途徑對老年性疾病的研究具有重要的推動作用，對老年性疾病發(fā)生、發(fā)展的認識及有效防治具有劃時代的意義，必將為推遲老年帶病期的到來提供新的機遇。

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