固相萃取技術(shù)在安神滴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中的應(yīng)用及思考

田介峰，羅學(xué)軍，李 冉，3，李瑞明*

（1.天士力控股集團(tuán)有限公司研究院現(xiàn)代中藥開發(fā)中心，天津300410；2.天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300410；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津301617）

中藥是在我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下使用的藥用物質(zhì)及其制劑，是中華民族的瑰寶，但是由于其化學(xué)成分復(fù)雜，質(zhì)量控制一直是中藥面臨的難題之一。當(dāng)前中藥質(zhì)量控制主要是針對其中一種或者幾種有效成分或特征性成分，在此基礎(chǔ)上劉昌孝院士等人提出了中藥質(zhì)量標(biāo)志物的概念（quality marker，Qmarkers），將與中藥的有效性和安全性有關(guān)的中藥成分作為中藥質(zhì)量控制的質(zhì)量標(biāo)志物［1］，但是由于中藥化學(xué)成分復(fù)雜，在對質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行定性鑒別或定量測定時(shí)往往會(huì)受到其他成分的干擾，因此中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的供試品前處理方法顯得尤為重要。良好的供試品前處理方法不僅節(jié)約檢驗(yàn)時(shí)間，減少有機(jī)試劑的使用量，還能提高檢測方法的專屬性和重現(xiàn)性，使方法開發(fā)及樣品檢驗(yàn)達(dá)到事半功倍的效果。

對于大多數(shù)中藥樣品的前處理都需要經(jīng)過較為復(fù)雜的提取及富集過程。提取方法主要包括超聲，熱回流及索氏提取等；富集方法主要是液-液萃取法，但液-液萃取法具有很多缺點(diǎn)如：萃取過程中極易發(fā)生乳化導(dǎo)致操作困難；萃取過程用到大量有機(jī)試劑；難以自動(dòng)化等。固相萃取技術(shù)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種樣品預(yù)處理分離富集技術(shù)［2］，很好地克服了液-液萃取的各種缺點(diǎn)。固相萃取技術(shù)實(shí)質(zhì)上也是一種色譜分離的手段，原理和液相色譜類似，由于其固定相（填料）及流動(dòng)相可以根據(jù)目標(biāo)化合物的性質(zhì)使用不同性質(zhì)的材料和試劑，因此固相萃取技術(shù)廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)、制藥工業(yè)分析、臨床醫(yī)學(xué)分析、食品分析、煙草工業(yè)分析、環(huán)保分析等多個(gè)領(lǐng)域［3-8］。近年來，一些新的固相萃取填料和技術(shù)也得到了應(yīng)用，如分散固相萃取（dispersive solid phase extraction）［9］，分子印跡聚合物固相萃?。?0］等。

安神滴丸是天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司研發(fā)的中藥新藥，具有養(yǎng)血活血，益氣安神等功效，目前處于Ⅱ期臨床階段。由炒酸棗仁、合歡花、三七葉和甘草四味藥組成。通過文獻(xiàn)調(diào)研［11-13］及前期試驗(yàn)將酸棗仁皂苷A、B，槲皮苷，人參皂苷Rb1、Rb3作為安神滴丸質(zhì)控的質(zhì)量標(biāo)志物，其中酸棗仁皂苷A、B，槲皮苷，人參皂苷Rb1、Rb3作為TLC鑒別的質(zhì)量標(biāo)志物，人參皂苷Rb3作為含量測定的質(zhì)量標(biāo)志物。本文通過C18固相萃取小柱進(jìn)行樣品前處理，開發(fā)安神滴丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)獲得了良好的效果，特別是TLC鑒別的供試品溶液制備，通過固相萃取梯度洗脫一次可以得到3個(gè)供試品溶液。近年來中藥質(zhì)量控制愈發(fā)全面、科學(xué)，對于包含多味藥的大復(fù)方需要使用多個(gè)質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行質(zhì)量控制，中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)開發(fā)及檢驗(yàn)成本會(huì)大幅提升，因此一次樣品前處理獲得多個(gè)供試品溶液的思路顯得尤為重要。

