254例非小細(xì)胞肺癌患者細(xì)胞學(xué)樣本ALK檢測(cè)結(jié)果分析

張孟玲 程曄 金菊

肺癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的癌癥，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占肺癌的80%～85%以上，而肺腺癌占NSCLC的40%～50%[1]。根據(jù)病理類(lèi)型以及分子表型確定肺癌亞組，是目前肺癌臨床個(gè)體化治療的決定性因素[2]。70%的肺癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，僅能通過(guò)細(xì)針穿刺（fine-needle aspiration,FNA）或胸水等獲取小組織或少量細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而明確病理類(lèi)型和分子表型。間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）為肺癌的驅(qū)動(dòng)基因之一，若腫瘤細(xì)胞中存在A(yíng)LK融合基因表達(dá)，稱(chēng)之為ALK陽(yáng)性NSCLC，其是NSCLC的一個(gè)分子亞型，常見(jiàn)于腺癌，該類(lèi)患者通常可從ALK-酪氨酸激酶抑制劑（ALK-TKI）治療中獲益[3-4]。有研究指出，對(duì)于晚期NSCLC、腺癌或含腺癌成分的其他類(lèi)型肺癌，應(yīng)在診斷的同時(shí)常規(guī)進(jìn)行ALK融合基因和表皮生長(zhǎng)因子受體基因突變檢測(cè)[5]。然而，40%的進(jìn)展期NSCLC常不具備活檢組織，僅可進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷。收集、濃縮細(xì)胞學(xué)樣本制成細(xì)胞蠟塊，能最大限度保留殘留的組織結(jié)構(gòu)。本研究旨在分析檢測(cè)NSCLC患者細(xì)胞學(xué)樣本ALK水平的臨床意義，以便為臨床腫瘤治療提供重要依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 回顧性分析2016年1月至2020年12月在中國(guó)科學(xué)院大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行ALK檢測(cè)的NSCLC患者254例，其中男138例，女116例；年齡37～87（62.5±1.06）歲；細(xì)胞學(xué)樣本類(lèi)型：胸水樣本 144例，F(xiàn)NA樣本110例（包括鎖骨上淋巴結(jié)70例、肺部腫塊21例、經(jīng)支氣管鏡活檢和超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下的經(jīng)支氣管針吸活檢標(biāo)本19例）；上述細(xì)胞學(xué)樣本中同時(shí)具有小活檢組織樣本者43例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.2 方法 胸水樣本經(jīng)離心、沉降后制作液基細(xì)胞學(xué)涂片2張，F(xiàn)NA樣本經(jīng)常規(guī)制作細(xì)胞學(xué)涂片2張；后將每例剩余細(xì)胞學(xué)樣本經(jīng)離心制作成細(xì)胞蠟塊并制作石蠟切片（4 μm）；將小活檢組織樣本常規(guī)制作石蠟切片（4 μm）。細(xì)胞學(xué)涂片予巴氏染色，石蠟切片予常規(guī)HE染色，由高年資病理診斷醫(yī)師進(jìn)行陽(yáng)性評(píng)估并確定為NSCLC后，在自動(dòng)染色機(jī)（瑞士Roche公司）上進(jìn)行ALK（克隆號(hào)：D5F3）免疫組化染色，并采用熒光原位雜交試劑盒（人類(lèi)ALK基因融合檢測(cè)探針，武漢康錄生物技術(shù)股份有限公司）在全自動(dòng)玻片處理系統(tǒng)（型號(hào)：LBP-6612，廣州安必平醫(yī)藥科技公司）中進(jìn)行熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization,FISH）檢測(cè)。

1.3 免疫組化結(jié)果判讀 腫瘤細(xì)胞中可見(jiàn)強(qiáng)的顆粒狀細(xì)胞質(zhì)染色信號(hào)即為ALK陽(yáng)性表達(dá)。應(yīng)排除已知染色偽影，如肺泡巨噬細(xì)胞中較淡的胞質(zhì)染色、神經(jīng)起源細(xì)胞（神經(jīng)與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞）染色、腺上皮染色及浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞染色。正常NSCLC黏膜（包括黏蛋白）與壞死的腫瘤區(qū)域內(nèi)見(jiàn)到的一些背景染色也應(yīng)排除。

