非小細(xì)胞肺癌組織中miR-92a、miR-196b表達水平及其臨床意義

彭艷艷 李 聰 張欣宇

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率均居首位的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病主要與嚴(yán)重環(huán)境污染、高齡、吸煙等因素密切相關(guān)[1]。非小細(xì)胞肺癌(non small cell Lung cancer,NSCLC)在肺癌患者中占80%左右[2]，該病早期無特異性表現(xiàn)，臨床上絕大多數(shù)患者確診時大多數(shù)已屬晚期，增加了臨床治療難度。微小核糖核酸是機體代謝分子群中新近發(fā)現(xiàn)的生物活性RNA分子，具有高度保守性、組織特異性等特點，可在不同疾病人群的血清和組織中呈特異性和穩(wěn)定表達，與癌癥患者的診斷、病理分型、預(yù)后等具有重要聯(lián)系[3]。其中微小核糖核酸-92a(microRNA-92a,miR-92a)是1種重要的促癌基因，其在肺癌組織中的高表達與化療敏感性及不良預(yù)后有關(guān)[4]；微小核糖核酸-196b(microRNA-196b,miR-196b)是已被研究證實與結(jié)直腸癌、宮頸癌、胃癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移聯(lián)系緊密的1種促癌基因，可能與NSCLC患者的不良預(yù)后有關(guān)[5]。目前對于miR-92a和miR-196b在NSCLC中表達及預(yù)后的相關(guān)文獻鮮少有見報道，基于此，本研究分析了NSCLC患者癌組織中miR-92a和miR-196b的表達水平及其與預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床NSCLC預(yù)后的評估與改善提供一些理論參考，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性選取2015年6月至2017年12月期間于我院經(jīng)手術(shù)治療的120例NSCLC患者作為研究對象，對其臨床資料和癌組織標(biāo)本進行回顧性分析。120例患者中男性84例，女性36例，年齡35～82歲，平均年齡(60.72±12.46)歲；病理證實腺癌68例，鱗癌48例，其他癌4例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①結(jié)合影像學(xué)檢查、實驗室檢測等，所有患者均符合NSCLC的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，并經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為NSCLC者；②均行手術(shù)切除治療，并保存癌組織標(biāo)本者；③術(shù)前未接受放、化療或分子靶向治療者；④均完成2年隨訪，且具備完整的臨床及隨訪資料者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重肝腎功能障礙、代謝性疾病者；②合并其他惡性腫瘤、嚴(yán)重心腦血管疾病者；③精神異常、認(rèn)知障礙患者。選取NSCLC組織本研究在獲得醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)后實施，研究內(nèi)容設(shè)計符合《世界赫爾辛基宣言》。所有患者癌組織標(biāo)本均在標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)切除后半小時內(nèi)經(jīng)無菌、無核酸酶水沖洗，并放入液氮中，冷凍保存于-80 ℃冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 隨訪方案 隨訪從患者切除手術(shù)后首日開始，采用門診隨訪以及電話隨訪的方式對入組患者進行追蹤，詳細(xì)記錄患者腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移情況，隨訪至術(shù)后2年。

1.2.2 分組方法 以患者隨訪兩年內(nèi)出現(xiàn)的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移情況表示為預(yù)后不良，腫瘤復(fù)發(fā)指影像學(xué)顯示肺部出現(xiàn)新發(fā)病灶；轉(zhuǎn)移指臨床及影像學(xué)檢查顯示有淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移病灶均經(jīng)病理檢查進行診斷確診[7]。將所有入組患者按照隨訪期間有無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移分為兩組：有局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)后不良組和無局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)后良好組。

1.2.3 miR-92a、miR-196b的實時熒光定量PCR檢測 取兩組患者凍存的組織標(biāo)本，于液氮中研磨至粉末狀，參照Trizol試劑(Invitrogen公司)總RNA提取試劑盒的規(guī)定步驟提取總RNA，即刻逆轉(zhuǎn)錄成cDNA用于擴增。選RUN6為內(nèi)參照(Ribo Bio公司)，采用美國ABI公司7500實時熒光定量PCR儀，其中miR-196b引物序列為：上游5'-TAGGTACCACTTTATCCCGTTCACCA-3'；下游5'-ATCTC GAGGCAGGGAGAGAGGAATAA-3'；miR-92a引物序列為：上 游 5'-ACAGGCCGGGACAAGTGCAATA-3'，下游5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3'；U6引物序列為：上游5'-CTC GCTTCGGCAGCACA-3' ；下游 5' -AACGCTTCA GAATTTGCGT-3'。