1 儀器與試劑

1.1 儀器ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀（沃特世公司）；ST16R高速離心機(jī)（Thermo Scientific）；KQ 500DE超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）；XS205DU電子分析天平（梅特勒托利多公司）；手動(dòng)固相萃取儀（沃特世公司）；Milli Q Advantage超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥 固相萃取小柱（ProElut C18，1 000 mg/6 ml，DIKMA公司）；固相萃取小柱（Cleanert S C18-N，1 000 mg/6 ml，Agela公司）；安神滴丸（批號(hào)20190402，天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司）；色譜純乙腈（批號(hào)JA088630，Merck公司）；其余試劑均為市售分析純試劑；硅膠G板（批號(hào)20190710，青島海洋化工廠分廠）；聚酰胺薄膜（批號(hào)20190903，浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠）；酸棗仁皂苷A對照品（批號(hào)110734-201914，含量以96.0%計(jì)，中國食品藥品檢定研究院）；酸棗仁皂苷B對照品（批號(hào)110814-201809，含量以96.2%計(jì)，中國食品藥品檢定研究院）；槲皮苷對照品（批號(hào)111538-20160，含量以90.6%計(jì)，中國食品藥品檢定研究院）；人參皂苷Rb1對照品（批號(hào)110704-202028，含量以93.1%計(jì)，中國食品藥品檢定研究院）；人參皂苷Rb3對照品（批號(hào)111686-201504，含量以97.0%計(jì)，中國食品藥品檢定研究院）；甘草酸銨對照品（批號(hào)110731-201720，含量以97.7%計(jì)，中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法與結(jié)果

2.1 全方化學(xué)成分分析 通過對全方化學(xué)成分分析，了解質(zhì)量標(biāo)志物的極性，為固相萃取的方法開發(fā)提供依據(jù)。

2.1.1 供試品溶液制備 稱取安神滴丸1 g，加入60%乙醇10 ml超聲30 min使溶解（均勻分散，無塊狀物），提取液（5 000 r/min）離心10 min，傾出上清液，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取適量酸棗仁皂苷A、B，槲皮苷，人參皂苷Rb1、Rb3和甘草酸銨置于量瓶中，加甲醇溶解，配置成1 ml各含0.5 mg的對照品溶液，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～3 min，10%乙腈；3～5 min，10%→15%乙腈；5～8 min，15%→20%乙腈；8～10 min，20%→25%乙腈；10～12 min，25%→30%乙腈；12～14 min，30%→35%乙腈；14～20 min，35%→45%乙腈；20～25 min，45%→75%乙腈；25～30 min，75%→90%乙腈；30～35min，90%→100%乙腈；進(jìn)樣量4 μl；流速0.3 ml/min；柱溫30℃；選擇全波長掃描。

2.1.4 結(jié)果 通過對照品比對以及色譜峰紫外吸收分析，可將安神滴丸全方化學(xué)成分分析色譜圖依據(jù)色譜峰保留時(shí)間分為4個(gè)區(qū)域（圖1），0~6 min為大極性化學(xué)成分區(qū)，6~14 min是以黃酮苷為主的中大極性化學(xué)成分區(qū)，其中槲皮苷的含量最大，14~20 min是以三萜皂苷為主的中小極性化學(xué)成分區(qū)（主要成分為人參皂苷Rb1、Rb3，酸棗仁皂苷A、B，甘草酸等），20~35 min為小極性化學(xué)成分區(qū)［其中包括三萜類化合物如甘草次酸（甘草次酸為甘草酸的苷元）等］。結(jié)果顯示安神滴丸的化學(xué)成分在反相色譜中按化學(xué)成分的極性大小有較好的分離效果，質(zhì)量標(biāo)志物也分布在不同的極性區(qū)域內(nèi)，提示可以通過使用反向填料（C18）的固相萃取小柱對安神滴丸進(jìn)行前處理，通過梯度洗脫一次得到多個(gè)供試品溶液。

