脊髓和三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核投射神經(jīng)元亞群負(fù)責(zé)痛覺和癢覺信息加工

研究表明，初級傳入神經(jīng)元和脊髓中間神經(jīng)元類群具備區(qū)分痛覺和癢覺刺激模式的功能。然而，機(jī)體對特定刺激模式的感知并非源于腦對中間神經(jīng)元活動(dòng)的分析，而是源于腦對不同投射神經(jīng)元類群活動(dòng)的分析。因而，針對初級傳入神經(jīng)元和中間神經(jīng)元的異質(zhì)性和特異性的探究，已經(jīng)拓展到脊髓背角和三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核 (TNC) 的投射神經(jīng)元。解剖學(xué)研究鑒定了脊髓背角I層的3種形態(tài)學(xué)不同的投射神經(jīng)元，提示其可能具有功能異質(zhì)性。然而，有觀點(diǎn)認(rèn)為在分子水平上投射神經(jīng)元是相對同質(zhì)性的（盡管也有反對的證據(jù)）。神經(jīng)激肽1受體 (NK1R) 一直被認(rèn)為是脊髓背角I層和脊髓外側(cè)核 (LSN) 投射神經(jīng)元的主要標(biāo)志分子。最近研究表明

和

兩個(gè)基因定義了大量的投射神經(jīng)元（靶向臂旁核），其在傳遞不同疼痛刺激模式中發(fā)揮重要作用。近來，采用無偏向的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)鑒定出一類興奮性神經(jīng)元群體（表達(dá)Glut15），其中也包括了表達(dá)NK1R的脊髓-臂旁核投射神經(jīng)元。該研究中作者采用系列連續(xù)的過濾篩選步驟，鑒定出幾種不同分子類型的投射神經(jīng)元亞群，并探究了這些神經(jīng)元亞群傳遞痛覺和癢覺信息的功能異質(zhì)性。

首先，該研究采用基于復(fù)制缺陷的逆行單純皰疹病毒 (HSV) 構(gòu)建了編碼綠色熒光蛋白(GFP) 標(biāo)記的大核糖體亞單位蛋白L10 (HSV- GFPL10)的病毒載體。該病毒載體被注射到小鼠的臂旁外側(cè)核(LPb)中，誘導(dǎo)脊髓和TNC到臂旁核的投射神經(jīng)元表達(dá)GFP-L10，進(jìn)而可以對投射神經(jīng)元特異性的RNA進(jìn)行純化并測序。在平行研究中，作者將編碼一個(gè)Cre重組酶依賴的HA標(biāo)記L10 (HSV-flex-HAL10)的病毒載體注射到NK1R-Cre小鼠的LPb中（從注射HSV-GFPL10和HSV-flex-HAL10的小鼠中獲得的數(shù)據(jù)集，在后文中稱作“PN”或“NK”數(shù)據(jù)集）。2周后分別在野生型和NK1R-Cre小鼠的脊髓和TNC投射神經(jīng)元中記錄GFP-和HA-標(biāo)記的核糖體，并通過標(biāo)記的核糖體和相關(guān)mRNA免疫沉淀反應(yīng) (IP) 實(shí)驗(yàn)證實(shí)特異性免疫標(biāo)記的投射神經(jīng)元。

在qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證上述IP對投射神經(jīng)元的特異性后，作為第一步篩選步驟，對所有IP（GFP或HA標(biāo)記的核糖體）和輸入樣本（脊髓背角和TNC）進(jìn)行核糖體RNA測序，繪制“PN”和“NK”數(shù)據(jù)集內(nèi)以及相對于另一數(shù)據(jù)集的基因表達(dá)倍數(shù)變化圖。鑒于脊髓到臂旁核所有的I層投射神經(jīng)元約90%表達(dá)NK1R，作者猜想這兩個(gè)數(shù)據(jù)集有很大程度的重疊且大部分?jǐn)?shù)據(jù)點(diǎn)應(yīng)位于第一和第三象限，觀察到的結(jié)果也證實(shí)了他們的猜想。同時(shí)，在成年小鼠NK1R亞群（而不是非NK1R亞群）的投射神經(jīng)元中還觀察到Phox2a的富集。采用熒光原位雜交 (ISH)對投射神經(jīng)元標(biāo)記基因進(jìn)行第二步篩選，主要關(guān)注幾個(gè)位于第一象限且在PN或NK的RNA-seq和qPCR數(shù)據(jù)集中富集的與疼痛和/或癢覺信息處理相關(guān)的基因。首先從TNC中的投射神經(jīng)元開始分析，

基因編碼的膽囊收縮素是一種具有抗阿片作用的物質(zhì)。采用HSV-GFPL10逆行標(biāo)記LPb投射神經(jīng)元，并對TNC內(nèi)的

和

進(jìn)行雙熒光ISH，證實(shí)了在

投射神經(jīng)元中富集表達(dá)

基因。同時(shí)還觀察到大量

/

神經(jīng)元，表明大多數(shù)