經(jīng)過35個循環(huán)擴增后，獲得CT值。以2-△CT表 miR-92a和miR-196b的相對表達量，其中△Ct = miR-92a(或miR-196b)平均Ct值-U6平均Ct值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，本研究中涉及的計數(shù)資料用%表示，采用χ2檢驗；計量資料采用“Mean±SD”表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗，多因素分析采用Logistic回歸模型；通過ROC曲線分析miR-92a、miR-196b對NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測價值；對符合正態(tài)分布的兩數(shù)據(jù)采用Pearson進行相關(guān)性分析，均以P<0.05提示為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者預(yù)后情況

在120例NSCLC患者中有62例患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為51.67%，為預(yù)后不良組；58例未出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，為預(yù)后良好組。預(yù)后不良組中出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)35例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例，肺內(nèi)轉(zhuǎn)移9例，腎上腺轉(zhuǎn)移6例。

2.2 兩組患者癌組織中miR-92a、miR-196b表達水平比較及相關(guān)性

經(jīng)實時定量RT-PCR檢測后，預(yù)后不良組癌組織中miR-92a、miR-196b的相對表達量明顯高于預(yù)后良好組(P<0.05)，見表1。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-92a與miR-196b的表達存在明顯的正相關(guān)性(γ=0.479，P=0.005)。

表1 兩組癌組織中miR-92a、miR-196b表達水平比較

2.3 NSCLC患者預(yù)后不良的單因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，兩組在年齡、性別、腫瘤直徑、病理組織學(xué)類型及術(shù)后是否行放化療方面比較無明顯差異(P>0.05)，兩組在腫瘤TNM分期、術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌組織miR-92a表達和癌組織miR-196b表達方面存在明顯差異(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者肺血管炎的單因素分析(例，%)

2.4 影響NSCLC患者預(yù)后不良的多因素Logisitic回歸分析

以NSCLC患者術(shù)后是否出現(xiàn)預(yù)后不良作為因變量，將單因素中差異存在統(tǒng)計學(xué)意義的因素(腫瘤TNM分期、術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌組織miR-92a表達和癌組織miR-196b表達)作為自變量，并進行賦值，腫瘤TNM分期(Ⅰ期～Ⅱ期=0，Ⅲ期～Ⅳ期=1)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無=0，有=1)、癌組織miR-92a表達(<3.0=0，≥3.0=1)、癌組織miR-196b表達(<3.3=0，≥3.3=1)，并將其納入Logisitic回歸模型中，結(jié)果顯示TNM分期為III期～IV期、術(shù)前有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌組織miR-92a≥3.0和癌組織miR-196b≥3.3是NSCLC患者出現(xiàn)預(yù)后不良的獨立預(yù)測因素，見表3。

表3 影響NSCLC患者預(yù)后不良的多因素Logisitic回歸分析

2.5 單項指標(biāo)預(yù)測與聯(lián)合預(yù)測NSCLC患者預(yù)后不良的ROC曲線分析

ROC曲線分析結(jié)果顯示，癌組織中miR-92a、miR-196b表達量單獨預(yù)測NSCLC患者預(yù)后不良的ROC曲線下面積分別為0.718和0.736，均低于兩指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測NSCLC患者預(yù)后不良的ROC曲線下面積0.804(P<0.05)；且癌組織中miR-92a、miR-196b表達量單獨預(yù)測NSCLC患者預(yù)后不良時的截斷值分別為：3.092和3.855，見圖1，表4。

圖1 癌組織中miR-92a、miR-196b表達量單項預(yù)測與聯(lián)合預(yù)測ROC曲線

表4 癌組織中miR-92a、miR-196b表達預(yù)測患者預(yù)后的ROC曲線AUC值

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微小核糖核酸的發(fā)現(xiàn)為NSCLC的診斷與預(yù)后評估提供了新的思路，亦越來越受臨床關(guān)注。微小核糖核酸是具有調(diào)控基因表達功能的生物活性RNA分子，在不同疾病人群的血漿和組織中呈現(xiàn)不同的表達水平，因其的組織特異性和穩(wěn)定性優(yōu)勢，常作為腫瘤疾病診斷和預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物[8-9]。miR-92a、miR-196b均是與NSCLC癌細(xì)胞增殖、分化、凋亡關(guān)系密切的微小核糖核酸分子，參與NSCLC的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移過程。本研究研討miR-92a與miR-196b在NSCLC癌組織中的表達水平及其與預(yù)后的關(guān)系，對于臨床上指導(dǎo)NSCLC患者術(shù)后的早期預(yù)防與控制具有重要作用。

