小動(dòng)物可見(jiàn)光活體成像技術(shù)在醫(yī)學(xué)研究生技能教學(xué)中的應(yīng)用

盧宏濤　劉蘇　韓玲　沈慧

【摘要】小動(dòng)物可見(jiàn)光活體成像技術(shù)是一項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用廣、實(shí)用性強(qiáng)的生物醫(yī)學(xué)研究手段，但由于實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高，相關(guān)儀器貴重，目前尚缺乏相關(guān)課程應(yīng)用到研究生技能教學(xué)中。本課程利用國(guó)家級(jí)教學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，系統(tǒng)性地針對(duì)醫(yī)學(xué)研究生開(kāi)展了小動(dòng)物活體成像技術(shù)應(yīng)用與操作這門課程，利用16個(gè)理論學(xué)時(shí)，14個(gè)實(shí)踐學(xué)時(shí)全面系統(tǒng)地完成課程教育，最終達(dá)到研究生能夠獨(dú)立熟練地完成相關(guān)實(shí)驗(yàn)技能。

【關(guān)鍵詞】小動(dòng)物活體成像? 技能培訓(xùn)? 研究生教學(xué)

【基金項(xiàng)目】海軍軍醫(yī)大學(xué)重點(diǎn)課程建設(shè)項(xiàng)目“小動(dòng)物活體成像技術(shù)與應(yīng)用”。

【中圖分類號(hào)】G64? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-3089（2021）07-0014-02

小動(dòng)物可見(jiàn)光活體成像技術(shù)是采用生物發(fā)光與熒光兩種方式，利用高靈敏度的光學(xué)檢測(cè)儀器直接檢測(cè)動(dòng)物活體體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為，利用該技術(shù)可以檢測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移、炎癥的發(fā)生、特定基因的表達(dá)和藥物研究、細(xì)胞凋亡及流行病學(xué)等領(lǐng)域的研究。但由于小動(dòng)物可見(jiàn)光活體成像設(shè)備稀缺貴重，在高校的研究生課程中一般不設(shè)立該課程的理論和技能教學(xué)。然而，隨著生物醫(yī)學(xué)研究的深入與發(fā)展，小動(dòng)物可見(jiàn)光活體成像技術(shù)在科學(xué)研究中的應(yīng)用越來(lái)越普遍，已成為一項(xiàng)常規(guī)的生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段。所以本課程通過(guò)利用國(guó)家級(jí)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心的平臺(tái)設(shè)備，開(kāi)展技術(shù)應(yīng)用廣泛、實(shí)用性強(qiáng)的小動(dòng)物可見(jiàn)光活體成像技術(shù)的研究生技能教學(xué)。

目前，高等院校利用自身已有平臺(tái)開(kāi)展具有實(shí)踐價(jià)值，能夠快速促進(jìn)研究生投入科研工作的技能教學(xué)課程已成為一項(xiàng)重要的研究生培養(yǎng)教育改革內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)技能是醫(yī)學(xué)研究生不可缺乏的基本技能，在研究生課程學(xué)習(xí)階段推廣深入技能實(shí)踐培訓(xùn)有利于研究生快速進(jìn)入科研狀態(tài)。小動(dòng)物可見(jiàn)光活體成像技術(shù)的技能教學(xué)應(yīng)用到研究生培養(yǎng)中，對(duì)高校研究生教育培養(yǎng)有積極的推動(dòng)作用。

一、材料與方法

1.儀器設(shè)備

Bio-Real公司的Quickview 3000小動(dòng)物活體成像系統(tǒng);ESCO公司的細(xì)胞培養(yǎng)箱;BIOBASE公司的生物安全柜。

2.實(shí)驗(yàn)試劑與材料

免疫缺陷裸鼠購(gòu)于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司;熒光素鉀鹽購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;腫瘤細(xì)胞株購(gòu)于上海研酶生物科技有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)于上海雁金生物科技有限公司。

3.實(shí)驗(yàn)步驟

步驟1：目標(biāo)基因及熒光素酶基因或者熒光蛋白基因?qū)氲綄?shí)驗(yàn)需要的細(xì)胞內(nèi)。可以將學(xué)生分成兩組，一組學(xué)生使用熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞株，另一組學(xué)生使用熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞株，讓學(xué)生在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中了解兩種方法的特點(diǎn)和差異。

