加味牛蒡子湯促進(jìn)自發(fā)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠淋巴管生成抑制炎癥免疫反應(yīng)

方 葉，王曉赟，尤佳鋒，梁倩倩,3,4，鄭為超

(1．安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽 淮南 232001；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032；3.上海市中醫(yī)藥研究院脊柱病研究所，上海 200032；4.筋骨理論與治法教育部重點實驗室，上海 200032)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種有多種炎癥性細(xì)胞因子浸潤和大量免疫細(xì)胞參與的自身免疫性疾病，它表現(xiàn)為一個侵蝕性、破壞性的過程[1]。目前，臨床上針對RA沒有較好的根治方法和治療藥物，且療效較佳的相關(guān)生物制劑價格昂貴，不良反應(yīng)發(fā)生率高。因此，尋找到RA有效療法和治療藥物是亟待解決的臨床問題。

淋巴系統(tǒng)是溝通全身免疫調(diào)節(jié)的重要介質(zhì)。淋巴管參與運送免疫細(xì)胞，承載營養(yǎng)物質(zhì)，維持機(jī)體體液平衡[2]。淋巴管通過排出滲出液、抗原、炎癥介質(zhì)和抗原提呈細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，淋巴管的重塑和擴(kuò)張對炎癥消退、組織愈合具有重要意義[3]。

中醫(yī)認(rèn)為RA屬“痹癥”，痹而不通，不通則痛[4]。炎癥狀態(tài)下，淋巴功能障礙與中醫(yī)“痹癥”理論不謀而合[5]。多年來，中藥在緩解和改善RA臨床癥狀方面取得了較好的效果[6]。加味牛蒡子湯是上海中醫(yī)藥大學(xué)施杞教授結(jié)合石氏傷科診療方法創(chuàng)制出的治療痰瘀互結(jié)型RA的經(jīng)典方。本項目組前期研究發(fā)現(xiàn)，加味牛蒡子湯能夠彌補炎癥狀態(tài)下淋巴回流功能受損，改善關(guān)節(jié)周圍體液微循環(huán)，減輕關(guān)節(jié)炎癥[7]。但關(guān)于加味牛蒡子湯是否影響淋巴管的生成和分布以其對機(jī)體炎癥免疫反應(yīng)的藥理作用尚不清楚。本文將從更加直觀的角度探討加味牛蒡子湯對炎癥狀態(tài)下淋巴管新生及機(jī)體免疫反應(yīng)的藥理效應(yīng)。

1 材料

1.1 實驗動物2只2月齡攜帶人類雜合子TNF-α基因的種鼠由希臘亞歷山大弗萊明生物醫(yī)學(xué)免疫學(xué)研究所的G.Kollias博士友好贈予，交與上海南方模式公司飼養(yǎng)繁育，與C57BL/6小鼠進(jìn)行回交，保持所得動物為攜帶一個人類腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)基因副本的雜合子，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2017-0010。研究選用3月齡左右清潔級TNF-Tg♀小鼠作為RA模型，并另選相應(yīng)同窩野生型C57BL/6小鼠進(jìn)行對照。

1.2 藥物與試劑

1.2.1中藥 加味牛蒡子湯藥物組成:炒牛蒡子9 g 僵蠶9 g 三七12 g 獨活9 g 秦艽6 g 半夏9 g黃芪12 g。上述藥物均購自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房,將中藥經(jīng)煎提后制成含生藥0.99 kg·L-1的水提物。