細(xì)胞是中間神經(jīng)元，脊髓背角也呈現(xiàn)出類似的表達(dá)模式。神經(jīng)元正五聚蛋白2 (

) 基因與多種神經(jīng)精神障礙及疼痛信息的處理有關(guān)。與

類似，該研究還觀察到大量的

/

神經(jīng)元，表明絕大多數(shù)

細(xì)胞是中間神經(jīng)元。Neuromedin B (

) 是蛙皮素樣多肽家族的一員，并與疼痛和癢覺信息的處理有關(guān)。作者發(fā)現(xiàn)

在TNC中表達(dá)較少，且主要表達(dá)在淺層，其中一部分是

的LPb投射神經(jīng)元。促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素基因(

) 與外周和中樞疼痛信息處理有關(guān)。作者觀察到TNC淺層中存在

/

的LPb投射神經(jīng)元。

為了確定這些與投射神經(jīng)元相關(guān)的基因在NK1R神經(jīng)元亞群中的表達(dá)情況，對

和每個(gè)富集的基因進(jìn)行了雙熒光和三熒光的ISH實(shí)驗(yàn)。采用逆行示蹤熒光微粒直接標(biāo)記投射神經(jīng)元，并觀察

與富集基因共表達(dá)的細(xì)胞及只表達(dá)該基因或

的細(xì)胞。觀察到脊髓背角深層存在

/

神經(jīng)元，而I層則幾乎沒有。另外，在背角淺層和深層均觀察到了

與

、

和

共表達(dá)的神經(jīng)元，當(dāng)然也有很多只表達(dá)

或者富集基因的神經(jīng)元。對

、

和

進(jìn)行三熒光ISH，觀察了表達(dá)每種基因組合的神經(jīng)元亞型，并提出

的神經(jīng)元至少包含4個(gè)亞群：

、

、

和

。實(shí)際上，表達(dá)NK1R的投射神經(jīng)元群體并不是同質(zhì)性的，而

只是不同投射神經(jīng)元類群的一個(gè)標(biāo)志基因。近來研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)NK1R的投射神經(jīng)元亞群也表達(dá)P物質(zhì)（由

編碼）。該研究還發(fā)現(xiàn)

和

共表達(dá)在投射神經(jīng)元亞群中。

該研究通過Fos表達(dá)變化來監(jiān)測逆行標(biāo)記的投射神經(jīng)元亞群對疼痛刺激（將小鼠后腳掌置于50℃水中）或癢覺刺激（小鼠臉頰注射5.0 μg/μl氯喹）的反應(yīng)性。小鼠接受刺激20分鐘后，對其腰段脊髓和TNC進(jìn)行三重?zé)晒鈽?biāo)記ISH實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，刺激同側(cè)的脊髓淺層（I/II層）和III/IV層觀察到了熱誘導(dǎo)的

神經(jīng)元，并且這兩個(gè)區(qū)域均觀察到了

和

共標(biāo)的投射神經(jīng)元。平均約27%的

投射神經(jīng)元和約50%的

投射神經(jīng)元對傷害性熱刺激有反應(yīng)。在記錄到少量

或

細(xì)胞中，約27%的

投射神經(jīng)元和約50%的

投射神經(jīng)元對傷害性熱刺激有反應(yīng)。氯喹介導(dǎo)的

表達(dá)變化在刺激同側(cè)的TNC淺層最顯著。TNC中對氯喹有反應(yīng)的投射神經(jīng)元中，有約29%的

投射神經(jīng)元，約36%的

投射神經(jīng)元，約32%

投射神經(jīng)元和28%

投射神經(jīng)元。與氯喹反應(yīng)性的

神經(jīng)元有所不同，

神經(jīng)元主要分布在I層。結(jié)果表明，在脊髓背角和TNC的投射神經(jīng)元中，表達(dá)

、

、

和

的每個(gè)投射神經(jīng)元亞群中，約有三分之一對熱刺激和/或氯喹有反應(yīng)。

該研究采用TRAP2（活性類群神經(jīng)元靶向重組）小鼠來實(shí)現(xiàn)激活神經(jīng)元的可視化。在小鼠暴露于特定時(shí)間內(nèi)的刺激后，被激活的神經(jīng)元以Cre和Fos依賴性方式永久表達(dá)tdTomato (

) 紅色熒光。在小鼠注射4-OH-他莫西芬前1周，在LPb中注射熒光金 (FG)，從而實(shí)現(xiàn)對投射神經(jīng)元中匯聚處理刺激信息的分析。結(jié)果顯示，

熒光和

免疫反應(yīng)性在刺激同側(cè)的脊髓背角最顯著，

三標(biāo)的投射神經(jīng)元主要分布于I層。而

雙標(biāo)的中間神經(jīng)元主要位于II層。I層和V層中存在只對傷害性熱刺激有反應(yīng)的其他投射神經(jīng)元（如

/

神經(jīng)元）和只對癢覺刺激有反應(yīng)的其他投射神經(jīng)元（如

/

投射神經(jīng)元）。結(jié)果表明，大部分投射神經(jīng)元對兩種刺激的其中一種有反應(yīng)。只對熱刺激有反應(yīng)的投射神經(jīng)元主要分布在I層和II層，而只對氯喹有反應(yīng)的投射神經(jīng)元在脊髓各層都有分布。同一投射神經(jīng)元亞群既傳遞疼痛也傳遞癢覺信息給大腦，也存在對疼痛或癢覺或?qū)ζ渌碳じ哌x擇性的神經(jīng)元亞群。

