大葉桃花心木花粉精油的殺蟲及抑菌活性

張筑宏，吳文杰，吳岳捷，王蘭英，駱焱平

（海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228）

大葉桃花心木（Swietenia macrophylla）是楝科（Meliaceae）桃花心木亞科桃花心木屬（Swietenia）多年生落葉喬木，原產(chǎn)于中美洲和南美洲，廣泛分布于印度西部、馬來西亞和中國南部[1]。由于大葉桃花心木具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗誘變、抗癌、抗腫瘤和抗糖尿病的藥用活性，其果實(shí)和種子在很多亞洲國家被用于民間治療各種疾病[2]。大葉桃花心木在農(nóng)用活性方面的研究，如花、葉提取物對(duì)菜青蟲（Pieris rapae）、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）、桃花心木斑螟（Hypsipyla grandella）等農(nóng)林害蟲具有較好的拒食和毒殺活性；其種子提取物對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）和蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）具有一定的抑制活性[3?7]，但關(guān)于其精油的農(nóng)用研究鮮見報(bào)道。植物精油直接來源于植物生物系統(tǒng)，可作為宿主植物防御微生物入侵機(jī)制的一部分，為此，植物精油被視為天然的抗菌劑[8]。植物精油可用于食品儲(chǔ)存以防止病原菌入侵引起食品腐爛變質(zhì)；植物精油還可用于防治田間有害生物，實(shí)現(xiàn)綠色農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。由于精油具有可生物降解性、高揮發(fā)性和低殘留等特點(diǎn)，對(duì)生態(tài)環(huán)境不會(huì)造成負(fù)面影響，被視為綠色農(nóng)藥開發(fā)的重要來源之一。本研究以大葉桃花心木的花粉為原材料，通過超臨界CO2萃取花粉精油，測(cè)試花粉精油的殺蟲活性和抑菌活性，旨在為大葉桃花心木花粉精油農(nóng)用價(jià)值開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源萵苣指管蚜（Uroleucon formosanum）和棉蚜（Aphis gossypii）取自海南大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地蔬菜葉片。斜紋夜蛾（Spodoptera litura）和玉米象（Sitophilus zeamais）由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 供試菌種水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、芒果蒂腐病菌（Phomosis mangiferae）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.cubense）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、西瓜枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.niveum）、芒果炭疽病菌（C. gloeosporioidesPenz.）、匍枝根霉病菌（Rhizopus nigricans）和黑曲霉病菌（Aspergillus niger）均由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 大葉桃花心木花粉精油制備大葉桃花心木花粉采自海南大學(xué)儋州校園內(nèi)。將采集的花粉風(fēng)干后，用粉碎機(jī)充分粉碎，制成植物干粉，采用SFT-100XW型超臨界萃取儀，在CO2流量為14.4 mL·min?1，溫度為30 ℃，壓力為3 750 Pa的條件下靜態(tài)萃取60 min[9]。萃取率為0.94%，精油4 ℃保存，備用。

1.4 大葉桃花心木花粉精油的毒力測(cè)定

1.4.1 供試藥劑配制稱取0.2 g適量大葉桃花心木花粉精油，溶于V丙酮∶V水=1∶4混合液中，配成2 g·L?1處理藥液。以2 g·L?11%印楝素乳油為藥劑對(duì)照，以V丙酮∶V水=1∶4混合液為溶液對(duì)照。

1.4.2 對(duì)蚜蟲觸殺的毒力測(cè)定將萵苣指管蚜和棉蚜連同采樣葉片放入各處理藥液中浸漬10 s后取出，用吸水紙吸去多余藥液，放入培養(yǎng)皿中（20頭·皿），25 ℃培養(yǎng)。分別培養(yǎng)12、24 h用毛筆尖輕觸蚜蟲腹部，蚜蟲不動(dòng)則視為死亡。每個(gè)處理重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)各處理組試蟲死亡數(shù)量，計(jì)算校正死亡率。