圖1 安神滴丸和對照品色譜圖

2.2 TLC鑒別 依據(jù)安神滴丸全方化學(xué)成分分析的結(jié)果進(jìn)行了固相萃取小柱洗脫條件的探索，最終將鑒別項(xiàng)供試品溶液制備方法確定如下：取安神滴丸0.5 g，壓破包衣，加入60%乙醇5 ml超聲30 min使溶解（均勻分散，無塊狀物），提取液離心（5 000 r/min）10 min，傾出上清液，在上清液中加入5 ml水，混勻后上樣到C18固相萃取小柱［1 g/6 ml，固相萃取小柱需提前依次使用甲醇（10 ml）和水（10 ml）處理活化，上樣流速為1 ml/min。上樣完成后先用水（20 ml）進(jìn)行洗脫（除去大極性化學(xué)成分），棄去洗脫液后依次使用40%甲醇（20 ml）、60%甲醇（20 ml）和80%甲醇（20 ml）進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速均為1 ml/min。將40%甲醇洗脫液、60%甲醇洗脫液和80%甲醇洗脫液分別蒸干，再分別用2 ml甲醇溶解作為合歡花（槲皮苷），炒酸棗仁（酸棗仁皂苷A、B），三七葉（人參皂苷Rb1、Rb3）鑒別項(xiàng)的供試品溶液。通過對各鑒別項(xiàng)的色譜條件開發(fā)及專屬性、耐用性的考查（圖2-4），最終確定了各薄層鑒別項(xiàng)色譜條件。合歡花薄層鑒別項(xiàng)色譜條件：固定相：聚酰胺薄膜；展開劑：80%甲醇/水；顯色劑：3%FeCl3乙醇溶液；炒酸棗仁薄層鑒別項(xiàng)色譜條件：固定相：硅膠G板；展開劑：水飽和正丁醇-甲醇（10∶1）；顯色劑：2%香草醛-10%硫酸乙醇溶液，60℃顯色；三七葉薄層鑒別項(xiàng)色譜條件：固定相：硅膠G板；展開劑：氯仿-甲醇-水（7∶3∶0.5）；顯色劑：2%香草醛-10%硫酸乙醇溶液，80℃顯色。試驗(yàn)結(jié)果表明所開發(fā)方法的專屬性（和陰性樣品比較）及耐用性（使用不同廠家的SPE小柱進(jìn)行樣品前處理）較好且省時(shí)、省力，極大得縮短了檢驗(yàn)時(shí)間并降低了檢驗(yàn)成本。

圖2 合歡花薄層色譜圖

2.3 含量測定

2.3.1 供試品溶液制備 依據(jù)安神滴丸全方化學(xué)成分分析的結(jié)果進(jìn)行了固相萃取小柱洗脫條件的探索，最終將人參皂苷Rb3含量測定供試品溶液制備方法確定如下：稱取安神滴丸約2 g，精密稱定，壓破包衣，加入60%乙醇10 ml超聲30 min使溶解（均勻分散，無塊狀物），提取液離心（5 000 r/min）10 min，傾出上清液，在離心管中加入10 ml 60%乙醇，超聲洗滌殘?jiān)箅x心（5 000 r/min）10 min，傾出上清液，合并兩次上清液。在上清液中加入20 ml水（稀釋1倍），混勻后上樣到SPE固相萃取小柱［1 g/6 ml，SPE固相萃取小柱需提前依次使用甲醇（10 ml）和水（10 ml）處理活化］，上樣流速為1 ml/min。上樣完成后先用水（20 ml）進(jìn)行洗脫，棄去洗脫液后依次使用40%甲醇（20 ml）、甲醇（10 ml）進(jìn)行梯度洗脫，洗脫流速均為1 ml/min。使用10 ml量瓶收集甲醇洗脫液，定容，搖勻，過濾，即得。

2.3.2 對照品溶液制備 稱取適量人參皂苷Rb3對照品，精密稱定，用60%乙醇配制成濃度約為0.5 mg/ml的對照品溶液。

2.3.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～10 min，25%乙腈；10～11 min，25%→28%乙腈；11～30 min，28%乙腈；30～31 min，28%→90%乙腈；31～35 min，90%乙腈；35～36 min，90%→25%乙腈；36～40 min，25%乙腈；進(jìn)樣量2 μl；流速0.5 ml/min；柱溫30℃；檢測波長203 nm。理論板數(shù)按人參皂苷Rb3色譜峰計(jì)算應(yīng)不低于8 000；進(jìn)樣量2 μl。

圖3 炒酸棗仁薄層色譜圖

圖4 三七葉薄層色譜圖

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下人參皂苷Rb3對照品溶液按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果，峰面積的RSD為0.30%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 專屬性試驗(yàn) 取60%乙醇（空白溶劑）、空白溶液（不上樣其余制備過程同供試品溶液）、陰性樣品溶液（制備方法同供試品溶液）、人參皂苷Rb3對照品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣記錄色譜圖，結(jié)果顯示取60%乙醇、空白溶液及陰性樣品溶液在人參皂苷Rb3色譜峰處無干擾，表明方法專屬性良好。見圖5。

圖5 空白溶劑（A）

2.3.6 線性試驗(yàn) 精密稱取50 mg人參皂苷Rb3用60%乙醇溶解，置于25 ml量瓶中，定容，搖勻即得濃度為2 mg/ml的對照品母液。稀釋后分別得濃度為1、0.5、0.4、0.25和0.2 mg/ml的對照品溶液。分別精密吸取6種濃度的對照品溶液各2 μl注入超高效液相色譜儀，按“2.3.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。試驗(yàn)表明人參皂苷Rb3濃度在0.20~1.96 mg/ml范圍內(nèi)響應(yīng)值與其濃度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=942 516 X-467.91（r=1.000 0）。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為20190402的供試品6份，按“2.3.1”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，檢測人參皂苷Rb3含量，結(jié)果6份供試品溶液的人參皂苷Rb3含量平均值為2.19 mg/g，RSD為1.3%。

