白木香人工結(jié)香初期營養(yǎng)元素及葉片葉綠素含量的變化

王龍仁，曾 軍，劉雙龍，王雅麗，孫會舉，王 熙，楊福孫，戴好富

（1. 海南大學(xué) 熱帶作物學(xué)院，海口 570228; 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所/海南省沉香工程技術(shù)研究中心，?？?571101; 3. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院，海口 571101）

白木香（Aquilaria sinensis）為瑞香科（Thymelaeceae）沉香屬（AquilariaLam）植物，是我國特有的產(chǎn)沉香植物和藥用沉香的法定基原植物[1?4]，主要分布于我國的廣東、海南、廣西 和云南等地[3]。近年來，隨著野生白木香生境的片段化和人為掠奪式開采導(dǎo)致白木香野生資源處于瀕危狀態(tài)[5]。盡管現(xiàn)在白木香的人工栽培規(guī)模逐年增加，但白木香漫長的結(jié)香周期和復(fù)雜的結(jié)香過程，導(dǎo)致沉香質(zhì)量和產(chǎn)量仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足沉香市場的需求[6]。白木香人工栽培植株的生長和結(jié)香的周期長達(dá)5～8 a，甚至更長，科學(xué)的栽培技術(shù)對于促進(jìn)白木香人工林的生長、結(jié)香具有重要意義。營養(yǎng)元素代謝作為白木香植株生長、發(fā)育、沉香形成的物質(zhì)基礎(chǔ)是高效栽培技術(shù)集成不可缺少的理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。近年來，國內(nèi)外對于白木香營養(yǎng)元素代謝的研究多集中于白木香生長特定時期（如幼苗期等）的營養(yǎng)管理對其生理生長的影響等方面[7?13]，對在成齡樹結(jié)香過程中受到強烈人為或者自然因素干預(yù)、脅迫階段的營養(yǎng)代謝方面的研究較少，為此成齡樹結(jié)香階段白木香植株營養(yǎng)代謝規(guī)律理論有待豐富。白木香結(jié)香過程是植株在自然或者人為因素影響下進(jìn)行防御性次生產(chǎn)物代謝、積累、轉(zhuǎn)化的過程[14]，該過程中是否伴隨著營養(yǎng)元素代謝規(guī)律的改變，以及結(jié)香與營養(yǎng)是否存在協(xié)同過程有待研究。研究結(jié)果表明，沉香的形成過程伴隨著淀粉的轉(zhuǎn)化[15]，但該過程中營養(yǎng)元素的代謝是否與光合產(chǎn)物的積累、代謝、轉(zhuǎn)化存在關(guān)聯(lián)亦需要進(jìn)一步明確。筆者擬通過分析在白木香結(jié)香初期階段伴隨著沉香的形成白木香植株的營養(yǎng)元素、葉片葉綠素含量等指標(biāo)的變化，開展白木香結(jié)香初期營養(yǎng)元素與結(jié)香協(xié)同變化規(guī)律的研究。成齡樹結(jié)香階段營養(yǎng)元素代謝規(guī)律的研究對于豐富白木香結(jié)香理論內(nèi)容，指導(dǎo)通過營養(yǎng)代謝途徑調(diào)控沉香的生產(chǎn)具有現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料試驗材料為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院文昌試驗基地4年生的熱科2號白木香植株。試驗地位于海南省文昌市邁號鎮(zhèn)（E 110°45′36.19″，N19°32′17.11″），土壤類型為沖積土，質(zhì)地為沙壤土，土壤養(yǎng)分狀況整體偏中下（表1）。

表1 試驗地土壤養(yǎng)分狀況Tab. 1 Soil nutrient regime at the experiment site

1.2 試驗處理與取樣選取長勢具有代表性的植株20株，采用人工打洞法在植株樹干部位間隔5 cm左右的距離打洞（直徑為0.5 cm）并貫穿樹干。打洞處理2個月后,在開始出現(xiàn)結(jié)香跡象的植株上分別在葉片、結(jié)香部位樹皮及木質(zhì)部上進(jìn)行取樣，3次重復(fù)；以同地同時期種植且未進(jìn)行打洞結(jié)香處理的熱科2號植株為對照，對照的取樣方法與處理植株相同。采用“S”型混合取樣法，采集試驗地塊土層深度0～30 cm土壤樣品進(jìn)行營養(yǎng)狀況分析。