1.4.3 3對(duì)斜紋夜蛾拒食作用的測(cè)定參照俞瑞鮮等[10]的方法，在非選擇性條件和選擇性條件下測(cè)定拒食活性。將新鮮蓖麻葉片用圓形打孔器打成直徑為2 cm的葉碟，放入各處理藥液中浸泡5 s，取出晾干，備用。選擇性拒食作用測(cè)定：將2張?zhí)幚砣~碟和2張對(duì)照葉碟交錯(cuò)放入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中。在培養(yǎng)皿中央放入1頭饑餓4 h，個(gè)體大小一致的3齡斜紋夜蛾幼蟲，每處理10個(gè)培養(yǎng)皿。非選擇性拒食作用測(cè)定：將2片處理葉碟和2片對(duì)照葉碟分別放入2個(gè)直徑9 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，在培養(yǎng)皿中央分別放入1頭饑餓4 h個(gè)體大小一致的3齡斜紋夜蛾幼蟲，每處理10個(gè)培養(yǎng)皿。在培養(yǎng)皿中放入棉球保濕。分別于處理12 、24 h，用方格坐標(biāo)紙統(tǒng)計(jì)試蟲取食葉片面積，并計(jì)算拒食率。

其中，Sck為對(duì)照組的平均取食面積；S為處理組的平均取食面積。

1.4.4 對(duì)玉米象驅(qū)避作用的測(cè)定將直徑9 cm的圓形濾紙裁成兩半，一半浸入2 g·L?1大葉桃花心木花粉精油或2 g·L?11%印楝素乳油，室溫晾干；另一半浸入溶劑對(duì)照液，晾干作為對(duì)照。將兩半濾紙重新拼接，用粘膠紙固定后置于直徑9 cm培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)處理重復(fù)3次。每皿內(nèi)接入玉米象成蟲20頭。室溫25 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)12 、24 h 后分別檢查成蟲分布情況，并計(jì)算各處理組的驅(qū)避率。進(jìn)一步用0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 g·L?1大葉桃花心木花粉精油測(cè)定對(duì)玉米象（培養(yǎng)12、24、48 h）的驅(qū)避率，采用SPSS軟件繪制毒力曲線，計(jì)算LC50值。

1.5 大葉桃花心木花粉精油的抑菌活性測(cè)定稱取2 g大葉桃花心木花粉精油，溶于V丙酮∶V水=1∶4混合液中，配成400 g·L?1處理藥劑，用無菌濾膜過濾，備用。以V丙酮∶V水=1∶4混合液作為對(duì)照。采用生長速率法測(cè)定大葉桃花心木花粉精油的抑菌活性。無菌條件下，取0.5 mL過濾藥劑和混合溶劑，分別加入到99.5 mL已融化的PDA培養(yǎng)基內(nèi)，迅速搖勻后分裝于培養(yǎng)皿中制成供試濃度為2 g·L?1的含藥平板。每處理3次重復(fù)。培養(yǎng)基冷卻凝固后，將活化培養(yǎng)好的病原菌，用直徑為5 mm滅菌打孔器自菌落邊緣均勻切取菌餅，并用接種針將菌餅接于含藥平板中央，將培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)空白對(duì)照組的菌落大小長到2/3培養(yǎng)皿時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑（mm），取平均值，并計(jì)算抑制率。按照同樣方法測(cè)定0.5、1.0、5.0、10.0和20.0 g·L?1大葉桃花心木花粉精油對(duì)匍枝根霉和黑曲霉的生長抑制率，計(jì)算EC50值和用SPSS軟件計(jì)算毒力方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 大葉桃花心木花粉精油的毒力

