蒲瑩,王樹林,2,3*
(1.青海大學農(nóng)牧學院,青海 西寧 810016;2.青海大學省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室,青海 西寧 810016;3.青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室,青海 西寧 810016)
黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)是青藏高原特色資源多棘刺灌木植物,其果實具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗病毒、降血糖、降血壓和保肝等生理活性[1]。黑果枸杞汁中酶促褐變的關鍵酶多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)能催化酚類羥基轉化為鄰苯二酚,再催化鄰苯二酚轉化為有色醌類物質,最終造成褐變[2],而且多酚氧化酶能促進黑果枸杞汁中關鍵抗氧化活性物質多酚類和花青素的降解[3],導致其保健功能和生理作用的減弱。由于酶是一類具有催化作用的蛋白質,它的功能活性與結構密切相關。近年來,相關學者為研究酶活性變化的相關機理,對其蛋白高級結構也進行了相關探究。相關研究都表明可以在分子水平探討酶活性變化的機理,從而為減緩黑果枸杞汁氧化褐變提供有效思路。
超高壓(ultra-high pressure,UHP)技術是一種在食品行業(yè)中極具發(fā)展?jié)摿Φ氖称芳庸し椒?,能在較低或者常溫條件下,不改變小分子物質及共價鍵結構,卻能改變生物體中高分子物質的非共價結構[4],所以超高壓技術在有效鈍化酶活性的同時能更好地保證食品營養(yǎng)成分和感官性能。目前少有關于青藏特色資源黑果枸杞汁的加工與貯藏的研究。黑果枸杞活性物質花青素的極不穩(wěn)定和內(nèi)源酶導致的氧化褐變都會影響其果汁的加工,將超高壓技術應用于黑果枸杞汁的加工,有利于內(nèi)源酶的鈍化和延緩活性成分的流失。目前鮮有關于超高壓對于黑果枸杞汁中多酚氧化酶活性影響的研究,對酶結構影響及作用機理研究則更少。
故本文研究在不同壓力(200 MPa~500 MPa)條件下,黑果枸杞汁中的關鍵性內(nèi)源酶多酚氧化酶活性、結構以及形態(tài)特征的變化,以期改善黑果枸杞汁品質,探索黑果枸杞汁的加工新技術。
黑果枸杞:采于青海省諾木洪地區(qū)。
聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVPP)、8-苯胺基-1-萘磺酸銨(ammonium 8-anilino-1-naphthalenesulfonate,ANS)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS):北京索萊寶科技有限公司;多酚氧化酶試劑盒:南京建成生物工程研究所。
HHP600/5L超高壓處理設備:包頭科發(fā)高壓科技有限公司;ZD-LZ-0.5螺旋榨汁機:靖江市中德機械制造廠;Nicolet6700傅立葉紅外光譜儀:美國熱電公司;DSC-200F3差示掃描量熱儀:德國耐馳儀器制造有限公司;JSM-6610掃描電子顯微鏡:日本電子公司;RF-6000熒光分光光度計:島津企業(yè)(中國)有限公司。
1.3.1 黑果枸杞汁中PPO提取
PPO的提取參照林波等[5]的方法,并稍作修改。將黑果枸杞榨汁后與磷酸鹽緩沖液(pH6.5,0.1 mol/L)和4%PVPP等體積混合,4℃條件下靜置1 h,10 000 r/min離心20 min,得到上清液即為黑果枸杞汁PPO粗提液。
1.3.2 超高壓處理
將得到的黑果枸杞汁PPO粗提液分別罐裝于耐壓塑料瓶中,用封口膜密封。采用超高壓設備分別于200、300、400、500 MPa 壓力下處理 10 min,不做任何壓力處理的作為空白對照[6]。
1.3.3 PPO活性測定
PPO活性的測定采用試劑盒法[7],在420 nm處測定吸光度,計算酶活性。
1.3.4 差示掃描量熱(differential scanning calorimetry,DSC)分析