步驟2：篩選出穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶或者熒光蛋白的細(xì)胞。步驟1和步驟2根據(jù)課時(shí)要求可以讓學(xué)生使用已經(jīng)構(gòu)建好的細(xì)胞株。將準(zhǔn)備好的細(xì)胞株復(fù)蘇，擴(kuò)增，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量將細(xì)胞以不同數(shù)量種于96孔板內(nèi)，貼壁后利用小動(dòng)物活體成像儀確定能夠檢測(cè)的細(xì)胞量閾值。

步驟3：細(xì)胞擴(kuò)增到足夠量之后，將細(xì)胞消化，使用培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)（可以讓學(xué)生學(xué)習(xí)細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法），按照每個(gè)部位107細(xì)胞量接種腫瘤細(xì)胞，荷瘤小鼠一般選用免疫缺陷的裸鼠，荷瘤部位一般選擇軀干兩側(cè)接近腋下的部位，荷瘤時(shí)注意注射器穿刺的深淺，以形成表皮的皮丘為宜。

步驟4：腫瘤細(xì)胞接種一周后，基本可以肉眼觀察到腫瘤的生長(zhǎng)，可以定期使用Bio-real小動(dòng)物成像儀觀察荷瘤小鼠腫瘤的大小以及生長(zhǎng)情況。

步驟5：準(zhǔn)備好待測(cè)小動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)材料，并稀釋螢光素鉀鹽溶液至工作濃度。

步驟6：打開(kāi)小動(dòng)物活體成像儀及電腦，打開(kāi)軟件，點(diǎn)擊生物發(fā)光模式，在此期間CCD會(huì)降溫至-80℃。在降溫時(shí)，向麻醉泵中注入適量異氟烷，調(diào)節(jié)麻醉劑和氧氣閥門，麻醉劑調(diào)至2刻度，氧氣調(diào)至3刻度，打開(kāi)控制麻醉劑的三通管閥門，使小動(dòng)物麻醉箱中充入異氟烷。

步驟7：將適量螢光素鉀鹽注入（尾靜脈/腹腔）到小鼠體內(nèi)后，控制好時(shí)間，一般腹腔注射15min后，將小鼠放入到麻醉箱中，進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉。（如果是熒光蛋白無(wú)需此操作）

步驟8：小鼠麻醉后，打開(kāi)通向成像系統(tǒng)的麻醉管閥門，打開(kāi)麻醉盒取出小鼠，將小鼠放入到觀察位置上，并將小鼠嘴部對(duì)準(zhǔn)麻醉孔，同時(shí)將小鼠擺出適宜觀察的姿勢(shì)，關(guān)閉通向麻醉盒的閥門，關(guān)閉儀器封閉門。

步驟9：打開(kāi)focus按鈕，觀察小鼠放置情況，調(diào)整視野的大小，打開(kāi)平臺(tái)控溫板，保證小鼠在37℃條件下維持體溫。打開(kāi)生物發(fā)光，設(shè)置曝光時(shí)間（一般30～60s）、放大倍數(shù)（超過(guò)500則沒(méi)有意義）。

步驟10：點(diǎn)擊start，開(kāi)始測(cè)定，也可選擇連續(xù)曝光。

步驟11：在得到的圖像上，可觀察得到數(shù)據(jù)，進(jìn)入軟件分析系統(tǒng)，自動(dòng)或手動(dòng)計(jì)算發(fā)光強(qiáng)度。點(diǎn)擊export，保存圖像及數(shù)據(jù)到固定文件夾。

步驟12：關(guān)閉儀器前，點(diǎn)擊cool off，使CCD升溫到0℃以上方可關(guān)閉儀器及電腦。

二、實(shí)驗(yàn)原理

1.熒光成像原理

熒光物質(zhì)的分子在受到能量的激發(fā)后，其核外電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，而激發(fā)態(tài)的電子處于高能量狀態(tài)，并不穩(wěn)定，其可以通過(guò)釋放光子的形式回到基態(tài)，在這個(gè)過(guò)程中發(fā)射出的光子稱之為熒光。不同的物質(zhì)的激發(fā)光和發(fā)射光的廣譜有所不同，需要檢測(cè)的設(shè)備具備相應(yīng)的濾光片。熒光物質(zhì)被激發(fā)后所發(fā)射的熒光信號(hào)的強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)是與熒光素存在的量成線性關(guān)系的，這是熒光成像系統(tǒng)應(yīng)用于生物學(xué)研究的理論基礎(chǔ)。