2.1.1 對(duì)蚜蟲觸殺的毒力處理12 h的結(jié)果為大葉桃花心木花粉精油2 g·L?1濃度的萵苣指管蚜致死率為58.3%，棉蚜致死率為5%；2 g·L?11%乳油印楝素處理的萵苣指管蚜、棉蚜的致死率均為100%，均顯著高于2 g·L?1大葉桃花心木花粉精油處理。處理24 h的結(jié)果為大葉桃花心木花粉精油對(duì)2種蚜蟲的致死率均有所升高，萵苣指管蚜致死率可達(dá)81.7%，棉蚜致死率為26%（圖1）。總體來看，大葉桃花心木花粉精油對(duì)萵苣指管蚜具有較好的觸殺活性，對(duì)棉蚜的觸殺毒力不理想，但隨著處理時(shí)間的增加，對(duì)2種蚜蟲的毒力都有所增加，說明精油的持效期較好，但大葉桃花心木花粉精油與標(biāo)準(zhǔn)藥劑對(duì)照相比，活性不如對(duì)照藥劑。

圖1 2 g·L?1大葉桃花心木花粉精油對(duì)蚜蟲的毒力測(cè)定Fig. 1 Toxicity of the essential oil at 2 g·L?1 extracted from the pollen of Swietenia macrophylla to aphids

2.1.2 對(duì)斜紋夜蛾的拒食作用處理12、24 h的結(jié)果為2 g·L?1大葉桃花心木花粉精油對(duì)3齡斜紋夜蛾拒食活性均不理想，選擇性拒食作用和非選擇性拒食作用的拒食率均顯著低于2 g·L?11%印楝素乳油（藥劑對(duì)照）的拒食活性（圖2）。

圖2 大葉桃花心木花粉精油對(duì)3齡斜紋夜蛾幼蟲的拒食活性Fig. 2 Antifeedant activity of the essential oil extracted from the pollen of Swietenia macrophylla against the third i nstar larvae of Spodoptera litura

2.1.3 對(duì)玉米象的驅(qū)避作用采用濾紙藥膜法測(cè)定2 g·L?1濃度下，大葉桃花心木花粉精油和印楝素乳油對(duì)玉米象的驅(qū)避活性結(jié)果見圖3。處理12 h，印楝素乳油的驅(qū)避率為46%，大葉桃花心木花粉精油的驅(qū)避率為76.1%，顯著高于印楝素乳油；24 h時(shí)印楝素乳油的驅(qū)避率為82%，大葉桃花心木花粉精油驅(qū)避率87.9%，與印楝素乳油效果相當(dāng)。

圖3 大葉桃花心木花粉精油對(duì)玉米象的驅(qū)避活性Fig. 3 Repellent activity of the essential oil extracted from the pollen of Swietenia macrophylla against Sitophilus zeamais

為進(jìn)一步研究大葉桃花心木花粉精油對(duì)玉米象的驅(qū)避效果，試驗(yàn)選取了5個(gè)濃度（0.5、1.0、2.0、4.0和8.0 g·L?1）的精油測(cè)定對(duì)玉米象12、24 和48 h的驅(qū)避效果，并計(jì)算對(duì)玉米象的毒力回歸方程。由結(jié)果可知（表1），不同處理時(shí)間的方程相關(guān)系數(shù)R值均大于0.9，可見方程相關(guān)性好，可信度高；12、24、48 h的驅(qū)避中濃度（LC50）依次為0.11、2.54、5.86 g·L?1，可見隨著處理時(shí)間的延長，大葉桃花心木花粉精油驅(qū)避效果有所下降。

表1 大葉桃花心木花粉精油對(duì)玉米象的驅(qū)避毒力測(cè)定Tab. 1 Determination of repellent toxicity of the essential oil extracted from the pollen of Swietenia macrophylla to Sitophilus zeamais

2.2 大葉桃花心木花粉精油的抑菌活性

2.2.1 大葉桃花心木花粉精油對(duì)植物病原菌的抑菌活性由圖4可知，大葉桃花心木花粉精油對(duì)不同的植物病原真菌的抑制效果不同，對(duì)芒果蒂腐、水稻稻瘟、香蕉炭疽和芒果炭疽病菌均表現(xiàn)出良好的抑制效果，抑制率分別達(dá)81.21%、74.32%、69.17%和61.76%；對(duì)香蕉枯萎病菌和西瓜枯萎病菌的抑制效果較差。

