肉制品中丙二醛的超高效液相色譜檢測(cè)方法的比較研究

欒君，劉方園，金海濤，陳國(guó)友，王翠玲，杜英秋*

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，黑龍江 哈爾濱 150000；2.黑龍江建筑職業(yè)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150000）

肉類制品在加工和貯藏過(guò)程中發(fā)生的脂質(zhì)氧化易受含量和組分的影響。脂質(zhì)氧化隨著脂質(zhì)含量和多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）與飽和脂肪酸（saturated fatty acids，SFAs）比例的增加而增加[1-3]。脂質(zhì)氧化是一個(gè)復(fù)雜的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過(guò)程，起始于活性氧的存在，如超氧陰離子自由基的存在。過(guò)氧化物非陰離子自由基可以通過(guò)酶和分子氧的非酶促化學(xué)還原反應(yīng)而產(chǎn)生[4-5]。這些活性氧與多種生物分子發(fā)生反應(yīng)，生成醛、酮、酸、醇和碳?xì)浠衔?，在結(jié)構(gòu)、風(fēng)味和顏色方面會(huì)產(chǎn)生不良變化，從而降低產(chǎn)品的質(zhì)量，甚至不利于人類的食用[6-9]。丙二醛（malondialdehyde，MDA）作為脂質(zhì)氧化的副產(chǎn)物是測(cè)定肉類脂質(zhì)氧化狀態(tài)的生物標(biāo)志物之一。MDA是一種低分子量的揮發(fā)性短鏈 1，3-二羰基化合物（C3H4O2，分子量為 72.07），中等弱酸性（pKa=4.46）[10-12]。

目前，肉制品中MDA含量通常使用硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）進(jìn)行測(cè)定，MDA與2-硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)生的紅色色素體MDA-TBA2可通過(guò)分光光度計(jì)在530 nm～535 nm處檢測(cè)[13]。盡管TBARS法已被用于測(cè)定牛羊肉、豬肉、臘腸和香腸中的脂質(zhì)氧化，且這種分析方法簡(jiǎn)單且可重復(fù)性高，但測(cè)定的MDA的含量往往比真實(shí)值偏高[14]。此現(xiàn)象可能是由于TBA與羰基化合物、糖、水溶性蛋白質(zhì)、多肽和基質(zhì)中存在的許多其他化合物反應(yīng)而形成與MDA-TBA2相同波長(zhǎng)的物質(zhì)或在基質(zhì)中存在吸收此波長(zhǎng)的物質(zhì)，如色素[15-18]。采用液相色譜—熒光檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器可提高M(jìn)DA分析的特異性，可使MDA-TBA2從其它TBARS物質(zhì)或干擾化合物中進(jìn)行分離和定量[19]。本研究的目的是建立一種基于超高效液相色譜-熒光檢測(cè)器（ultra-performance liquid chromatography-fluorescence detector，UPLC-FLD）或超高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器（ultra-performance liquid chromatography-diode array detector，UPLC-DAD）的準(zhǔn)確且快速的檢測(cè)方法，并與TBARS分光光度法進(jìn)行比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2，6-di-tert-Butyl-4-methylphenol，BHT，純度≥99.9%）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA，純度≥99.5%）、1，1，3，3-四甲氧基丙烷（1，1，3，3-tetramethoxypropane，TMP，99%）、磷酸溶液（85%）、乙醇（分析級(jí)）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；2-硫代巴比妥酸（TBA，純度≥99%）、乙腈（色譜級(jí)，超梯度99.9%，0.2 μm）：美國(guó)默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q凈水系統(tǒng)：德國(guó)默克集團(tuán)；Microfuge16離心機(jī)：美國(guó)貝爾曼庫(kù)爾特有限公司；ART MICCRA D-1均質(zhì)器：德國(guó)ART有限公司；Waters ACQUITY HClass超高效液相色譜[配有Acquity UPLC HSS（高強(qiáng)度硅膠）色譜柱]、ACQUITY UPLC光電二極管陣列檢測(cè)器、Waters 2475多通道熒光檢測(cè)器：沃特世科技（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

