儲(chǔ)小燕 方 洋 黃歐平
宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性健康的常見惡性腫瘤之一,增殖與轉(zhuǎn)移依舊是宮頸癌難以治愈的原因,細(xì)胞增殖與凋亡的動(dòng)態(tài)平衡是維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要方式[1],凋亡抑制使細(xì)胞能夠逃脫死亡并有利于惡性轉(zhuǎn)化[2]。存活蛋白(Survivin,又名BIRC5基因)是1種凋亡抑制蛋白(inhibitor of apptosis protein,IAP),能夠阻斷細(xì)胞凋亡。Survivin是凋亡抑制蛋白家族中最小的1個(gè)成員[3]。目前多項(xiàng)研究表明Survivin基因在正常細(xì)胞與癌細(xì)胞的表達(dá)情況具有顯著的差異性[4]。本研究通過分析臨床宮頸癌患者癌組織及癌旁組織Survivin基因表達(dá)水平,了解該基因在宮頸癌組織是否高表達(dá);通過慢病毒載體基因敲減技術(shù),探明Survivin基因敲減后,Hela細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力及凋亡速率改變情況,從而分析Survivin基因?qū)ela細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制。通過分析Survivin基因?qū)m頸癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制,為臨床早期發(fā)現(xiàn)、家族篩查及基因治療宮頸癌等提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
本研究對(duì)象為2012至2016年期間在江西省腫瘤醫(yī)院婦科治療的宮頸患者的石蠟包埋標(biāo)本共計(jì)30例(其中鱗癌23例,腺體6例,腺鱗癌1例)。臨床分期為Ⅰa~Ⅱa期的早期宮頸癌患者,年齡為28~63歲,中位年齡為(51±3.5)歲,KPS≥90分。宮頸癌患者中行單純性根治性手術(shù)19例,術(shù)后補(bǔ)充放化療6例,單純補(bǔ)充化療5例。臨床資料:23例鱗癌患者病理分級(jí)為G1~G2級(jí)16例,G3級(jí)7例。6例腺癌G1~G2級(jí)4例,G3級(jí)2例。按2018年FIGO臨床分期標(biāo)準(zhǔn)術(shù)后確診鱗癌中Ⅰa~Ⅱa期18例;Ⅲc1期4例,Ⅲc2期1例;腺癌中Ⅰa~Ⅱa期6例;腺鱗癌中Ⅰa~Ⅱa期1例。選取腫瘤及遠(yuǎn)癌組織(離腫瘤邊界5 cm以外,沒有轉(zhuǎn)移的組織定義為遠(yuǎn)癌組織)分別分為A組及B組。每個(gè)病人分別以A1/B1,A2/B2,A3/B3......以此類推。
Hela細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫,Trizol試劑盒購自中國上海普飛公司,RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒與RT-qPCR引物均購自廣州銳博生物科技有限公司,引物序列號(hào)如下:GAPDH (F:TGACTTCAACAGCGACACCCA;R:CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA,121bp),BIRC5(F:ACCGCATCTCTACATTCAAG;R:CAAGTCTGGCTCGTTCTC,113bp)。DNA Marker購于TAKARA公司,Code No.D526A;MTT試劑盒購自Genview公司;Transwell試劑盒購于Corning公司,Cat.No.3422;GIEMSA染色液購于Sigma公司,Cat.No.32884;凋亡試劑盒購于eBioscience公司,Cat.No.88-8007。
1.3.1 RT-qPCR檢測(cè)Survivin基因在癌組織及遠(yuǎn)癌組織中的表達(dá)水平 將組織樣品用無菌器械剪碎并勻漿,使用Trizol法提取組織總RNA,分光光度計(jì)分析測(cè)定所抽提RNA的濃度及質(zhì)量。使用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,使用兩步法進(jìn)行RT-qPCR。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔,以控制實(shí)驗(yàn)誤差,設(shè)GAPDH為內(nèi)參。
1.3.2 慢病毒載體細(xì)胞轉(zhuǎn)染 構(gòu)建survivin基因(別名BIRC5基因)慢病毒載體:Easy-siRNA設(shè)計(jì)目的慢病毒載體(GV248),合成oligo信息,RNAi慢病毒感染Hela細(xì)胞,qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證挑選其最佳敲減靶點(diǎn)慢病毒,慢病毒細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)分組及每組病毒用量情況如表1。分析得出基因敲減效率最佳組別,將培養(yǎng)的HELA細(xì)胞進(jìn)行慢病毒介導(dǎo)的BIRC5敲減載體體外轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染72 h后觀察并拍照。