圖4 2 g·L?1大葉桃花心木花粉精油對(duì)6種真菌的抑菌活性測(cè)定Fig. 4 Antifungal activity of the essential oil at 2 g·L?1 extracted from the pollen of Swietenia macrophylla against six species of fungi

2.2.2 大葉桃花心木花粉精油對(duì)食品微生物的抑菌活性由表2可知，測(cè)定的毒力方程R值均大于0.9，說明方程相關(guān)性好，可信度高；大葉桃花心木花粉精油對(duì)食品微生物（匍枝根霉和黑曲霉）的抑制中濃度（EC50）分別為18.79 g·L?1和7.94 g·L?1，表明，黑曲霉對(duì)該精油更為敏感。

表2 大葉桃花心木花粉精油對(duì)匍枝根霉和黑曲霉抑菌活性統(tǒng)計(jì)分析Tab. 2 Statistical analysis of baceriostatic activity of the essential oil extracted from the pollen of Swietenia macrophylla against Rhizopus nigricans and Aspergillus niger

3 討 論

活性植物資源的篩選一直是植物源農(nóng)藥研發(fā)中最基礎(chǔ)的工作[11]，而大葉桃花心木的花粉包含著植物體生命的遺傳信息以及孕育生命體的全部營養(yǎng)成分，是篩選活性資源的良好材料。該樹種為我國行道樹，非常常見。大葉桃花心木的花小且具有自然大量落花特性，海南每年3～4月份，該樹種大量落花，會(huì)造成環(huán)境不整潔，也給環(huán)衛(wèi)工人清掃造成負(fù)擔(dān)。采用吸塵器或清掃的方法能快速有效地收集大葉桃花心木的落花，并開展其農(nóng)用活性的研究，不僅可以提升環(huán)境清潔度，還能夠開發(fā)利用植物的天然資源。本研究大量收集大葉桃花心木的落花，并對(duì)其進(jìn)行超臨界萃取，對(duì)獲得的花粉精油進(jìn)行農(nóng)用活性測(cè)定。研究發(fā)現(xiàn)，大葉桃花心木的花粉精油對(duì)萵苣指管蚜具有很好的觸殺活性，對(duì)玉米象有較好的驅(qū)避活性，對(duì)芒果蒂腐、水稻稻瘟、香蕉炭疽和芒果炭疽病菌具有良好的抑制效果。由此可見，大葉桃花心木的花粉精油具有潛在的防治農(nóng)業(yè)病蟲害的研究價(jià)值。此外，大葉桃花心木的花粉精油對(duì)引起食品腐爛變質(zhì)的病原微生物黑曲霉也有一定的抑菌活性。

精油通常是含有多種不同化合物的混合物[12]，精油成分的不同使得精油具有不同的農(nóng)用活性，BURT等[13]報(bào)道含酚類等較多的精油往往具有很好的抑菌活性，AMARAL等[14]發(fā)現(xiàn)樹胡椒精油中的橙花叔醇、β-石竹烯和α-蛇麻烯對(duì)棉葉螨具有很好的殺螨和趨避活性，β-石竹烯還具有熏蒸作用。有研究報(bào)道，大葉桃花心木的葉、果實(shí)提取物中的化學(xué)成分復(fù)雜多樣，有檸檬苦素，甾體，黃烷醇，揮發(fā)油等[15?17]。本研究測(cè)定了大葉桃花心木的花粉精油部分農(nóng)用活性，但未對(duì)該精油的活性物質(zhì)進(jìn)行追蹤，其所含的物質(zhì)與前人報(bào)道的提取物中是否一致也有待進(jìn)一步確定。因此，在后續(xù)的進(jìn)一步研究中有必要對(duì)其活性物質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，為該精油的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。