豬肉：將豬背最長(zhǎng)肌切片置于商品包裝中，在改良的環(huán)境下陳化至保質(zhì)期限（4℃，8 d）；雞肉：將雞腿肉置于商品包裝中，在改良的環(huán)境下陳化至保質(zhì)期限（4℃，8 d）；牛肉/羔羊肉：將牛肉/羔羊肉背肌切片放入聚苯乙烯托盤中，用透氧塑料薄膜包裝，在4℃避光的條件下保存，分別于1、4、8、12 d進(jìn)行優(yōu)化分析以獲得MDA含量較高的樣品，最終確定以4 d成熟后的樣品為例進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)分析；這些生肉樣品的陳化期結(jié)束后，使用切碎機(jī)將樣品（200 g～250 g）均質(zhì)化，并以每份10 g進(jìn)行等分并存儲(chǔ)。香腸、火腿和牛肉漢堡等商品樣品在購(gòu)買當(dāng)天拆下包裝，同樣用切碎機(jī)將200 g～250 g的樣品均質(zhì)化，等分成每份5 g進(jìn)行貯存，所有生肉和肉制品均在-20℃下進(jìn)行真空包裝和冷凍貯存。

所有肉類基質(zhì)的提取方法都相同，僅樣品稱取量不同：生肉10 g，肉制品5 g。每個(gè)樣品在50 mL離心管中稱重。將50 μL的7.2%BHT加入乙醇中，在超純水中加入將10 mL的10%的TCA，利用均質(zhì)器對(duì)混合物進(jìn)行45 s均勻化。將樣品在4℃條件下4 000×g離心15 min，隨后使用濾紙（直徑150 mm）過(guò)濾。取1 mL注入到10 mL的EP管中，加入1mL 10 mmol/L TBA溶液，進(jìn)而衍生出MDA。通過(guò)沸水浴進(jìn)行孵育45 min，冷卻后將 150 μL 注入至 800 μL 的超純水 30∶70（體積比）的EP管中，并將提取液過(guò)濾到2 mL琥珀色螺旋帽小瓶中。對(duì)于分光光度法無(wú)需進(jìn)行稀釋，直接在衍生化反應(yīng)后進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 試劑的制備

三氯乙酸使得樣品中的蛋白沉淀并提供一種酸性介質(zhì)，促使MDA與TBA反應(yīng)形成MDA-TBA2。在超純水中制備10%的TCA溶液，在28℃～32℃下超聲20 min，直至所有固態(tài)TCA溶解，所得溶液可在室溫（20℃）且避光條件下穩(wěn)定保存數(shù)月。在10%的TCA溶液中制備10 mmol/L的TMP溶液。將TMP溶液在28℃～32℃下超聲處理5 min，并在室溫（20℃）下避光保存2 h。在此期間，TMP反應(yīng)生成MDA，得到10 mmol/L的MDA溶液（TMP的一個(gè)分子生成MDA分子）。從10 mmol/L MDA溶液開(kāi)始，制備8個(gè)不同濃度的MDA標(biāo)準(zhǔn)品，從0.25 μmol/L～40 μmol/L的MDA溶液，全部稀釋在10%的TCA中。

在超純水中制備10mmol/L的TBA溶液。在28℃～32℃下將TBA溶液超聲處理20 min，直到所有固體TBA溶解。該溶液在室溫（20℃）下避光可穩(wěn)定保存一周左右。2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚作為抗氧化劑，可避免在樣品處理過(guò)程中生成新的MDA。在乙醇中制備7.2%的BHT溶液。在室溫（20℃）下，BHT溶液在定軌搖床中振蕩15 min。

1.3.3 UPLC的條件與方法

流動(dòng)相A乙腈和流動(dòng)相B磷酸溶液（0.3%），流速為0.2 mL/min（25%A和75%B）。將樣品與色譜柱的溫度分別調(diào)節(jié)至25℃和35℃。注射體積為5 μL，色譜過(guò)程的總運(yùn)行時(shí)間為5 min。通過(guò)532 nm處的吸光度和λ激發(fā)=530 nm和λ發(fā)射=550 nm處的熒光對(duì)MDA-TBA2進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)對(duì)保留時(shí)間和光譜分析與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較來(lái)定量測(cè)定MDA-TBA2，基于外部校準(zhǔn)（線性曲線）對(duì)0.02 μmol/L至40 μmol/L之間的不同MDA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的特異性

通過(guò)熒光檢測(cè)器得到的標(biāo)準(zhǔn)品和牛肉樣品色譜圖結(jié)果如圖1所示。

圖1（A）是MDA標(biāo)準(zhǔn)品衍生化后的MDA-TBA2色譜圖，濃度從 0.25 μmol/L～40 μmol/L；圖 1（B）中的色譜圖分別對(duì)應(yīng)于MDA-TBA2標(biāo)準(zhǔn)品和牛肉樣品。該方法的特異性極高，因此在所監(jiān)測(cè)的波長(zhǎng)（λ激發(fā)=530 nm和λ發(fā)射=550 nm）下研究的基質(zhì)中幾乎無(wú)其他相關(guān)的干擾峰，極大地簡(jiǎn)化了色譜數(shù)據(jù)的處理，提高了相關(guān)肉制品分析方法的特異性和選擇性。