1.2.2試劑 福爾馬林固定液(Wexis，5205000)，蘇木精(Hematoxylin，Sigma，H3136-25G)、阿爾新藍(lán)(Alcian blue 8GX，Sigma，A5268)、伊紅(Eosin Y，Sigma，E4009-5G)、熒光桃紅B(Phloxine B，Sigma，P2759-25G)、橙黃G(Orange G，Sigma，O3756-25G)、硫酸鋁銨(Sigma，A-2140)、碘酸鈉(Sodium iodate，Sigma，S4007-100G)，中性封片樹膠(上海標(biāo)本模型廠)，抗原修復(fù)液(雷根生物，IH0310)，牛血清白蛋白(BioFroxx,4240GR100)，PBS(Medicago，09-2052-100)，透膜劑(Triton?X-100，BioFroxx,1139ML100)，抗TNF-α抗體(R&D Systems,AF-410-SP)，抗F4/80抗體(Abcam,ab204266),抗iNOS抗體(Abcam,ab209027、ab3523),抗LYVE-1抗體(Abcam,ab14917),抗Podoplanin抗體(Abcam,ab11936),抗倉鼠二抗(Invitrogen，A21111),抗兔二抗(Cell signaling,#4412s),即用型免疫組化試劑盒(博士德生物，SA1022、SA1023)，免疫熒光封片劑(Vector vectashield，H-1200)

1.3 儀器組織脫水機(jī)(LEICA,TP1020)，石蠟包埋機(jī)(LEICA，EG1150C)，切片機(jī)(LEICA，RM2135)，展片機(jī)(LEICA，HI1210)，Olympus全片掃描圖像采集系統(tǒng)(OLMPUS，VS120-SL)。

2 方法

2.1 動物分組及給藥將3月齡左右的10只TNF-Tg小鼠隨機(jī)分成兩組，每組5只，另取5只同窩野生型小鼠作為對照。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，給予RA模型組(生理鹽水組)和對照組小鼠生理鹽水灌胃，加味牛蒡子湯組給予加味牛蒡子湯藥物灌服。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)小鼠(20 g)與人(70 kg)體質(zhì)量比，中藥劑量換算系數(shù)為9.01[4]，按小鼠10 mL·kg-1·d-1灌胃給藥，連續(xù)12周。

2.2 標(biāo)本處理末次給藥后，間隔24 h，處死小鼠，踝關(guān)節(jié)用10%福爾馬林固定液固定過夜，置于14%的EDTA脫鈣液中持續(xù)脫鈣21 d，期間每72 h更換一次脫鈣液。取出脫鈣完成的踝關(guān)節(jié)，流水沖洗2 h，梯度脫水后，包埋，行4 μm厚度連續(xù)切片，備染。

2.3 ABOG染色石蠟切片脫蠟至水，阿爾新藍(lán)-蘇木精混合染液浸染1.5 h，鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)，水洗，橙紅染液浸染3 min，乙醇梯度脫水，二甲苯通透，中性樹膠封片。VS120全片掃描儀(明場模式)觀察藍(lán)染的軟骨、粉橙色骨組織以及藍(lán)紫色的炎癥浸潤面積。

2.4 TNF-α、iNOS免疫組織化學(xué)染色石蠟切片脫蠟至水，組化筆畫圈，胰蛋白酶37 ℃抗原修復(fù)10 min，流水沖洗，按免疫組化試劑盒操作，經(jīng)雙氧水去除內(nèi)源性過氧化物酶15 min，正常山羊血清封閉1 h，一抗(TNF-α、iNOS)4 ℃避光孵育過夜，流水沖洗，PBS浸洗3次，生物素化二抗和SABC復(fù)合物各處理30min，DAB顯色，水洗，蘇木精染核，鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯通透，中性樹膠封片。VS120全片掃描儀(明場模式)觀察TNF-α、iNOS的表達(dá)。

2.5 M1型巨噬細(xì)胞免疫熒光染色石蠟切片脫蠟至水，組化筆畫圈，胰蛋白酶37 ℃抗原修復(fù)10 min，水洗，37 ℃恒溫箱內(nèi)封閉1 h，一抗(F4/80和iNOS分別以1 ∶400和1 ∶200比例稀釋)混合液4 ℃避光過夜，流水沖洗，PBS浸洗3次，熒光封片劑封片。VS120全片掃描儀(熒光模式)觀察踝關(guān)節(jié)附近炎癥性M1型巨噬細(xì)胞的分布情況。

2.6 淋巴管免疫熒光染色石蠟切片脫蠟至水，組化筆畫圈，胰蛋白酶37 ℃抗原修復(fù)10 min，水洗，37 ℃恒溫封閉1 h，一抗(LYVE-1和Podoplanin均以1 ∶500 比例稀釋)一抗混合液4 ℃過夜，流水沖洗，PBS浸洗3次，抗兔和抗倉鼠二抗(1 ∶400比例稀釋)混合液避光孵育1 h，流水沖洗，PBS浸洗3次，熒光封片劑封片。VS120全片掃描儀(熒光模式)觀察淋巴管分布情況。