參考朱玉兵等[8]的方法,采用差示掃描量熱儀對黑果枸杞PPD進行分析,加熱速率為5℃/min,溫度范圍為25℃~85℃。使用DSC分析軟件(TA Universal Analysis 2000)估算DSC熱譜圖中的峰值溫度和峰面積,分別定義為熱變性溫度(T)和熱變性焓(ΔH)。
1.3.5 表面疏水性分析
參考余晶梅等[9]的方法,采用ANS熒光探針法測定黑果枸杞汁PPO的表面疏水性。使用ANS作為熒光探針,用0.01 mol/L PBS與0.15 mol/L NaCl混合液將樣品稀釋至 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL,分別加入80μLANS,20℃避光平衡1h,設置激發(fā)波長390nm,發(fā)射波長470nm,狹縫寬度5nm,掃描速率1200nm/min,以熒光強度對其濃度作圖,圖線的初始斜率即為酶蛋白表面疏水性指數(shù)S0。
1.3.6 傅立葉紅外光譜(Fourier infrared spectroscopy,F(xiàn)T-IR)分析
參照ZHU等[10]的方法,將處理得到樣品冷凍干燥,在400 cm-1~4 000 cm-1波長范圍進行傅立葉紅外光譜的測定。
1.3.7 內(nèi)源熒光光譜分析
參考周雅琪等[11]的方法,將1.3.1中制得的PPO粗提液放入熒光比色皿中,設置激發(fā)波長為295nm,掃描范圍為200nm~600 nm,激發(fā)和發(fā)射縫寬為5 nm,掃描速率為1 200 nm/min。
1.3.8 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)分析
用掃描電子顯微鏡分析黑果枸杞PPO的形態(tài)特征[12],將樣品冷凍干燥后用掃描電子顯微鏡進行掃描,觀察其形態(tài)特征。
1.3.9 統(tǒng)計與分析
所有試驗數(shù)據(jù)用SPSS Statistics 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析,采用Prism 8作圖。
超高壓處理對黑果枸杞汁PPO活性的影響見圖1。
圖1 不同壓力下黑果枸杞汁PPO活性Fig.1 PPO activity of Lycium ruthenicum Murr.juice with different pressures
如圖 1所示,經(jīng)超高壓(200 MPa~500 MPa)處理的黑果枸杞汁PPO活性分別為(25.83±1.12)、(28.29±0.88)、(0.49±0.34)、(0.48±0.20)U/mL,未經(jīng)任何處理的樣品PPO活性為27.28 U/mL。300 MPa處理酶活性略有升高,但與對照組差異不顯著(p>0.05),略微升高的原因可能是分子在一定的空間范圍內(nèi),受到壓力作用,使得酶與底物更加充分地接觸從而有所升高。壓力繼續(xù)增大使PPO活性降低,400 MPa和500 MPa能使酶活性降低至0.5 U/mL以下(p<0.05)。JUAREZENRIQUEZ等[13]研究發(fā)現(xiàn)在壓力較低的情況下,壓力大小與PPO失活速率有拮抗作用,壓力越大,失活速率越小,當壓力高于300 MPa時,壓力大小對PPO的失活速率有協(xié)同作用,壓力越大,失活速率越大。
在差示掃描量熱過程中,一定的蛋白結構呈現(xiàn)固定的吸收峰,即目標蛋白的特征峰,一旦蛋白發(fā)生部分變性或者完全變性,便伴隨著其在差示掃描量熱圖譜上特征吸收峰出現(xiàn)峰值變小或者變性溫度發(fā)生位移甚至消失的情況[14]。
不同處理壓力下黑果枸杞汁PPO蛋白差示掃描量熱結果如圖2所示。
由圖2可知,空白對照組和200 MPa處理組均能觀察到明顯脫色峰,200 MPa與空白對照組相比,第一個變性吸收峰約降低三分之二,300 MPa處理有吸收峰出現(xiàn),但峰值明顯變小,隨著壓力的升高特征峰出現(xiàn)了明顯降低現(xiàn)象,400 MPa和500 MPa處理組經(jīng)DSC分析未出現(xiàn)明顯脫色峰,說明該條件已經(jīng)使PPO的蛋白構象被破壞,從而發(fā)生變性現(xiàn)象,這與2.1酶活性所得結果基本一致,說明酶活性的大小與蛋白分子熱穩(wěn)定性有關,酶蛋白分子構象變化,導致活性發(fā)生變化。