最后，該研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)投射神經(jīng)元表達(dá)NK1R以及一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因，然而TRAP2分析表明這些投射神經(jīng)元也具有功能異質(zhì)性。目前認(rèn)為，初級感覺神經(jīng)元和脊髓背角的中間神經(jīng)元是異質(zhì)性的，即它們選擇性地對疼痛和/或瘙癢刺激作出不同程度的反應(yīng)。有證據(jù)表明，傳遞痛覺和癢覺信息的投射神經(jīng)元在分布、投射靶標(biāo)、形態(tài)學(xué)和電生理特性上呈現(xiàn)多樣性。該研究表明，投射神經(jīng)元亞群存在分子和功能異質(zhì)性，可以通過其在脊髓背角和TNC中的基因表達(dá)、空間位置以及對疼痛或瘙癢刺激的反應(yīng)性來進(jìn)行區(qū)分。

1.1 對象 2012年2月13—20日對全院臨床護(hù)士進(jìn)行調(diào)查。入選標(biāo)準(zhǔn):臨床科室護(hù)士，排除標(biāo)準(zhǔn):進(jìn)修等非本院護(hù)士。選取10個(gè)科室共158名護(hù)理人員。年齡22～50歲，平均年齡(31.7±7.2)歲;工作年限1～29 年，平均(10.3 ±8.4)年;學(xué)歷:中專 15 名，大專103名，本科37名;職稱:護(hù)士65名，護(hù)師52名，主管護(hù)師(包括護(hù)士長)37名。

為了整合理解投射神經(jīng)元的分子異質(zhì)性與功能異質(zhì)性，對受到疼痛或瘙癢刺激的TRAP2小鼠脊髓背角組織進(jìn)行多色非定量ISH分析。在注射4-OH-他莫西芬后，首先通過向小鼠后爪注射氯喹來激活癢覺反應(yīng)神經(jīng)元，1周后將同一只后爪浸泡在50℃的水中激活痛覺反應(yīng)性神經(jīng)元。在氯喹刺激1周前，這些小鼠LPb注射逆行示蹤熒光微粒標(biāo)記投射神經(jīng)元。在第2次刺激后，對

（標(biāo)記瘙癢反應(yīng)神經(jīng)元）、

（標(biāo)記疼痛反應(yīng)神經(jīng)元）、

、

、

和

基因進(jìn)行多色I(xiàn)SH。在脊髓背角淺層、深層以及LSN中，觀察到僅對疼痛刺激有反應(yīng)的投射神經(jīng)元（即

/

投射神經(jīng)元），同時(shí)也存在只對癢覺刺激有反應(yīng)的神經(jīng)元。此外，有一些投射神經(jīng)元對疼痛和瘙癢的刺激均有反應(yīng)，而另一些對兩者均無反應(yīng)。

6)AR技術(shù)為商業(yè)提供便捷的銷售方式?？煽诳蓸贰⑿前涂?、宜家等商家以AR技術(shù)做出一系列具有互動(dòng)性的廣告并拉近消費(fèi)者的距離，AR技術(shù)將顛覆傳統(tǒng)廣告行業(yè)[2]。

假定閾值λ可以將所有溫度變量分類到fλ個(gè)分組中,即u1,u2,…,ufλ。如果第i個(gè)分組ui包含q個(gè)溫度變量,則在分組ui(i=1,2,…,fλ)中的每個(gè)溫度變量序列可以表示為:

綜上所述，該研究首次對投射神經(jīng)元亞群的分子標(biāo)簽和功能特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。首先對投射神經(jīng)元進(jìn)行RNA測序，獲得投射神經(jīng)元候選標(biāo)記基因的數(shù)據(jù)集，接下來結(jié)合逆行追蹤和多色原位雜交鑒定出一些新的標(biāo)記基因。最后，采用TRAP2小鼠進(jìn)行了功能研究，評估疼痛和瘙癢刺激下投射神經(jīng)元的反應(yīng)程度，并闡明了分子多樣性的投射神經(jīng)元類群亦具有功能異質(zhì)性。該研究報(bào)道了疼痛和癢覺信息在表達(dá)NK1R和不表達(dá)NK1R的不同投射神經(jīng)元亞群中的信息匯聚。這與痛覺和癢覺信息處理的群體編碼模型相吻合，然而在痛覺和癢覺的產(chǎn)生過程中，如何整合專一線路(a labeled line)與使用群體編碼的投射神經(jīng)元的輸出以及大腦如何解讀這些信息，仍有待進(jìn)一步探究。