2.3.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取批號(hào)為20190402的供試品6份每份約1 g，精密稱定，分別加入線性項(xiàng)下濃度為2 mg/ml的對照品溶液1 ml（對照品加入量和供試品中待測定成分量約為1∶1），加入60%乙醇補(bǔ)足至10 ml，然后按“2.3.1”項(xiàng)下的供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液。按“2.3.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率，考查方法的準(zhǔn)確度。6份加樣回收樣品的回收率平均值為102.7%，RSD為2.3%。

2.3.9 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 將供試品溶液及對照品溶液分別于室溫下放置0、6、12、18和24 h時(shí)進(jìn)行檢測，記錄峰面積。結(jié)果顯示供試品溶液中人參皂苷Rb3色譜峰面積的RSD%為1.4%，對照品溶液中人參皂苷Rb3色譜峰面積的RSD%為1.1%，表明供試品溶液及對照品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 討論

結(jié)合全方化學(xué)成分分析結(jié)果，槲皮苷極性較大，在反向色譜中出峰較早，試驗(yàn)表明40%甲醇溶液即可將其洗脫。酸棗仁皂苷A、B極性較小，可用60%甲醇進(jìn)行洗脫。人參皂苷Rb1、Rb3極性也較小，試驗(yàn)表明其色譜行為與酸棗仁皂苷A、B接近，在60%甲醇洗脫時(shí)會(huì)有少量人參皂苷Rb1、Rb3泄露，但主要成分還是酸棗仁皂苷A、B，80%甲醇洗脫時(shí)會(huì)有大量人參皂苷Rb1、Rb3流出。因此將40%、60%和80%甲醇溶液分別作為合歡花、炒酸棗仁、三七葉鑒別項(xiàng)的供試品溶液?？梢姽滔噍腿〖夹g(shù)很好的分離、富集了不同成分，使其分析的專屬性、靈敏度大幅度提升，成功地應(yīng)用于安神滴丸鑒別及含量測定的樣品前處理，開發(fā)了省時(shí)、省力且專屬性、重現(xiàn)性等均較好的分析方法，極大地節(jié)省了檢測時(shí)間，提高了檢測效率，為中藥新藥開發(fā)中質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供了新思路。

固相萃取技術(shù)是一種具有很多優(yōu)勢的樣品前處理技術(shù)，特別適用于化學(xué)成分復(fù)雜的中藥的樣品前處理，目前已有多種填料及型號(hào)的市售固相萃取小柱可供選擇，但2020版《中國藥典》［14］中收錄的藥材及制劑（2 711種）中僅有少量品種（32種）用到了固相萃取技術(shù)（《中國藥典》中某些品種的樣品前處理用到了D101等大孔吸附樹脂，嚴(yán)格意義上講也屬于固相萃取技術(shù)的應(yīng)用，但在實(shí)際操作過程中由于手動(dòng)填裝的開放柱影響因素較多，方法的重現(xiàn)性會(huì)受到一定影響，也不利于后期的自動(dòng)化，和當(dāng)前主流的固相萃取技術(shù)差別較大，故不做統(tǒng)計(jì)），其中7個(gè)品種還是2020版新收錄品種。其原因可能是以下兩個(gè)方面：首先可能是《中國藥典》收錄的是使用歷史較長且成熟的品種，這些品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)開發(fā)時(shí)固相萃取技術(shù)還不成熟。新版《中國藥典》中新收錄的品種中使用固相萃取進(jìn)行樣品前處理的品種比例升高也佐證了這一原因；其次可能是出于成本考慮，市售的固相萃取小柱價(jià)格較高，特別是一些填料價(jià)格本身較貴（如C18等）的固相萃取小柱，但是由于這些固相萃取小柱一般經(jīng)過簡單處理可以反復(fù)使用并且所需樣品及試劑量少，以及可以通過一次樣品前處理獲得多個(gè)供試品溶液等，綜合成本核算往往低于傳統(tǒng)的液-液萃取，且可以避免使用大量對環(huán)境及人體有毒有害的有機(jī)試劑。隨著《中國藥典》倡導(dǎo)的“擴(kuò)大成熟分析技術(shù)應(yīng)用”，固相萃取技術(shù)必將越來越多的應(yīng)用于分析樣品的前處理中。