圖1 衍生化后的MDA-TBA2色譜圖Fig.1 MDA-TBA2chromatogram after derivatization

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

在1.3.1中，樣品前處理是依據(jù)不同參數(shù)可能影響分析過(guò)程的優(yōu)化結(jié)果。所評(píng)估的參數(shù)包括TCA濃度、TBA濃度和生成MDA-TBA2的反應(yīng)時(shí)間。首先，基于過(guò)量的TBA（20 mmol/L）對(duì)同一牛肉樣品中不同濃度的TCA進(jìn)行測(cè)定，并在沸水浴中優(yōu)化孵育時(shí)間。低濃度（0.5%和1%）的TCA不能有效地沉淀基質(zhì)中的蛋白質(zhì)，因此，分別針對(duì) 3%、5%、8%、10%、12%的TCA濃度和 15、30、45、60 min的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行 4次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 TCA濃度和反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化Fig.2 Optimization of TCA concentration and reaction time

從樣品中定量提取MDA至少需要10%，并且在沸水浴中反應(yīng)30 min以上才能定量形成MDA-TBA2。由圖2可知，以10%的TCA作為萃取劑，反應(yīng)45 min是形成MDA-TBA2的最佳孵育時(shí)間。以10%的TCA作為萃取劑，45 min為反應(yīng)時(shí)間來(lái)優(yōu)化TBA的濃度，進(jìn)行4次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 TBA濃度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of TBA concentration

可以明顯得出在10 mmol/L處熒光強(qiáng)度最高，即最佳的TBA濃度為10 mmol/L。在90℃～100℃的溫度下，2-硫代巴比妥酸在酸性介質(zhì)中與MDA反應(yīng)形成紅色加合物MDA-TBA2。MDA-TBA2化合物在532 nm處摩爾吸光度較高，并在λ激發(fā)=530 nm和λ發(fā)射=550 nm時(shí)具有高熒光。與直接測(cè)定相比，TBA對(duì)MDA進(jìn)行衍生化可提高M(jìn)DA分析的靈敏度和特異性。

2.3 方法的靈敏度

不同方法的靈敏度比較見(jiàn)表1。

表1 不同方法的靈敏度比較（n=4）Table 1 Sensitivity comparison of different methods（n=4）

由表1可知，3種分析方法在MDA-TBA2化合物與信號(hào)之間均表現(xiàn)出良好的線性響應(yīng)，對(duì)于分光光度法和 UPLC-DAD法，在 0.25 mmol/L～40 mmol/L的MDA具有較大的線性范圍，而對(duì)于UPLC-FLD法在0.04 mmol/L～40 mmol/L之間的MDA存在較大的線性范圍。線性方程具有較高的確定系數(shù)，R2在0.998 1～0.999 6。檢測(cè)線與定量限較低，足以確定待測(cè)基質(zhì)中MDA的含量。與分光光度法相比，UPLC-FLD方法的靈敏度有了較大提升，待測(cè)樣品中的檢出限提高了20倍以上。

2.4 不同方法對(duì)MDA定量分析的影響

3種方法測(cè)定樣品中MDA的濃度見(jiàn)表2。

由表2可知，基于所研究的定量方法對(duì)所有基質(zhì)MDA的濃度進(jìn)行測(cè)定。由于分光光度法是最常用的方法，所以本研究結(jié)果與分光光度法相關(guān)研究[20]的結(jié)果基本一致。在雞肉、豬肉、牛肉和羊肉等生肉樣品中，雞肉的MDA濃度最高，因其具有較高的脂肪含量和最利于脂質(zhì)氧化的PUFA/SFA比值，并且雞大腿肉是一種更易于降解類型的肉基質(zhì)。不同類型的臘腸脂質(zhì)氧化MDA值變化很大，影響脂質(zhì)氧化的因素很多，例如成分、加工條件和成熟時(shí)間等。在所有待測(cè)基質(zhì)中，臘腸的MDA含量最高，這可能是因?yàn)?種產(chǎn)品中脂肪含量較高，風(fēng)干過(guò)程促進(jìn)了脂質(zhì)氧化，從而促進(jìn)了MDA的形成[21]。與生肉樣品相比，MDA值較低的肉制品因在加工過(guò)程中添加了抗氧化劑和防腐劑，或因熱處理而導(dǎo)致MDA的降解。牛肉漢堡中MDA含量與生牛肉的MDA值相似。

