IL-17A中和抗體通過IL-17RA/Traf6/NF-κB信號通路緩解鼻竇炎伴鼻息肉組織重塑

王重陽，于 洋，金海南，宋藝蘭，劉思奇，張雅琳，延光海，金永德

(1.吉林省過敏性常見疾病免疫與靶向研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，延邊大學(xué)，吉林 延吉 133002;2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院耳鼻喉科，吉林 延吉 133002;3.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，吉林 延吉 133002)

慢性鼻竇炎(Chronic rhinosinusitis，CRS)是一種鼻竇部常見的慢性炎癥性疾病，其全球患病率逐年增高約為5%-16%[1]。CRS目前根據(jù)不同的組織重塑模式分為帶鼻息肉的CRSwNP(CRS with nasal polyps)和沒有鼻息肉的CRSsNP(CRS without nasal polyps)[2]。CRSwNP的典型特征是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度降解，存在白蛋白形成和水腫形成，而CRSsNP的定義為過度的胞外基質(zhì)沉積和纖維化形成。除此之外，CRswNP和CRSsNP還具有明顯的免疫病理學(xué)特征差異。有研究表明，來自歐洲的CRSwNP患者的病理學(xué)特征是Th2偏斜型嗜酸性炎癥模式。而Zhang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，來自中國南方的CRSwNP患者表現(xiàn)出Th1/Th17細(xì)胞型并伴輕度嗜酸性炎癥模式。Cao等[4]也同樣對中國嗜酸性CRswNPs的患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出Th2/Th17細(xì)胞型炎癥反應(yīng)。因此，進(jìn)一步了解IL-17在CRS中的作用將對探討該疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

IL-17A，通常被稱為IL-17，是IL-17家族成員中首個(gè)被發(fā)現(xiàn)且為目前最為廣泛研究的。它與許多自身免疫及炎性疾病相關(guān)，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、過敏性鼻炎、急性肝損傷、牙周炎等[5-6]。IL-17A被報(bào)道刺激人腹膜間皮細(xì)胞上調(diào)α-SMA的表達(dá)，參與胃癌腹膜播散過程中的腫瘤纖維化[7]。有研究表明IL-17A能夠通過激活NF-κB信號通路上調(diào)MMP-9的表達(dá)[8]。另有報(bào)道指出IL-17參與自身免疫性脫髓鞘病中Act1介導(dǎo)的炎癥基因表達(dá)，從而促進(jìn)Th17細(xì)胞介導(dǎo)的發(fā)病機(jī)制[9]。NF-κB激活蛋白1(Act1)是一種E3泛素連接酶，其下游有許多底物，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(Traf6)為其中之一。Feng等[10]研究發(fā)現(xiàn)抑制Traf6能夠調(diào)控NF-κB信號緩解廣州管圓線蟲引起的嗜酸性腦膜炎。以上表明Act1與Traf6結(jié)合后可能參與對NF-κB信號通路的調(diào)控。盡管已有研究表明IL-17A在CRS中高度表達(dá)[8]，但I(xiàn)L-17A在CRSwNP的重塑中發(fā)揮著怎樣作用及其機(jī)制尚不清楚。本研究的目的是探討IL-17A在CRSwNP中的臨床意義，并確定其在調(diào)節(jié)組織重塑中可能發(fā)揮的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的制備所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)我校動(dòng)物保健與使用委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號SYXK(吉)2020-0009。SPF級7周齡BALB/c♂小鼠32只，每組8只共4組：分別為對照組(Control)、C+anti-IL-17A組(IL-17A中和抗體0.05 mg·kg-1)、HDM組(模型組)、H+anti-IL-17A組(HDM+IL-17A中和抗體0.05 mg·kg-1)。HDM組和H+anti-IL-17A組小鼠于d 1、d 5皮下注射 1 g·L-1HDM 100 μL致敏，于d 12開始連續(xù)7 d以0.5 g·L-1HDM 40 μL滴鼻操作，此后每周3次連續(xù)3個(gè)月滴鼻操作，于第2個(gè)月每周附加3次金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)10 ng滴鼻操作，對照組均予以等量PBS代替。而C+anti-IL-17A組和H+anti-IL-17A組從第5 周開始每周3次額外予以IL-17A中和抗體0.05 mg·kg-1。d 104處死小鼠，提取出小鼠鼻息肉及下鼻甲黏膜組織備用。