本研究通過半定量RT-PCR法檢測得出預(yù)后不良組癌組織中miR-92a、miR-196b的相對表達量明顯高于預(yù)后良好組，可見miR-92a、miR-196b在NSCLC預(yù)后不良患者癌組織中呈較高表達，與國內(nèi)的研究結(jié)果較為一致[10-11]。本研究中，NSCLC預(yù)后不良的單因素及多因素分析結(jié)果顯示，TNM分期為III期～IV期、術(shù)前有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌組織miR-92a≥3.0和癌組織miR-196b≥3.3是NSCLC患者出現(xiàn)預(yù)后不良的獨立預(yù)測因素?？梢姡琺iR-92a、miR-196b在癌組織中的高表達與NSCLC術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要聯(lián)系。術(shù)前TNM分期為Ⅲ期～Ⅳ期以出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均提示NSCLC患者已處于癌癥的中晚期，病情嚴(yán)重程度較重，腫瘤的惡性程度較高，此類患者經(jīng)手術(shù)治療后往往容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后較差。miR-92a是miR-17-92家族中的重要成員，在前列腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤組織呈異常表達，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。高表達miR-92a對NSCLC患者術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的影響機制可能在于：①靶向與調(diào)控人體抑癌或促癌基因的表達，進一步發(fā)揮促癌作用。國外學(xué)者Tsuch-ida等[12]在研究報告中指出，miR-92a能通過靶向調(diào)控Bcl-2家族因子的表達發(fā)揮促進結(jié)腸癌組織中癌細(xì)胞的凋亡；還有研究表明[13]，過表達的miR-92a可通過對抑癌基因p53家族成員deltanp63beta表達的調(diào)節(jié)，發(fā)揮促進肺癌細(xì)胞增殖并抑制癌細(xì)胞凋亡的作用；②高表達miR-92a可能通過降低化療藥物的敏感性影響NSCLC患者預(yù)后。宋先璐等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a可降低肺癌細(xì)胞對順鉑敏感性而增加其對化療藥物的敏感性，使患者手術(shù)治療后即使進行放化療治療，亦出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后較差。miR-196b是位于人類7號染色體上的微小核糖核酸因子，可通過與不同的靶基因結(jié)合發(fā)揮抑癌或促癌作用[15]。肺癌組織中高表達的miR-196b對患者不良預(yù)后的影響主要認(rèn)為與其對癌細(xì)胞遷移、侵襲促進作用有關(guān)。Liao等[16]在研究高表達miR-196b對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，miR-196b主要通過結(jié)合具有抑制腫瘤作用的轉(zhuǎn)錄因子ETS2而發(fā)揮促進癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。因此，癌組織中miR-92a、miR-196b的較高表達均會增加NSCLC患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，導(dǎo)致預(yù)后不良，進一步可說明兩指標(biāo)之間互為正相關(guān)關(guān)系，這與本研究中miR-92a、miR-196b的相關(guān)性分析結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，癌組織中miR-92a、miR-196b表達量單獨預(yù)測NSCLC患者預(yù)后不良的ROC曲線下面積均低于兩者聯(lián)合預(yù)測的ROC曲線下面積，表明癌組織中miR-92a、miR-196b的聯(lián)合檢測對于NSCLC患者預(yù)后的預(yù)測價值更高，可作為預(yù)測NSCCL患者不良預(yù)后的新指標(biāo)，具有較好的應(yīng)用價值。

綜上所述，miR-92a、miR-196b在NSCLC預(yù)后不良患者癌組織中呈高表達，并互為正相關(guān)性；二者聯(lián)合檢測對于臨床上預(yù)測NSCLC患者預(yù)后具有較好的應(yīng)用價值，可作為預(yù)測NSCCL患者不良預(yù)后的分子標(biāo)志物。因而臨床上可通過聯(lián)合檢測患者癌組織miR-92a、miR-196b水平以篩選手術(shù)后預(yù)后不良的高風(fēng)險人群，并盡早采取控制措施，以改善患者預(yù)后。