1.3 樣品分析方法土壤指標(biāo)測定方法：土壤全氮采用半微量開式法測定；土壤堿解氮采用堿解擴散法測定；土壤全磷采用高氯酸氧化，鉬銻抗比色法測定；土壤有效磷采用氟化銨浸提，鉬銻抗比色法測定；土壤全鉀采用NaoH熔融，火焰光度計法測定；土壤速效鉀采用NH4OAc浸提，火焰光度計法測定；土壤中微量元素采用原子吸收分光光度法（AAS法）測定[16]。每指標(biāo)均重復(fù)3次，取其平均值。

葉片葉綠素含量測定方法：采用乙醇浸提法[17]測定葉片葉綠素含量。具體方法：稱取0.5 g新鮮葉片剪碎于20 mL 95%乙醇中，在室溫下浸提至葉片綠色褪去，將提取液過濾到50 mL容量瓶定容，以95%乙醇作為空白對照，分別在663、645 nm波長下測定吸光度，并分別計算葉片葉綠素a、葉綠素b含量，兩者之和為葉片葉綠素含量。重復(fù)3次，取其平均值為測定值。

植物樣品測定方法：植物的全氮測定采用H2SO4-H2O2消煮，奈氏比色法測定；植物的全磷測定采用H2SO4-H2O2消煮，鉬銻抗比色法測定；植物的全鉀測定采用馬弗爐灰化，火焰光度計法；植物的中、微量元素測定采用馬弗爐灰化，原子吸收分光光度法測定[16]。每指標(biāo)均重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析與作圖采用Microsoft Excel完成試驗數(shù)據(jù)的整理、計算和作圖。采用SAS9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，相同指標(biāo)進(jìn)行T測驗比較，以不同大寫字母表示極顯著差異（P<0.01），不同小寫字母表示顯著差異（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 白木香結(jié)香初期葉片葉綠素含量變化白木香人工打洞結(jié)香初期的葉片葉綠素含量分析結(jié)果（圖1）表明，結(jié)香后白木香葉片葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量均呈上升趨勢，但與未結(jié)香對照植株相比，均未達(dá)到差異顯著水平。葉片葉綠素含量的提高可能是白木香植株對人工打洞結(jié)香形式的人為損傷脅迫產(chǎn)生的響應(yīng)，葉片葉綠素含量的提高可為增加光合產(chǎn)物的輸出促進(jìn)樹體傷害的修復(fù)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖1 結(jié)香初期白木香葉片葉綠素含量的變化Fig. 1 The change of leaf chlorophyll content of A. sinensis at the early agarwood inducing stage

2.2 結(jié)香初期白木香植株的大、中量元素含量的變化結(jié)香初期，白木香的葉片、結(jié)香部位樹皮和木質(zhì)部的大、中量元素的分析結(jié)果（圖2）表明，結(jié)香植株葉片的氮、磷、鉀營養(yǎng)元素含量呈下降趨勢；鈣、鎂呈現(xiàn)上升趨勢，但均未達(dá)到差異顯著水平。樹皮的氮、磷、鈣含量呈上升趨勢，鉀、鎂元素呈下降趨勢，但差異均未達(dá)到差異顯著水平。結(jié)香后木質(zhì)部部位營養(yǎng)元素氮、磷、鉀、鈣、鎂含量呈上升趨勢，其中鈣、鎂元素含量變化達(dá)到差異顯著水平。說明結(jié)香初期，白木香的葉片、結(jié)香部位樹皮和木質(zhì)部的大、中量元素亦均未達(dá)到差異顯著水平。

圖2 結(jié)香初期白木香不同部位大、中量元素含量變化Fig. 2 The changes of nutrient contents of A. sinensis at the early agarwood inducing stage

2.3 結(jié)香初期白木香不同部位微量元素含量變化從圖3可見，結(jié)香初期，白木香植株葉片微量元素含量變化差別較大，銅、錳元素含量上升，且錳元素呈極顯著上升水平；葉片中鐵、鋅元素呈下降趨勢，其中鋅元素含量極顯著下降。結(jié)香后，結(jié)香部位樹皮中鐵、鋅、錳元素上升達(dá)到差異顯著水平；同時結(jié)香部位樹皮中銅元素含量顯著下降。結(jié)香部位木質(zhì)部微量元素呈上升趨勢，其中銅、錳元素含量差異達(dá)到顯著水平，而鐵、鋅元素含量上升但未達(dá)到差異顯著水平。