2.生物發(fā)光的原理

將螢光素酶基因整合到細(xì)胞的基因組當(dāng)中去，讓細(xì)胞可以穩(wěn)定表達(dá)螢光素酶，當(dāng)外源性的給與細(xì)胞或者動(dòng)物螢光素酶的底物時(shí)，同時(shí)在細(xì)胞中ATP的參與下，螢光素酶催化底物與ATP發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光子，稱之為生物發(fā)光。發(fā)光的強(qiáng)度與標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量呈線性關(guān)系，通過(guò)檢測(cè)發(fā)錯(cuò)生物光的強(qiáng)度來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的數(shù)量水平。

3.生物發(fā)光和熒光成像的特點(diǎn)

生物發(fā)光和熒光成像有各自的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)，與熒光成像技術(shù)相比較，生物發(fā)光成像技術(shù)主要的優(yōu)勢(shì)有信號(hào)特異性強(qiáng)，不存在本底自發(fā)光的干擾;靈敏度高，可以檢測(cè)102的細(xì)胞量;精準(zhǔn)定量，單位細(xì)胞的發(fā)光數(shù)量穩(wěn)定。而相對(duì)于生物發(fā)光成像技術(shù)，熒光成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在應(yīng)用范圍廣，熒光標(biāo)記物種類繁多且可多重標(biāo)記;信號(hào)強(qiáng)度大，激發(fā)光能量轉(zhuǎn)移保證信號(hào)強(qiáng)度;低毒性成本，無(wú)需注射底物且成本低;商業(yè)可獲得性，成熟的商品性熒光標(biāo)記物選擇多;樣本要求低，基于能量轉(zhuǎn)移而無(wú)需考慮生物是否存活。

三、實(shí)例說(shuō)明：利用小動(dòng)物活體成像技術(shù)評(píng)價(jià)藥物抗腫瘤作用

1.熒光素酶標(biāo)記腫瘤細(xì)胞的構(gòu)建

將獲得的Hela腫瘤細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板當(dāng)中，接種細(xì)胞量為105/孔，24h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，確定細(xì)胞生長(zhǎng)正常后進(jìn)行熒光素酶質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染試劑使用Lipofectamin 2000，具體操作步驟及試劑使用量參照說(shuō)明書(shū)。將細(xì)胞分為空載體組和熒光素酶基因轉(zhuǎn)染組，每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔重復(fù)。轉(zhuǎn)染后48h，觀察細(xì)胞狀態(tài)以及細(xì)胞的密度，細(xì)胞長(zhǎng)滿后按照1∶5的比例進(jìn)行傳達(dá)。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒帶有嘌呤霉素抗性基因，因此加入嘌呤霉素對(duì)未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞進(jìn)行篩選，從而獲得陽(yáng)性細(xì)胞。擴(kuò)張帶熒光素酶基因的陽(yáng)性Hela細(xì)胞，并按照倍比稀釋的原理檢測(cè)熒光素酶活性。

2.荷瘤小鼠模型構(gòu)建

將擴(kuò)增好的Hela腫瘤細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)要求種于裸鼠的皮下或者其他臟器，細(xì)胞量在1×107左右，皮下荷瘤時(shí)注意荷瘤的深度，不易過(guò)深，以形成小皮丘為準(zhǔn)。設(shè)立荷瘤組和藥物治療組（可讓學(xué)生選擇一種治療藥物），每組6只小鼠，小鼠在荷瘤一周后，讓學(xué)生觀察肉眼下腫瘤的生長(zhǎng)情況，對(duì)比治療組和荷瘤組腫瘤大小以及小鼠的一般狀況。

3.荷瘤小鼠活體腫瘤檢測(cè)

D-螢光素鉀鹽的水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細(xì)胞膜和血腦屏障，在體內(nèi)擴(kuò)散速度快，可通過(guò)腹腔注射或尾靜脈注射進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)。腹腔注射或尾靜脈注射時(shí)，按照10μl/g的體重濃度，向小鼠體內(nèi)注射螢光素鉀鹽溶液，如20g的小鼠，注射200μl共3.0mg D-螢光素鉀鹽。小鼠腹腔注射熒光素酶底物D-螢光素鉀鹽后，利用異氟烷在小動(dòng)物氣體麻醉箱內(nèi)麻醉，調(diào)整好適當(dāng)?shù)穆樽韯┖脱鯕獾牧髁俊Ｔ诖似陂g做好設(shè)備的開(kāi)機(jī)與CCD預(yù)冷準(zhǔn)備，調(diào)至生物發(fā)光模式，打開(kāi)小動(dòng)物恒溫平臺(tái)，調(diào)整好視野。注射入體內(nèi)10～20min后，待螢光信號(hào)達(dá)到最強(qiáng)穩(wěn)定平臺(tái)期，再用適當(dāng)儀器進(jìn)行成像分析。待小鼠完全麻醉后將其移入檢測(cè)箱內(nèi)，小鼠口鼻對(duì)準(zhǔn)麻醉氣孔，關(guān)閉檢測(cè)箱門，確定密封性，可使用連續(xù)曝光模式確定最佳曝光時(shí)間，初始可曝光30s，放大倍數(shù)100。