圖2 不同壓力下黑果枸杞汁PPO差示掃描量熱法分析圖Fig.2 Differential scanning calorimetry of PPO in Lycium ruthenicum Murr.juice with different pressures
熱變性溫度(T)和熱變性焓(ΔH)結果如表 1所示。
表1 不同壓力處理黑果枸杞汁PPO的DSC熱變性溫度和熱變性焓Table 1 DSC denaturation temperature and enthalpy of denaturation of PPO in Lycium ruthenicum Murr.juice treated with different pressures
200MPa高壓處理的熱變性溫度與空白對照沒有顯著差異(p>0.05),但是熱變性焓顯著降低(從200.90 J/g降低到了52.66 J/g)(p<0.05),表明ΔH的變化和處理壓力有關,在超高壓處理條件下,熱穩(wěn)定性與分子結構的變化密切相關,因此,隨著壓力的增加ΔH降低,可能是酶蛋白結構軸向壓力的作用逐漸占主導,并且更多的三螺旋結構開始從末端肽區(qū)域解離。這與NAN等[15]研究的壓力對蛋白結構影響結果不一致,該研究發(fā)現(xiàn)處理壓力低于300 MPa時,ΔH顯著增加,造成這種差異的原因可能是由于不同原料的蛋白結構耐壓性不同。
酶蛋白表面疏水性的變化是酶蛋白結構變化的重要表征,正常情況下,為了保證蛋白質大分子結構的穩(wěn)定性,大多數(shù)的非極性氨基酸會排布在分子內(nèi)部疏水性區(qū)域,形成穩(wěn)定的疏水性內(nèi)核,蛋白質分子表面排布著極性氨基酸,保證親水環(huán)境的穩(wěn)定,并與內(nèi)部環(huán)境進行能量交換和分子輸出[16]。在超高壓作用下,蛋白質空間結構發(fā)生改變,疏水性氨基酸在分子內(nèi)外重新排布,使更多疏水性氨基酸殘基在壓力作用下暴露在蛋白分子表面。
不同高壓處理對黑果枸杞汁PPO蛋白表面疏水性影響如圖3所示。
由圖3可知,處理壓力200 MPa~400 MPa時,隨著壓力的增大,黑果枸杞汁PPO蛋白的表面疏水性在逐漸增強。說明在壓力作用下,PPO蛋白結構發(fā)生變化,原本的疏水性側鏈在天然蛋白狀態(tài)下聚集于蛋白分子內(nèi)部,由于受壓力作用,這些疏水性側鏈重新排布后,便會有疏水性氨基酸殘基移動到蛋白表面,酶蛋白分子之間凝聚性減弱,表面疏水性增加,酶活性降低。
圖3 不同壓力下黑果枸杞汁PPO表面疏水性Fig.3 The surface hydrophobicity of PPO in Lycium ruthenicum Murr.with different pressures
不同壓力處理的黑果枸杞汁PPO的傅立葉紅外光譜圖如圖4所示。
從圖4中可以觀察到PPO蛋白的典型吸收峰。酰胺 A 譜帶(3 400 cm-1~3 440 cm-1)與 N-H 拉伸振動相關,酰胺 I譜帶(1 600 cm-1~1 660 cm-1)是酶蛋白中最強的吸收帶,與肽鍵中羰基的拉伸振動相關,酰胺I譜帶內(nèi)官能團的變化極易影響酶蛋白主鏈結構,因此二級結構的變化也易受其影響。酰胺II譜帶(1 400 cm-1~1 550 cm-1)與N-H彎曲和C-N伸展相關,蛋白質的酰胺II譜帶幾乎不受側鏈振動的影響,而酰胺III譜帶(1 220cm-1~1 300 cm-1)與 C-N 鍵和 N-H 伸展相關,并與酶蛋白三螺旋結構的完整性有關[17]。與未處理的空白對照相比,高壓處理組在酰胺A譜帶略有藍移(從3 426.12 cm-1至3 388.13 cm-1),這表明超高壓處理可能使酶蛋白分子結構中形成更多或者更強的氫鍵結構。其它特征譜帶沒有發(fā)生顯著變化,說明本試驗中的處理壓力對黑果枸杞汁PPO蛋白結構中酰胺II譜帶和酰胺III譜帶沒有造成影響。柳青[18]在研究超高壓對西瓜汁多酚氧化酶二級結構的影響時發(fā)現(xiàn),壓力越大,PPO在傅立葉紅外光譜圖中酰胺I譜帶形成的峰越明顯,經(jīng)過600 MPa處理后,對酶蛋白的二級結構改變最明顯,這與本試驗結果不一致,原因可能是由于原料不同或是原料中的PPO蛋白分子結構不同。