圖3 結(jié)香初期白木香不同部位微量元素含量變化Fig. 3 The changes of trace element contents of A. sinensis at the early agrwood inducing stage

2.4 土壤養(yǎng)分與結(jié)香初期養(yǎng)分增減量的相關(guān)分析對結(jié)香初期白木香植株葉片、結(jié)香部位樹皮和木質(zhì)部養(yǎng)分相對增減量與取樣土壤養(yǎng)分相對增減量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（圖4）表明，土壤養(yǎng)分相對增減量與植株的葉片、木質(zhì)部的養(yǎng)分相對增減量成負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.363 1、0.417 6；土壤養(yǎng)分相對增減量與植株樹皮成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.379 4。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示各相關(guān)性均未達(dá)到差異顯著水平。由此可見，結(jié)香后白木香植株營養(yǎng)元素的變化并非是由土壤營養(yǎng)狀況的改變而引起的。

圖4 土壤養(yǎng)分與結(jié)香期養(yǎng)分增減量的相關(guān)分析Fig. 4 Correlation analysis of changes in soil nutrient contents and A. sinensis nutrient contents at the agarwood inducing stage

2.5 結(jié)香初期白木香的葉片和樹干營養(yǎng)元素遷移規(guī)律的分析通過分析植物不同部位營養(yǎng)元素比值的變化可判斷營養(yǎng)元素的遷移規(guī)律[18]。結(jié)香初期白木香的葉片、木質(zhì)部營養(yǎng)元素遷移規(guī)律的分析結(jié)果（圖5）表明，與未結(jié)香植株相比，結(jié)香后植株的葉片、木質(zhì)部的氮、磷、鉀、鎂、銅、鐵、鋅營養(yǎng)元素比值均呈顯著下降趨勢。同時，植株葉片、木質(zhì)部鈣元素比值成下降趨勢，而錳元素比值呈現(xiàn)上升趨勢，但均未達(dá)到顯著水平。結(jié)果表明，結(jié)香過程中伴隨著樹體傷害的修復(fù)和沉香的形成，白木香植株體內(nèi)的礦質(zhì)元素具有由葉片向結(jié)香的樹干木質(zhì)部位遷移的趨勢，亦在一定程度上表明白木香結(jié)香與礦質(zhì)營養(yǎng)關(guān)系密切。

圖5 白木香結(jié)香期樹葉和樹干營養(yǎng)元素含量比值變化Fig. 5 The change of ratio of the leaves to the stem of A.sinensis in nutrient contents at the agarwood inducing stage

3 討 論

3.1 白木香結(jié)香初期葉片光合色素的變化人為非生物脅迫可造成植株光合系統(tǒng)的改變。對柑桔的環(huán)割和環(huán)剝的研究結(jié)果表明,環(huán)割和環(huán)剝處理導(dǎo)致葉綠素相對含量（SPAD）均下降[19]。研究人員推測可能是由于環(huán)剝破壞了韌皮部，影響了同化物向下運輸[20]，導(dǎo)致葉片積累大量光合產(chǎn)物[21]，隨著大量光合產(chǎn)物在葉片累積，從而抑制了光合作用。吳文華等[22]對土沉香進(jìn)行不同損傷處理后發(fā)現(xiàn)，在植株主干砍樹干粗的1/3～1/2楔形缺口同時配合部分截枝斷根處理后，處理植株葉片光合速率呈增加趨勢，但只有配合截斷所有樹枝處理的光合特性和熒光參數(shù)增加達(dá)到差異顯著水平?？梢?，嚴(yán)重?fù)p傷處理給沉香植株造成較大的脅迫，導(dǎo)致葉片的光合能力顯著增強[22]。本試驗人工打洞結(jié)香處理是將樹干打穿，嚴(yán)重破壞木質(zhì)部，模擬白木香植株受到嚴(yán)重?fù)p傷而結(jié)香，結(jié)香后葉綠素含量雖然上升，但并未達(dá)到顯著水平，這可能是人工打洞處理造成的傷害沒有前人試驗處理嚴(yán)重所致。