3 結(jié)果

3.1 加味牛蒡子湯對TNF-Tg小鼠骨與軟骨侵蝕和炎癥浸潤的影響ABOG染色顯示，與對照組小鼠相比，生理鹽水組的TNF-Tg小鼠的距骨矢狀面完整性嚴(yán)重破壞，邊界模糊，骨髓腔丟失,骨和軟骨侵蝕嚴(yán)重，藍(lán)紫色的炎癥浸潤面積明顯增加。加味牛蒡子湯治療明顯減少了TNF-Tg小鼠的炎癥面積，踝關(guān)節(jié)距骨輪廓逐漸清晰，軟骨結(jié)構(gòu)開始恢復(fù)，連續(xù)性結(jié)構(gòu)得以保存，骨量明顯增加，軟骨侵蝕明顯改善，P<0.01，(Fig1)。

Fig 1 Histological changes of n=5)Blue stain indicates cartilage,blue-purple stain indicates inflammation.**P<0.01 vs control,##P<0.01 vs saline.

3.2 加味牛蒡子湯對TNF-Tg小鼠炎癥因子TNF-α、iNOS表達(dá)的影響與對照組小鼠相比，生理鹽水組的TNF-Tg小鼠炎癥細(xì)胞因子TNF-α、iNOS的陽性染色明顯較多，加味牛蒡子湯治療組較生理鹽水組小鼠炎癥因子的陽性表達(dá)明顯減少，P<0.01，(Fig2)。

Fig 2 Expression of inflammatory cytokines Black arrows indicate positive staining.**P<0.01 vs control；##P<0.01 vs saline.

3.3 加味牛蒡子湯對TNF-Tg小鼠M1型巨噬細(xì)胞浸潤的影響F4/80和iNOS雙熒光標(biāo)記炎癥性M1型巨噬細(xì)胞的免疫熒光染色圖片顯示，對照組小鼠相較于TNF-Tg小鼠幾乎未見M1型巨噬細(xì)胞，生理鹽水組小鼠炎癥性巨噬細(xì)胞數(shù)量較多，關(guān)節(jié)炎癥加重，加味牛蒡子湯治療組小鼠踝關(guān)節(jié)周圍M1型巨噬細(xì)胞明顯減少，炎癥免疫反應(yīng)減弱，P<0.01，(Fig3)。

Fig 3 Effect of inflammatory macrophages of type n=5)Yellow stain indicates inflammatory macrophages of type M1.**P<0.01 vs control；##P<0.01 vs saline.

3.4 加味牛蒡子湯對TNF-Tg小鼠踝關(guān)節(jié)周圍淋巴管新生的影響雙標(biāo)記淋巴管免疫熒光染色圖片顯示，TNF-Tg小鼠淋巴管明顯增生，淋巴管面積相對增多；加味牛蒡子湯治療后，踝關(guān)節(jié)區(qū)域LYVE-1+/Podoplanin+的毛細(xì)淋巴管新生增加(P<0.05)，分布更廣，且毛細(xì)淋巴管匯集而成的LYVE-1-/Podoplanin+的成熟淋巴管的數(shù)量明顯增多，面積明顯增大(P<0.01),(Fig4)。

Fig 4 Effect of lymphangiogenesis and n=5)White arrows indicate lymphatic vessels of LYVE-1+/Podoplanin+;Blue arrows indicate lymphatic vessels of LYVE-1-/Podoplanin+.**P<0.01 vs control；#P<0.05，##P<0.01 vs saline.