圖4 不同壓力下黑果枸杞汁PPO傅立葉紅外光譜圖Fig.4 Fourier infrared spectrum of PPO in Lycium ruthenicum Murr.juice with different pressures
絕大多數(shù)蛋白質內(nèi)含有內(nèi)源性熒光殘基,當?shù)鞍踪|分子受到超高壓作用后,其分子構象可能發(fā)生變化,這一過程的發(fā)生伴隨著酪氨酸和色氨酸空間位置的變化,表現(xiàn)為酪氨酸熒光性減弱和色氨酸熒光性增強的現(xiàn)象[19]。
當激發(fā)波長為295 nm時,蛋白質中的色氨酸能夠發(fā)射熒光,多酚氧化酶蛋白氨基酸殘基因為受高壓處理而發(fā)生改變,這些氨基酸殘基內(nèi)源熒光強度相應也會受到影響,所以可以通過檢測熒光強度的變化來判斷酶蛋白結構變化[20]。黑果枸杞汁多酚氧化酶經(jīng)過不同高壓處理和對照組的熒光光譜如圖5所示。
圖5 不同壓力下黑果枸杞汁PPO熒光光譜圖Fig.5 The fluorescence spectrum of PPO in Lycium ruthenicum Murr.with different pressures
由圖5可知,未經(jīng)過任何處理的酶蛋白在363 nm處有最大熒光強度,經(jīng)不同壓力處理的PPO蛋白熒光強度均有所降低且都低于空白對照組。同時發(fā)現(xiàn)壓力大小對PPO蛋白熒光光譜的形狀及最大吸收波長影響不顯著,但是對熒光強度影響明顯。LEFEVRE等[21]研究發(fā)現(xiàn)色氨酸殘基在蛋白分子內(nèi)部極性環(huán)境內(nèi),最大吸收波長為360 nm。在壓力為200 MPa和300 MPa條件下,最大吸收波長沒有發(fā)生移動現(xiàn)象,說明這樣的壓力大小不足以使蛋白結構發(fā)生變化,壓力增加到400 MPa和500 MPa,最大吸收波長發(fā)生紅移(從360 nm移至364 nm處),并且隨著壓力的增強,熒光強度呈現(xiàn)減小趨勢,說明在超高壓400MPa和500MPa作用下,色氨酸殘基所處的蛋白結構發(fā)生變化,內(nèi)部非極性環(huán)境的色氨酸殘基在高壓作用下,更多地暴露于蛋白分子外部的極性環(huán)境[22],這表明超高壓處理對黑果枸杞汁中多酚氧化酶蛋白三級結構產(chǎn)生了影響,因此推測酶蛋白構象的變化可能會影響酶活性的變化。
黑果枸杞汁多酚氧化酶經(jīng)過不同高壓處理和對照組的掃描電鏡圖如圖6所示。
圖6 不同壓力下黑果枸杞汁PPO掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron micrograph of PPO in Lycium ruthenicum Murr.with different pressures
將所有處理組在同等倍數(shù)(2 000倍)下放大,未經(jīng)任何處理的PPO蛋白以鏈狀形態(tài)存在,并且相互交聯(lián),束狀空間結構完整,經(jīng)過超高壓處理后,PPO蛋白束狀完整結構消失,包裹在其中的顆粒狀物質裸露在表面,同時伴隨著物質粒徑減小,表面結構已經(jīng)從光滑鏈狀變?yōu)榇植诘膸Э浊蛐晤w粒,較小的顆粒狀物質團聚黏結在未破碎的大顆粒表面。同時觀察發(fā)現(xiàn),隨著壓力的增大,蛋白酶分子間的間隙逐漸增大,因此圖像顯示超高壓處理對黑果枸杞汁多酚氧化酶蛋白的表面形態(tài)有一定影響。
高壓通過改變黑果枸杞汁中PPO蛋白分子的構象來改變酶的活性,400 MPa以上壓力能使其活性顯著降低。其中,高壓處理后酶的二級結構與常壓下酶的二級結構沒有明顯差異,研究發(fā)現(xiàn)導致黑果枸杞汁PPO活性變化的原因是在高壓條件下,PPO蛋白分子三級結構發(fā)生改變,色氨酸殘基所處的微環(huán)境極性增強,并更多暴露于蛋白質分子外部極性環(huán)境,導致表面疏水性的變化,超高壓處理也改變了PPO蛋白表面形態(tài),也就是說,一定的超高壓處理使黑果枸杞汁多酚氧化酶三級結構發(fā)生變化并引起蛋白質變性,導致酶活性的改變,此研究結果為超高壓處理后黑果枸杞汁保存期的延長和品質提升提供一定的理論依據(jù)。