1.2 人鼻粘膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)人鼻粘膜上皮細(xì)胞(HNEpCs)購自于豐暉生物(湖南)，置于盛有1640(Thermo)和10%FBS(Biowest)的培養(yǎng)皿、37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 ELISA根據(jù)ELISA試劑盒說明書的步驟，依次檢測小鼠鼻粘膜組織中IL-4、IL-17A的含量，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。

1.4 組織化學(xué)染色對烤好的片子進(jìn)行脫蠟、脫水，再予以抗體修復(fù)液中修復(fù)半小時(shí)，然后用IL-17A一抗和相對應(yīng)的二抗進(jìn)行孵育。DAB顯色、蘇木精復(fù)染并封片。并于顯微鏡下觀察，Cytantion5微孔成像儀進(jìn)行拍片。

1.5 HE染色取出的小鼠鼻腔黏膜組織固定好，包埋后進(jìn)行貼片、烤片、脫蠟、水洗、脫水后予以蘇木精和伊紅染色，再次脫水后封片，并于顯微鏡下觀察，Cytantion5微孔成像儀進(jìn)行拍片。

1.6 Western blot將組織蛋白裂解或細(xì)胞蛋白收集后測定其樣品蛋白濃度。配好的電泳膠上每個(gè)泳道加等量的蛋白開始電泳。將分離后的蛋白轉(zhuǎn)到pvdf膜上，封閉后加入稀釋的一抗 (MMP-9、VEGF、Act1、Traf6、p65、p-IκBα、IκBα、β-actin)4 ℃過夜。洗膜，相應(yīng)二抗再孵育2 h。再次洗膜后加入發(fā)光劑，利用AI 600凝膠成像儀采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 CRSwNP小鼠Th2/Th17表達(dá)變化為證明CRSwNP小鼠中Th2/Th17的平衡關(guān)系，我們通過ELISA法檢測不同分組小鼠對應(yīng)組織中IL-4和IL-17A的表達(dá)。結(jié)果表明，與對照組相比，單純予以IL-17中和抗體組的IL-4和IL-17A表達(dá)沒有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，單純予以HDM組的IL-4和IL-17A表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，予以HDM和IL-17中和抗體組的IL-4和IL-17A表達(dá)則顯著低于單純予以HDM組(P<0.01；Fig1A、B)。同時(shí)，我們在小鼠的鼻息肉及下鼻甲粘膜的組織化學(xué)染色中也同樣發(fā)現(xiàn)予以IL-17中和抗體后可以明顯降低HDM引起的IL-17A表達(dá)(Fig1C)。

Fig 1 Expression of Th2 and Th17 cytokines in mice A,B：The expressions of IL-4 and IL-17A in the supernatant of mouse nasal polyps and inferior turbinate mucosa were determined by ELISA;C.The expression of IL-17A in mice was observed by immunohistochemical staining；1：control;2:C+anti-17A;3:HDM;4:H+anti-IL-17A;##P<0.01 vs control;**P<0.01 vs HDM

2.2 CRSwNP小鼠中MMP-9及VEGF蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果表明，小鼠予以IL-17A中和抗體后與未處理小鼠的MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)沒有明顯差異(P>0.05)，而HDM處理后的小鼠MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，HDM小鼠再予以IL-17A中和抗體治療后MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。而且，我們在小鼠鼻息肉和下鼻甲粘膜HE染色中發(fā)現(xiàn)正常組和單純予以IL-17中和抗體組的組織中炎癥細(xì)胞較少，而HDM組較正常組炎癥細(xì)胞明顯增多，且粘膜顯著增厚。而IL-17中和抗體可以緩解HDM引起的炎癥，逆轉(zhuǎn)粘膜的增生。見Fig2。

Fig 2 Expression of MMP-9 and VEGF protein and histopathological changes in mice A,B：Western blot was used to detect the expression of MMP-9 and VEGF in nasal polyps and inferior turbinate mucosa of mice (n=8);C：HE staining was used to observe the expression of inflammatory cells in different groups of mice；1：control;2:C+anti-17A;3:HDM;4:H+anti-IL-17A;#P<0.05 vs control;*P<0.05 vs HDM