4.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

完成曝光后，觀察腫瘤部位的信號(hào)強(qiáng)度，調(diào)整信號(hào)的最大最小的閾值，以腫瘤細(xì)胞易于觀察且具有區(qū)分度為宜，一般而言，腫瘤中心的腫瘤細(xì)胞最多光強(qiáng)度最大，周圍呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)，但有時(shí)如果腫瘤生長(zhǎng)過(guò)快，腫瘤中心細(xì)胞壞死，則會(huì)導(dǎo)致中間信號(hào)弱。小動(dòng)物活體成像圖像處理軟件除了提供含有光子強(qiáng)度標(biāo)尺的成像圖片外，還能計(jì)算分析發(fā)光面積、總光子數(shù)、光子強(qiáng)度的相關(guān)參數(shù)供實(shí)驗(yàn)者參考。在分析界面中可選擇自動(dòng)選擇或者手動(dòng)選擇信號(hào)圖像范圍。

四、實(shí)驗(yàn)影響因素

1.成像過(guò)程中的曝光時(shí)間，曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則非特異性雜信號(hào)比較多;時(shí)間過(guò)短，信號(hào)太弱無(wú)法有效觀察目前信號(hào)。為保證每只實(shí)驗(yàn)樣本之間具有可比性，同一批實(shí)驗(yàn)需要保持曝光時(shí)間及放大倍數(shù)一致。

2.動(dòng)物品系的選擇也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成影響，普通小鼠因?yàn)閹в衅っ?，本身?duì)于光子的穿透具有阻礙作用，因此一般選擇裸鼠。另外，熒光模式下，小鼠的毛發(fā)會(huì)具有熒光特性，從而干擾實(shí)驗(yàn)的觀察。

3.熒光成像時(shí)，需要選擇背景低的材料放于動(dòng)物身體下，可以選擇放置黑色的紙板，從而減小背景的干擾。

4.熒光蛋白的特性會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的效果，一般而言，波長(zhǎng)越長(zhǎng)，熒光的穿透力就越強(qiáng)，越容易透過(guò)小鼠皮毛被檢測(cè)到;綠色熒光蛋白波長(zhǎng)較短，不適宜小鼠的活體成像。

5.注射螢光素酶底物的方式與時(shí)間會(huì)影響生物發(fā)光的信號(hào)強(qiáng)弱，理論上尾靜脈注射發(fā)光強(qiáng)度到達(dá)峰值的時(shí)間要短于腹腔注射，同時(shí)發(fā)光強(qiáng)度到到峰值之后會(huì)出現(xiàn)衰減的情況，因此，同一批實(shí)驗(yàn)在保障注射方式一致的情況下，還應(yīng)控制注射后到檢測(cè)的時(shí)間一致。

五、結(jié)論與分析

本研究生課程共計(jì)30個(gè)學(xué)時(shí)，其中理論學(xué)時(shí)16個(gè)，實(shí)踐學(xué)時(shí)14個(gè)，課程對(duì)包括活體成像技術(shù)的發(fā)展、原理、特點(diǎn)與實(shí)例操作等進(jìn)行了全面、具體、系統(tǒng)的教學(xué)。教學(xué)過(guò)程中涉及實(shí)驗(yàn)方法的選擇、實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)的技術(shù)、儀器設(shè)備的操作以及最后結(jié)果的呈現(xiàn)等各方面的環(huán)節(jié)，讓研究生既能學(xué)到理論知識(shí)，又能掌握具體的操作，并獲得更多的參與感。小動(dòng)物活體成像技術(shù)應(yīng)用與操作研究生課程的實(shí)施推動(dòng)了醫(yī)學(xué)類高校針對(duì)研究生技能培訓(xùn)的教學(xué)改革。

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作者簡(jiǎn)介：

盧宏濤（1990年10月-），男，助教，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事預(yù)防醫(yī)學(xué)相關(guān)教學(xué)與科研工作。

沈慧（1977年1月-），男，教授，醫(yī)學(xué)博士，主要從事預(yù)防醫(yī)學(xué)相關(guān)教學(xué)與科研工作。