舒郁膠囊對孕前社會挫敗應激大鼠子代學習記憶能力及CREB-BDNF信號通路的影響

劉 坤，邢 影，史經(jīng)昊，李自發(fā)，耿希文，魏 盛

(山東中醫(yī)藥大學 1.中醫(yī)學院 2.實驗中心，山東 濟南 250355)

抑郁癥是一種常見的情緒類疾病，除抑郁、情緒低落等癥狀外還伴有認知功能障礙。該病存在遺傳傾向，其后代患抑郁癥的概率高達40%[1]。已有研究證明母代產(chǎn)前應激會對子代的神經(jīng)發(fā)育及認知功能產(chǎn)生影響[2]。中醫(yī)理論認為，肝疏泄不及[3]是抑郁癥發(fā)病的關鍵病機之一。舒郁膠囊作為柴胡、白芍、香附、甘草有效成分提取物組成的中成藥廣泛應用于抑郁癥等情緒類疾病的治療[4]，有研究證實[5]其組分芍藥苷可緩解孕前應激引起的子代抑郁癥狀，但其改善學習認知能力的藥效研究未見報道。本研究通過社會挫敗應激[6](social defeat stress，SDS)制備母鼠抑郁樣行為(肝疏泄不及狀態(tài))并進行舒郁膠囊干預，通過行為學測試對子代學習記憶能力進行評價，并探討舒郁膠囊通過調節(jié)CREB-BDNF信號通路改善此癥狀的神經(jīng)生化機制。

1 材料

1.1 實驗動物Wistar子代雄性大鼠48只，體質量(180-200)g，用于交配的雌鼠及雄鼠、造模入侵鼠均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SYXK(魯)20170022。

1.2 藥品、主要試劑及儀器舒郁膠囊(山東中醫(yī)藥大學天然藥物研究所自制)；鹽酸氟西汀分散片(禮來蘇州制藥有限公司，批號9515A)?？?BDNF抗體(1 ∶200，Sigma，AV41970)，抗-CREB抗體、抗-pCREB抗體、(1 ∶500，Abcam，ab31387、ab32096)抗GAPDH抗體(1 ∶2500，Abcam，ab9485)過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗(1 ∶2 000，Santa Cruz，sc-2004)。XR-SuperMaze動物行為分析系統(tǒng)、XR-XZ301曠場實驗系統(tǒng)、物體識別實驗系統(tǒng)、Morris水迷宮實驗系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)；電子天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；優(yōu)普去離子水機(成都超純科技有限公司)；5024R冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；G:BOX ChemiXR5凝膠成像分析系統(tǒng)(美國SYNGEN公司)。

2 方法

2.1 母代大鼠模型制備及行為學評價根據(jù)大鼠曠場實驗及體質量將大鼠隨機分為4組，每組10只。分別為正常組(純水10 mL·kg-1·d-1)、模型組(純水10 ml·kg-1·d-1)、舒郁膠囊組(408 mg·kg-1·d-1)、氟西汀組(2.67 mg·kg-1·d-1)。造模持續(xù)4周，第1周大鼠單籠飼養(yǎng)進行社會隔離，第2周開始進行社會挫敗入侵實驗[7](將入侵鼠轉移至居住鼠籠中15 min，記錄在此期間入侵鼠與居住鼠的行為。若入侵鼠對居住鼠有攀壓行為且持續(xù)時間超過2 s，則被定義為“挫敗”)，共進行3周。造模期間同時給藥。造模后通過挫敗率及曠場實驗、糖水偏好實驗對母代大鼠進行行為學評價，篩選合格大鼠與雄性大鼠交配。

2.2 子代雄性大鼠學習記憶相關行為指標檢測雄性子代滿2月齡后對其進行行為學測試，通過物體識別實驗及Morris水迷宮實驗評價各組大鼠學習記憶能力。

2.2.1物體識別實驗(Object Recognition Task，ORT) 子代大鼠于曠場區(qū)域(箱體尺寸：長×寬×高=40 cm×40 cm×40 cm)連續(xù)測試4 d。d 1和d 2的上午10 ∶00進行5 min的自由探索以適應環(huán)境。d 3將大鼠放入曠場中心，在靠近曠場一側區(qū)域墻壁放入兩個相同的物體進行5 min訓練，訓練結束后將大鼠放回原籠，1 h后再次將大鼠放入曠場區(qū)域。此時曠場內放入一個與之前相同的物體(未使用過)以及一個陌生物體，記錄大鼠5 min中內探索每個物體的時間。d 4動物再次放入曠場箱中，放入一個熟悉物體及一個陌生物體,記錄大鼠在5 min內探索每個物體的時間。每次實驗結束，用75%酒精溶液擦拭箱體。最后根據(jù)識別指數(shù)(recognition index,RI)即探索陌生物體的時間與探索物體的總時間之比，作為物體識別的主要指標。若RI=50%表示零偏愛，>50%則認為大鼠更傾向于探究陌生物體，<50%表示傾向于探索熟悉物體。