4 討論

RA的發(fā)生和發(fā)展過程伴隨著強烈的炎癥免疫反應(yīng)、組織病理改變和淋巴循環(huán)功能的變化。RA急性炎癥階段，淋巴回流功能增加[8]，有利于代償調(diào)節(jié)機(jī)體局部炎癥免疫環(huán)境，對抗急性炎癥反應(yīng)，避免機(jī)體進(jìn)一步損傷；而在RA慢性發(fā)展過程中，大量炎癥因子刺激下，淋巴管收縮功能受損，導(dǎo)致淋巴回流功能下降[9]?？梢?，淋巴系統(tǒng)功能和RA的發(fā)展過程密切相關(guān)。淋巴系統(tǒng)通過影響滲出液、炎癥介質(zhì)和炎性免疫細(xì)胞的數(shù)量在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[10]。炎癥下，淋巴管生成有多種細(xì)胞參與，巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生血管內(nèi)皮生成因子(包括VEGF-C和VEGF-D以及基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9等)為淋巴管提供重要的生長環(huán)境[11]，且維持巨噬細(xì)胞極化水平穩(wěn)態(tài)有助于抵抗炎癥，促進(jìn)組織愈合[12]。阻斷VEGF-C/VEGFR-3信號通路，淋巴生成和擴(kuò)張受阻，加劇許多炎癥性疾病[10]。此外，炎癥條件下，淋巴管是T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞運輸?shù)年P(guān)鍵通道，參與塑造和協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)；反之，巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞可提供影響淋巴管的生長、發(fā)育和活動的信號和細(xì)胞因子微環(huán)境，二者之間相互承載、相互作用[2]。前期研究發(fā)現(xiàn)，RA炎癥下淋巴管的淋巴回流受阻、循環(huán)不暢，給予RA模型小鼠炎癥性關(guān)節(jié)局部注射VEGF-C過表達(dá)腺病毒，能夠增加淋巴管新生，減輕炎癥免疫反應(yīng)[13]。在RA模型小鼠腹腔內(nèi)注射VEGFR-3中和性抗體，就會抑制淋巴管生成和回流功能，加重關(guān)節(jié)炎癥[14]?？梢?，淋巴管新生和擴(kuò)張能夠彌補淋巴回流功能受損，改善微循環(huán)，反饋調(diào)節(jié)炎癥免疫反應(yīng)，是機(jī)體的自我保護(hù)的補償機(jī)制之一。因此，基于淋巴系統(tǒng)激活在炎癥中的有益作用，探尋促進(jìn)靶向調(diào)節(jié)淋巴循環(huán)系統(tǒng)的形態(tài)和功能的藥物，可能是炎癥病理中一個很有前景的治療方法。

中醫(yī)認(rèn)為痰瘀痹病是RA的重要病因，化痰逐瘀散結(jié)法調(diào)控淋巴循環(huán)系統(tǒng)功能對RA的治療有重要意義[15]。加味牛蒡子湯是上海中醫(yī)藥大學(xué)施杞教授根據(jù)“以氣為主、以血為先、痰瘀兼顧”的學(xué)術(shù)思想在牛蒡子湯基礎(chǔ)上加入中藥三七創(chuàng)制出的，臨床上治療痰瘀互結(jié)型RA收到了良好的療效。且牛蒡子湯用于骨傷科痹病有確切的療效[16-18]。本研究在前期探討加味牛蒡子湯能夠改善淋巴回流功能，減輕RA的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了給予加味牛蒡子湯治療具有促進(jìn)TNF-Tg小鼠淋巴管的新生和擴(kuò)張，便于運輸免疫細(xì)胞，清除過多的炎性細(xì)胞和炎癥因子，促進(jìn)炎癥消退和關(guān)節(jié)形態(tài)、功能修復(fù)的藥理效應(yīng)。

綜上，RA是一種嚴(yán)重破壞性的自身免疫病，有效治療方劑加味牛蒡子湯能夠促進(jìn)淋巴管新生和成熟，減少炎癥性M1型巨噬細(xì)胞，減少骨破壞和軟骨侵蝕，減輕關(guān)節(jié)炎癥免疫反應(yīng)。因此，加味牛蒡子湯促淋巴管生成和擴(kuò)張，補償調(diào)節(jié)淋巴功能障礙，抑制關(guān)節(jié)炎癥免疫反應(yīng)的藥理效應(yīng)或?qū)镽A的治療提供新的研究方向。