表2 3種方法測(cè)定樣品中MDA的濃度（n=4）Table 2 Determination of MDA concentrations in samples by three methods（n=4） mg/kg

定量方法對(duì)所有待測(cè)樣品中MDA含量的影響均有顯著性差異（p＜0.05）。在UPLC-DAD和UPLC-FLD進(jìn)行比較時(shí)，除了S7和S8樣品有顯著性差異（p＜0.05），這兩種方法的MDA值基本一致（p＞0.05）。盡管在這些基質(zhì)中，用UPLC-DAD方法估算的MDA濃度更接近檢測(cè)限。但在這些樣品中，UPLC-FLD方法更為可取。兩種UPLC方法與經(jīng)典TBARS分光光度法比較，除牛肉樣品外（p＞0.05），所有樣品中的所有MDA含量均存在顯著性差異（p＜0.05）。與UPLC方法相比，分光光度法檢測(cè)MDA含量明顯高于實(shí)際值。生肉樣品中MDA含量為4%～62%，加工肉制品中MDA含量為54%～2 068%。生肉樣品中MDA值高估是由于TBA會(huì)與羰基化合物、糖、水溶性蛋白質(zhì)、多肽和基質(zhì)中存在的許多其它化合物發(fā)生反應(yīng)。肉制品中MDA值高估是由于TBA與基質(zhì)中存在的化合物發(fā)生反應(yīng)；以及由于存在可直接干擾或與TBA反應(yīng)產(chǎn)生新的干擾化合物的香料和色素。

2.5 方法的基本參數(shù)

UPLC法的中間精密度、重現(xiàn)性和回收率見(jiàn)表3。

表3 UPLC法的中間精密度、重現(xiàn)性和回收率（n=4）Table 3 Intermediate precision，reproducibility and recovery of UPLC method（n=4）

由表3可知，UPLC-DAD和UPLC-FLD方法的重現(xiàn)性，中間精密度和回收率。UPLC-FLD法對(duì)所有樣品具、s）為4.2%～8.4%，肉制品比生肉樣品變異系數(shù)低，可能是由于生肉原料不易均質(zhì)化。若將生肉凍干再進(jìn)行均質(zhì)化，則可以解決此類問(wèn)題，從而便于對(duì)代表性等分試樣進(jìn)行采樣。

此外，使用凍干樣品將極大地便于樣品的處理，由于可以使用軌道振蕩器代替高性能的均質(zhì)機(jī)進(jìn)行MDA的提取，從而使該方法更加方便、快捷并提高了準(zhǔn)確性。相比較而言，UPLC-DAD分析方法的重現(xiàn)性比UPLC-FLD法的重復(fù)性差。UPLC-FLD法也為所有樣品提供了較好的中間精密度，在5.5%至9.2%的范圍內(nèi)，與UPLC-DAD法的趨勢(shì)一致。在回收率方面，UPLC-FLD法針對(duì)所有樣品均獲得了較好的MDA回收率值，不管是低加標(biāo)濃度（MDA=0.1 mg/kg）還是高加標(biāo)濃度（MDA=1.0 mg/kg），回收率在 91.4%～108.5%范圍內(nèi)，而UPLC-DAD方法與UPLC-FLD方法的回收率相比略低（除個(gè)別樣品外）。

3 結(jié)論

本研究基于TCA萃取促使TBA衍生化進(jìn)而與MDA反應(yīng)形成MDA-TBA2，通過(guò)UPLC-FLD法和UPLC-DAD法對(duì)其進(jìn)行定量分析，通過(guò)與傳統(tǒng)的TBARS分光光度法進(jìn)行對(duì)比，從而確定最佳的UPLC方法。該方法快速、簡(jiǎn)單，對(duì)所研究的樣品（肉和肉制品）均具有良好的分析性能，包括特異性、靈敏度、精密度、重現(xiàn)性和回收率。若沒(méi)有UPLC-FLD的使用條件，也可以用UPLC-DAD來(lái)量化MDA的含量，但需注意的是，在低濃度時(shí)其檢測(cè)限較高。分析評(píng)估凍干樣品而不是新鮮肉類將具有一定的研究前景，因?yàn)閮龈煽赡軙?huì)簡(jiǎn)化方法，減少試劑的使用，并能夠提高方法的靈敏度和精密度等分析性能的參數(shù)。此方法還可用于測(cè)定其它原料和加工制品（例如魚(yú)和魚(yú)制品）中MDA的含量，為其相關(guān)研究提供一定的理論依據(jù)。