2.2.2Morris水迷宮實驗(Morris Water Maze，MWM) 水迷宮實驗在Morris水迷宮(直徑：160 cm，高度：60 cm)中進行,水迷宮被均分為四個象限，內有一個平臺(直徑：12 cm，高度：35 cm)，隨機放于一個象限。測試時水深37 cm，水溫(25±2)℃。實驗分為定位航行訓練及空間探索測試兩部分。

定位航行訓練：訓練期為4 d,每天將大鼠從不同的象限面向池壁放入水中，大鼠自由游泳2 min，記錄逃避潛伏期(自開始計時至找到平臺的時間)及平臺象限停留時間。若大鼠在2 min內未找到平臺，將大鼠放到平臺上停留15 s,其潛伏期記為2 min。

空間探索測試：d 5將平臺撤去，從任意一個象限將大鼠放入水迷宮，同時保證所有大鼠在同一入水點記錄并分析大鼠2 min內逃避潛伏期、原平臺象限的停留時間。

2.3 Western blot檢測子代雄性大鼠海馬腦區(qū)蛋白行為學結束后取海馬腦區(qū)，Western blot檢測海馬內BDNF、pCREB、CREB含量。取海馬組織內總蛋白，蛋白定量后上樣、電泳分離、轉膜、洗膜，先后加入一抗及二抗孵育、洗滌。用ECL化學發(fā)光試劑盒顯像后，使用G:BOX chemiXR5成像。

2.4 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行分析，多組比較用單因素方差分析，連續(xù)測量的數(shù)據(jù)采用重復測量設計的雙因素方差分析。

3 結果

3.1 各組大鼠物體識別實驗結果與正常組母鼠子代相比，模型組物體識別實驗1 h及24 h識別指數(shù)明顯下降(P<0.01,P<0.01);與模型組相比，氟西汀干預組1 h及24 h識別指數(shù)上升(P=0.01,P<0.01),舒郁膠囊干預組1 h及24 h識別指數(shù)上升(P<0.05,P<0.01)，見Fig1。

Fig 1 Comparison of object recognition task behaviors of maternal offsprings in different treatment groupsA:The movement track of rats in ORT (1 h retention interval);B:The movement track of rats in ORT (24 h retention interval);C:Comparison of recognition index of 1 h and 24 h retention interval of maternal offsprings in different treatment groups.1:Control progency;2:Stress progency;3:Stress+fluoxetine progency;4:Stress+shuyu progency;**P<0.01 vs Control group;#P<0.05，##P<0.01 vs Stress group.

3.2 各組大鼠Morris水迷宮實驗結果與正常組母鼠子代相比，模型組Morris 水迷宮探索期目標象限停留時間明顯下降，逃避潛伏期明顯上升(P<0.01,P<0.01)；與模型組相比，氟西汀干預組探索期目標象限停留時間上升，逃避潛伏期明顯下降(P<0.05,P<0.01)，舒郁膠囊干預組探索期目標象限停留時間上升，逃避潛伏期明顯下降(P<0.05,P<0.01),見Fig2。

Fig 2 Comparison of Morris water maze behavior experiment of maternal offsprings in different treatment groups during training period and exploration periodA：Comparison of target quadrant residence time in offsprings of different treatment groups in training period;B：Comparison of escape latencies in offsprings of different treatment groups in training period;C：Comparison of target quadrant residence time and escape latency of offsprings in different treatment groups in exploration period;D：The movement track of rats in MWM.1:control progency;2:Stress progency;3:Stress+fluoxetine progency;4:Stress+shuyu progency；**P<0.01 vs control group;#P<0.05，##P<0.01 vs Stress group