2.3 CRSwNP小鼠中Traf6及NF-κB信號通路蛋白的表達(dá)Western blot結(jié)果如Fig3可見，與對照組相比，予以IL-17A中和抗體的小鼠Act1、Traf6、p65蛋白表達(dá)及IκBα 磷酸化表達(dá)均無明顯變化(P>0.05)，HDM模型組小鼠Act1、Traf6、p65蛋白表達(dá)及IκBα 磷酸化表達(dá)均升高(P<0.05)。然而H+IL-17A中和抗體組較HDM組降低了以上蛋白的磷酸化和表達(dá)(P<0.05)。

Fig 3 Detection levels of Traf6 and NF-κB pathway proteins in different groups of mice A,B,C：Protein expression levels of Act1,Traf6,p65 and phosphorylation of IκBα in nasal polyps and inferior turbinate mucosa tissues of mice were determined by Western blot；1：control;2:C+anti-17A;3:HDM;4:H+anti-IL-17A;#P<0.05 vs control;*P<0.05 vs HDM

2.4 IL-17A刺激HNEpCs中Traf6以及NF-κB通路蛋白的表達(dá)為了證實(shí)IL-17A通過IL-17AR信號誘導(dǎo)Traf6及NF-κB信號通路蛋白的表達(dá)，HNEpCs在IL-17A刺激前用anti-IL-17RA預(yù)處理1 h。如預(yù)期一樣，與僅IL-17A治療刺激相比，anti-IL-17RA處理后Act1、Traf6、p65的蛋白表達(dá)顯著下降，IκBα的磷酸化水平也明顯降低(P<0.05)。見Fig4。

Fig 4 Expression of Traf6 and NF-κB Signaling Pathway Proteins in HNEpCs Treated with anti-IL-17RA A,B,C：Protein expression levels of Act1,Traf6,p65 and phosphorylation of IκBα in HNEpCs treated with IL-17A or a combination of IL-17A and anti-IL-17RA were determined by Western blot；#P<0.05 vs untreated group,*P<0.05 vs treated with IL-17A group

2.5 Traf6在HNEpCs中誘導(dǎo)NF-κB信號的活化Traf6信號可以被IL-17A激活，為證實(shí)其在NF-κB信號通路活化中的作用。在IL-17A處理 HNEpCs前，用Traf6的抑制劑Traf6 inhibitor預(yù)處理HNEpCs 1 h，最后Western blot結(jié)果表明，Traf6 inhibitor預(yù)處后p65蛋白表達(dá)以及IκBα的磷酸化均顯著減弱(P<0.05)。見Fig5。

Fig 5 Expression of NF-κB pathway proteins in HNEpCs treated with Traf6 inhibitor A,B,C:Protein expression levels of Act1,Traf6,p65 and phosphorylation of IκBα in HNEpCs treated with IL-17A or a combination of IL-17A and Traf6 inhibitor were determined by Western blot;#P<0.05 vs untreated group,*P<0.05 vs treated with IL-17A group