3.2 白木香結(jié)香后對結(jié)香部位養(yǎng)分的影響結(jié)香過程是白木香對人為傷害脅迫進(jìn)行應(yīng)答、修復(fù)的過程。植物對非生物脅迫的應(yīng)答可分為感知并產(chǎn)生信號、信號傳導(dǎo)、產(chǎn)生信號應(yīng)答3個階段，最終誘導(dǎo)逆境相關(guān)基因表達(dá)[23]。在植物感知脅迫后，可通過鈣離子(Ca2+)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實現(xiàn)信號的傳導(dǎo)[24]。脅迫狀態(tài)下，植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的游離鈣離子濃度會增加，并通過鈣離子與鈣調(diào)蛋白啟動一系列生理活動，應(yīng)對植物對逆境的感知、傳遞、響應(yīng)甚至適應(yīng)。本研究中，在結(jié)香處理后，受傷部位全鈣含量顯著增加，是否與鈣離子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)有待進(jìn)一步研究?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，白木香結(jié)香過程中沉香的積累主要發(fā)生于木間韌皮部和木射線中，且伴隨著木間韌皮部、木射線內(nèi)儲藏物質(zhì)淀粉的轉(zhuǎn)化[25?27]，同時，白木香木間韌皮部篩管篩孔上附著多糖類的胼胝質(zhì)，在創(chuàng)傷與逆境脅迫中具有重要的調(diào)控作用[27]，可見沉香形成過程中與光合產(chǎn)物等能量物質(zhì)的儲藏、轉(zhuǎn)化有密切的關(guān)系。周曉超等[28]的研究結(jié)果表明，鉀、鈣元素含量與可溶性糖含量呈正相關(guān)。本研究結(jié)果表明，白木香結(jié)香部位鉀、鈣元素含量呈現(xiàn)上升趨勢，其中鈣元素顯著增加。

沉香特征性成分以倍半萜類和2?（2?苯乙基）色酮類為主[29]，然而關(guān)于沉香中這兩大類成分積累與結(jié)香期植株營養(yǎng)間的相關(guān)性尚不明確。針對鎂、錳在調(diào)控小白菊內(nèi)酯（Parthenolide）代謝的研究結(jié)果[30]表明，鎂、錳可通過影響萜烯合酶的活性影響小白菊內(nèi)酯的生物合成；鎂、錳元素的合理供應(yīng)對提高次生代謝產(chǎn)物的含量至關(guān)重要。本研究結(jié)果表明，白木香結(jié)香過程中，結(jié)香部位營養(yǎng)元素呈上升趨勢，其中鈣、鎂、銅、錳的增加達(dá)到差異顯著水平，其中大量元素氮、磷、鉀營養(yǎng)元素呈上升趨勢但未達(dá)到差異顯著水平；葉片中氮、磷、鉀呈下降趨勢但差異亦未達(dá)到差異顯著水平。這意味著白木香植株在結(jié)香過程中伴隨著次生產(chǎn)物的代謝、積累過程，可能發(fā)生營養(yǎng)元素代謝的變化和對營養(yǎng)元素需求的增加，需要合理的營養(yǎng)供應(yīng)，其中微量元素的作用可能更加顯著。

3.3 白木香結(jié)香后養(yǎng)分的轉(zhuǎn)移白木香生長環(huán)境與結(jié)香關(guān)系的分析結(jié)果[31]表明，環(huán)境因子與結(jié)香關(guān)系密切，其中土壤因子與沉香特征性成分呈不同程度的負(fù)相關(guān)，交換性鈣和交換性鎂與結(jié)香質(zhì)量有著較高的負(fù)相關(guān)性。筆者通過分析白木香結(jié)香后植株不同部位與種植地塊養(yǎng)分相對增減量的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)植株不同部位養(yǎng)分的相對增減量與土壤養(yǎng)分的相對增減量相關(guān)性均未達(dá)到顯著相關(guān)，表明白木香結(jié)香期營養(yǎng)元素的變化主要取決于植株代謝過程的改變，而非由種植地營養(yǎng)狀況的改變而引起，這說明樹體受到傷害脅迫后，結(jié)香部位作為樹體修復(fù)、次生產(chǎn)物代謝最活躍的部位，光合產(chǎn)物及其相關(guān)營養(yǎng)元素優(yōu)先向生理活動最為活躍部位分配。這與文獻(xiàn)[32]的研究結(jié)果一致。與未結(jié)香植株相比，白木香結(jié)香后葉片與木質(zhì)部營養(yǎng)元素的比值（葉片含量/木質(zhì)部含量）顯著下降，表明結(jié)香階段營養(yǎng)元素向結(jié)香部位遷移趨勢明顯且營養(yǎng)元素遷移的趨勢與種植地塊營養(yǎng)狀況的相關(guān)性不明顯。