表1 慢病毒細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)分組及病毒用量
1.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將經(jīng)BIRC5基因敲減慢病毒載體轉(zhuǎn)染的HELA細(xì)胞鋪入96孔細(xì)胞板培養(yǎng),分別于第0 h,24 h,48 h,72 h及96 h終止培養(yǎng),終止培養(yǎng)前4 h加入MTT,4 h后加入DMSO,震蕩25 min后酶標(biāo)儀490/570 nm檢測(cè)OD值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
1.3.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將Transwell小試至于24孔培養(yǎng)板中,在上室中加入100 μl無血清培養(yǎng)基,置于37 ℃培養(yǎng)箱中1 h后,移去上室中培養(yǎng)基并加入100 μl提前制備好的細(xì)胞懸液,并在下室中加入600 μl30%FBS培養(yǎng)基,同時(shí),使用該細(xì)胞懸液鋪一塊MTS 96 孔板,每孔約接種5000 個(gè)細(xì)胞,接種后即測(cè)定OD570,作為轉(zhuǎn)移參照。37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后,完全去除小室內(nèi)培養(yǎng)基,并用棉拭子輕輕移去小室內(nèi)非轉(zhuǎn)移細(xì)胞,滴入Giemsa染色液染色轉(zhuǎn)移細(xì)胞35 min 后,將小室浸泡沖洗數(shù)次,空氣晾干,顯微鏡拍照。于96 孔板空中加入200 μl10%醋酸,揭下底膜,置于醋酸溶解,完全溶解后,吸取100 μl于另一孔中,檢測(cè)OD 570值。
1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡速率 將Hela細(xì)胞鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng),至覆蓋率約為70%是藥物有道凋亡。胰酶消化,收集培養(yǎng)孔中所有細(xì)胞,充分洗滌后加入Annexin V-APC ,于室溫避光染色10~15 min并上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。每組均設(shè)三個(gè)復(fù)孔。
利用統(tǒng)計(jì)軟件graphpad prism 5.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行總體方差分析及組間配對(duì)t檢驗(yàn),實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次及以上。
本研究通過了江西省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)審核,研究所用人體樣本均由患者無償提供,捐獻(xiàn)者對(duì)研究知情并簽署知情同意。
分析臨床30例患者癌組織及遠(yuǎn)癌組織Survivin基因mRNA水平(圖1)可知,共計(jì)73%患者癌組織Survivin基因mRNA水平明顯高于遠(yuǎn)癌組織(P<0.05),其中,15例患者癌組織Survivin基因mRNA水平顯著高于遠(yuǎn)癌組織(P<0.01)。
圖1 Survivin基因在宮頸癌患者癌組織及癌旁組織中的表達(dá)
如圖2所示,Survivin基因在Hela細(xì)胞中明顯表達(dá)。如圖3所示,Hela細(xì)胞中,相對(duì)于NC組,KD1組BIRC5基因敲減效率達(dá)到97.3% 。因此可以設(shè)定KD1組為其最佳敲減靶點(diǎn)慢病毒。
圖3 BIRC5慢病毒載體轉(zhuǎn)染HELA細(xì)胞的表達(dá)情況
HALE細(xì)胞經(jīng)BIRC5慢病毒載體轉(zhuǎn)染后,檢測(cè)96h細(xì)胞吸光度,測(cè)定細(xì)胞增殖速率及細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示,敲減組(KD)增殖曲線較空細(xì)胞對(duì)照組(CON)及陰性對(duì)照組(NC)平緩,且每個(gè)對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)其吸光度都低于其他對(duì)照組(圖4A),表明BIRC5基因敲減后,Hale細(xì)胞增殖速率持續(xù)明顯降低。細(xì)胞凋亡統(tǒng)計(jì)圖(圖4B)結(jié)果顯示,BIRC5基因敲減后,Hale細(xì)胞凋亡率顯著增高。
Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖5)顯示,BIRC5基因敲減后(KD組),HALE細(xì)胞遷移數(shù)量明顯較少,細(xì)胞遷移率明顯低于對(duì)照組。
圖5 BIRC5慢病毒載體轉(zhuǎn)染HALE細(xì)胞遷移能力
宮頸癌是世界第3大婦科惡性腫瘤,近年來發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)。難治性宮頸癌的宮旁浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響宮頸癌的治療效果和預(yù)后。影響轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性宮頸癌的臨床預(yù)后主要因素尚未完全揭示。了解癌癥進(jìn)展相關(guān)的分子機(jī)制對(duì)于尋找更好的難治性宮頸癌的治療至關(guān)重要。survivin已被發(fā)現(xiàn)在腫瘤進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用,研究表明,survivin基因在非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、甲狀腺癌等中高表達(dá),且survivin陽性表達(dá)患者中位生存時(shí)間明顯低于survivin陰性表達(dá)者,并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
GAPDH為內(nèi)參基因
A為MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖;B為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖。CON組為空細(xì)胞組,NC組為陰性對(duì)照組,KD組為敲減組。
并有報(bào)道survivin基因在結(jié)腸息肉、乳腺炎,角化皮炎及子宮肌瘤中等一些癌前損傷及良性腫瘤組織中高表達(dá),說明survivin基因的表達(dá)出現(xiàn)在惡性轉(zhuǎn)化前期,并可能具有促進(jìn)這些損傷惡性轉(zhuǎn)化的作用[5-6]。雖然Survivin抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不清楚,但Survivin與引發(fā)劑或效應(yīng)caspase的直接和間接結(jié)合被認(rèn)為有助于Survivin抑制細(xì)胞凋亡[7]。Caspase-3這種酶能溶解多種蛋白質(zhì),誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,對(duì)細(xì)胞凋亡有著至關(guān)重要的作用[8],推測(cè)Survivin與效應(yīng)caspase-3的直接結(jié)合,但與其他IAP不同,Survivin不具有負(fù)責(zé)caspase-3與Bir結(jié)構(gòu)域?qū)拥慕Y(jié)構(gòu)部分[9],一些研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎X相互作用蛋白(Hbxip)與procaspase-9前體結(jié)合是由Survivin介導(dǎo)的抑制caspase-9的機(jī)制[10],并推測(cè)X-連接的IAP(XIAP)也含有BIR結(jié)構(gòu)域,導(dǎo)致Survivin介導(dǎo)caspase-9的抑制[11]。多項(xiàng)研究亦表明caspase-9作為細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)子,對(duì)于惡性腫瘤也有著重要的作用[12]。然而,survivin基因在宮頸中的作用癌癥還沒有被研究。我們先前的研究首次發(fā)現(xiàn)survivin是宮頸癌發(fā)展的關(guān)鍵因素, 本研究表明,與對(duì)照組織相比,survivin在宮頸癌組織中明顯上調(diào),本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)survivin基因在宮頸癌組中高表達(dá);且行survivin基因敲減后可明顯抑制hela細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力,加速癌細(xì)胞的凋亡。提示survivin 基因可能在調(diào)節(jié)宮頸癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用,對(duì)宮頸癌的臨床診斷和治療具有重要的意義。