3 討論

慢性鼻竇炎(CRS)是一種復(fù)雜的上氣道疾病，與各種細(xì)胞、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子有關(guān)。CRS的發(fā)生率可高達(dá)人均10%左右，根據(jù)其性質(zhì)又可分為無鼻息肉的CRS (CRSsNP)和帶有鼻息肉的CRS(CRSwNP)[2]。這兩種表型的特點(diǎn)是疾病所造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)高和臨床癥狀的重疊，主要以面部疼痛和嗅覺喪失最為顯著。近年來，我國對CRS病理生理學(xué)的認(rèn)識(shí)方面取得了很大的進(jìn)展：從上皮和上皮間充質(zhì)過渡到先天和適應(yīng)性免疫途徑，然而，針對CRSwNP中息肉的發(fā)生機(jī)制仍存在多種假設(shè)。為此，本研究以尋找CRSwNP發(fā)病機(jī)制為重點(diǎn)，制備CRSwNP小鼠模型。IL-17A具有廣泛的功能，已知它參與各種炎癥反應(yīng)。有研究報(bào)告證實(shí)，IL-17A在急性肺曲霉病和過敏性哮喘中起著重要作用[11-12]。我們的結(jié)果表明，與正常組相比，IL-17A蛋白在CRSwNP小鼠的鼻組織中高度表達(dá)。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)，予以IL-17A中和抗體后，CRSwNP小鼠的Th2、Th17型炎癥因子表達(dá)及炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕?？傊?，我們的研究結(jié)果證實(shí)并擴(kuò)展了其他人的發(fā)現(xiàn)，即增加IL-17A的表達(dá)在CRSwNP致病中起著關(guān)鍵作用。雖然CRSwNP在炎癥模式中表現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性，但鼻息肉水腫的形成是CRSwNP的一個(gè)共同特征。因此，識(shí)別調(diào)節(jié)鼻息肉水腫形成的因素對該疾病的治療干預(yù)至關(guān)重要。有研究表明，蛋白酶及其抑制劑之間的不平衡可能在細(xì)胞外基質(zhì)的降解和水腫的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。MMPs是一個(gè)鋅和鈣依賴性內(nèi)肽酶家族，可以降解幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)成分[14]。VEGF是一種二聚體肝素結(jié)合糖蛋白，具有促水腫和血管生成特性[15]。而我們的研究發(fā)現(xiàn)，通過IL-17A中和抗體將CRSwNP模型中IL-17A降解后可以減少M(fèi)MP-9和VEGF的表達(dá)。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)CRSwNP中Act1和Traf6水平升高。為探究CRSwNP中Act1和Traf6的蛋白水平變化是否與IL-17A有關(guān)，我們用IL-17A刺激人鼻粘膜上皮細(xì)胞(HNEpCs)，在IL-17A刺激后，ACT1通過E3連接酶招募并促進(jìn)TRAF6泛素化，從而傳遞下游信號。有報(bào)道表明，Act1可能在IL-17A誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞脫髓鞘過程中起主導(dǎo)作用[16]。然而，在我們用IL-17A和anti-IL-17RA對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)anti-IL-17RA預(yù)處理可以消除Act1和Traf6水平的上調(diào)。這表明IL-17A通過與IL-17AR結(jié)合來誘導(dǎo)Traf6的產(chǎn)生，從而激活下游信號。我們的研究提示IL-17A/IL-17RA/Traf6參與了CRSwNP的炎癥反應(yīng)。

IL-17A可以激活多種下游信號通路，包括NF-κB、MAPK等在不同疾病中表達(dá)[17]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NF-κB在CRSwNP小鼠中被激活。NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族作為五個(gè)不同亞單位的二聚體，即p65或RelA，p50(NF-κB1)、RelB、p52(NF-κB2)和cRel。在沒有刺激的情況下，NF-κB在細(xì)胞質(zhì)中與IκBα、IκBβ、IκBε的相互作用不活躍。而炎癥等刺激NF-κB活化后，IκB降解，使核轉(zhuǎn)位和NF-κB與κB共有DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄[18]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CRSwNP小鼠和IL-17A刺激的HNEpCs中NF-κB信號通路表達(dá)上調(diào)，提示它被IL-17信號激活。有研究表明，NF-κB是Traf6的一個(gè)下游基因。因此，我們懷疑Traf6可能參與了IL-17A調(diào)節(jié)NF-κB的機(jī)制。在本研究中，我們證實(shí)了IL-17A可以激活Traf6途徑。此外，用Traf6 inhibitor(Traf6抑制劑)對HNEpCs進(jìn)行預(yù)處理。研究證實(shí)，IL-17A誘導(dǎo)的NF-κB表達(dá)上調(diào)可以通過Traf6抑制來消除，這表明IL-17A可以通過激活Traf6途徑誘導(dǎo)鼻上皮細(xì)胞中NF-κB的產(chǎn)生。

總之，本研究的結(jié)果表明，CRSwNP中的局部炎癥環(huán)境可能會(huì)誘導(dǎo)IL-17A的表達(dá)。IL-17A通過鼻上皮細(xì)胞中的Traf6通路上調(diào)NF-κB的表達(dá)，這表明IL-17A可能在CRSwNP的組織重塑中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。阻滯IL-17RA/Traf6/NF-κB 信號通路可以緩解鼻竇炎伴鼻息肉組織重塑。