3.3 各組大鼠海馬腦區(qū)微觀指標檢測結果與正常組母鼠子代相比，模型組BDNF相對光密度值明顯降低 (P<0.01)；與模型組相比，氟西汀及舒郁膠囊干預組BDNF相對光密度值升高 (P<0.01,P<0.01)。各組CREB相對光密度值未表現(xiàn)出明顯差異。與正常組母鼠子代相比，模型組pCREB相對光密度值明顯降低 (P<0.01)；與模型組相比，氟西汀干預組pCREB相對光密度值升高 (P<0.01)。與正常組母鼠子代相比，模型組pCREB/CREB比值降低 (P<0.01)；與模型組相比，氟西汀及舒郁膠囊干預組pCREB/CREB比值升高(P<0.01，P<0.01),見Fig3。

Fig 3 Comparison of relative optical density values of BDNF,CREB and pCREB in hippocampus of maternal offsprings in different treatment groupsA：Comparison of the relative optical density values of BDNF,CREB,pCREB and pCREB/CREB in maternal offspring hippocampus of different treatment groups；B：Electrophoretic bands of BDNF,CREB,pCREB and GAPDH in maternal offspring hippocampus of different treatment groups；1:control progency;2:Stress progency;3:Stress+fluoxetine +progency;4:stress+shuyu progency;**P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs Stress group

4 討論

本研究采用更為接近社會環(huán)境應激的社會挫敗應激范式制備母鼠孕前抑郁樣行為(肝疏泄不及狀態(tài))，并進行舒郁膠囊干預后，各組成年雄性子代的ORT、MWM等行為學指標及海馬腦區(qū)BDNF、pCREB等微觀指標的表達結果顯示，母鼠孕前應激會降低成年雄性子代學習記憶能力，此負性影響可經(jīng)中藥舒郁膠囊干預而得到改善，其作用的微觀機制可能與舒郁膠囊上調海馬內pCREB、BDNF的表達，調節(jié)CREB-BDNF通路有關。

母鼠孕前應激會使子代產(chǎn)生抑郁行為[8]并可以導致子代認知缺陷[9]，已有研究證實母鼠孕前應激對子代的負性影響可能與下調海馬區(qū)pCREB水平，并降低BDNFmRNA的轉錄及表達水平[10]有關。海馬是參與學習與記憶的重要腦區(qū)[11]，BDNF除了發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用外，在調節(jié)海馬長時程增強中也起到重要作用,是抑郁癥相關神經(jīng)生理學研究熱點[12]。BDNF是CREB的經(jīng)典下游靶基因，CREB是認知功能調節(jié)的關鍵介質[13]，其磷酸化形式pCREB可以改善大鼠認知功能[14]；而pCREB可以促進BDNF的表達[15]。有研究報道抗抑郁藥物可以激活細胞膜的腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase，AC)，催化ATP產(chǎn)生cAMP,cAMP可激活蛋白激酶A使CREB磷酸化[16],進而通過CREB-BDNF通路發(fā)揮作用。故 CREB-BDNF通路在調節(jié)學習認知功能中發(fā)揮重要作用。

舒郁膠囊主要由柴胡皂苷、芍藥苷、香附揮發(fā)油等組成，是臨床治療抑郁癥的有效藥物，而我們的研究發(fā)現(xiàn)，舒郁膠囊具有改善母代孕前社會挫敗應激導致的成年雄性子代學習記憶減退的效果。以往對舒郁膠囊藥效機制的研究多基于其改善抑郁樣表型的作用開展，而對其干預學習記憶的藥效鮮見報道。我們的研究發(fā)現(xiàn)舒郁膠囊可以通過上調孕前社會應激制備的肝疏泄不及大鼠模型子代海馬BDNF表達，提高pCREB/CREB比值，行為學結果顯示母代孕前社會挫敗應激導致的子代學習記憶能力減退的癥狀得到改善。因此，舒郁膠囊對于子代大鼠學習記憶能力的調節(jié)作用可能是通過CREB-BDNF通路實現(xiàn)的。

本研究結果為調肝方藥舒郁膠囊改善學習記憶作用的中樞機制提供了方向和支持，并為擴展該藥物的臨床應用范圍奠定了數(shù)據(jù)基礎。然而，中藥可從多環(huán)節(jié)、多靶點發(fā)揮作用，僅從單一方面闡發(fā)舒郁膠囊改善學習記憶能力是不夠的。舒郁膠囊在提高大鼠學習記憶能力中發(fā)揮作用的具體部位及作用的特定神經(jīng)環(huán)路還需要進一步的探索和論證。