2 結(jié)果

254例樣本均順利完成ALK免疫組化染色，其中ALK陽(yáng)性19例，陽(yáng)性檢出率為7.48%。胸水樣本ALK陽(yáng)性檢出率為2.78%（4/144），F(xiàn)NA樣本ALK陽(yáng)性檢出率為13.64%（15/110）。43例同時(shí)有細(xì)胞學(xué)樣本和組織學(xué)樣本的患者中，有5例兩種樣本中免疫組化染色ALK均為陽(yáng)性（圖1）。在細(xì)胞學(xué)樣本中，有2例免疫組化染色ALK陽(yáng)性者同時(shí)行FISH檢測(cè)，結(jié)果顯示ALK基因重排陽(yáng)性（圖2）。7例ALK免疫組化染色陽(yáng)性患者已進(jìn)行ALK-TKI治療，其中接受治療2個(gè)月以上者6例，隨訪(fǎng)1年后，達(dá)到部分緩解4例，完全緩解2例。

圖1 1例非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者細(xì)胞蠟塊和活檢組織樣本間變性淋巴瘤激酶（ALK）檢測(cè)所見(jiàn)[a：細(xì)胞蠟塊HE染色，×10；b：活檢組織HE染色，×10；c：細(xì)胞蠟塊免疫組化染色，×10；d：活檢組織免疫組化染色，×10]

圖2 1例非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者細(xì)胞蠟塊間變性淋巴瘤激酶（ALK）檢測(cè)所見(jiàn)[a：細(xì)胞蠟塊HE染色，×10；b：細(xì)胞蠟塊免疫組化染色，×10；c：細(xì)胞蠟塊熒光原位雜交（FISH），×100]

3 討論

組織病理學(xué)診斷是診斷腫瘤的金標(biāo)準(zhǔn)，但晚期肺癌患者通常無(wú)法獲得手術(shù)標(biāo)本，而細(xì)胞學(xué)樣本則具有來(lái)源豐富，取樣簡(jiǎn)單、快速、方便等特點(diǎn)。細(xì)胞學(xué)樣本經(jīng)離心后制作成細(xì)胞蠟塊石蠟切片，其具有組織學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)，與傳統(tǒng)巴氏涂片聯(lián)合使用，可提高檢測(cè)的靈敏度和特異度，且在行免疫組化和分子檢測(cè)時(shí)，效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)巴氏涂片[6]。在腫瘤細(xì)胞量足夠的情況下制作細(xì)胞蠟塊石蠟切片，可顯示ALK陽(yáng)性肺腺癌的一些形態(tài)學(xué)特征，如篩孔狀結(jié)構(gòu)、明顯的核仁和細(xì)胞外黏液等，結(jié)合臨床特征，對(duì)于篩選潛在A(yíng)LK陽(yáng)性率較高的肺腺癌患者可有所幫助[7]。在實(shí)際工作中，制作細(xì)胞蠟塊前需進(jìn)行樣本評(píng)估，通常漿膜腔積液、FNA及細(xì)胞量豐富的超聲引導(dǎo)下穿刺樣本為較優(yōu)檢測(cè)標(biāo)本。漿膜腔積液樣本送檢量建議在100 ml以上，如若臨床可提取量較少，則應(yīng)全部送檢，重復(fù)送檢可在一定程度上提高陽(yáng)性檢出率。本研究中，254例樣本均完成ALK免疫組化檢測(cè)，且細(xì)胞蠟塊與活檢組織兩種樣本中的檢測(cè)結(jié)果具有一致性。這說(shuō)明采用細(xì)胞學(xué)樣本進(jìn)行ALK檢測(cè)，其結(jié)果真實(shí)可靠，可作為輔助診斷的良好平臺(tái)。目前，細(xì)胞學(xué)樣本ALK免疫組化檢測(cè)結(jié)果的判讀主要參照組織學(xué)樣本ALK檢測(cè)判讀標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)細(xì)胞蠟塊中的成團(tuán)細(xì)胞進(jìn)行判讀，如果成團(tuán)細(xì)胞個(gè)數(shù)≥5即可判讀為陽(yáng)性[8]。

免疫組化、FISH和基于序列特異性的PCR檢測(cè)均可作為ALK陽(yáng)性NSCLC的診斷技術(shù)[9]。在利用細(xì)胞蠟塊檢測(cè)ALK時(shí)，必須含有足夠多的腫瘤細(xì)胞，F(xiàn)ISH檢測(cè)中要求最少含有50個(gè)腫瘤細(xì)胞，免疫組化則沒(méi)有明確定義[10]。本研究中，細(xì)胞蠟塊免疫組化ALK陽(yáng)性患者進(jìn)一步行FISH檢測(cè)，結(jié)果顯示ALK基因重排同樣陽(yáng)性。這也證實(shí)，細(xì)胞蠟塊ALK檢測(cè)不同方法之間的結(jié)果具有一致性，在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)具體情況選擇其中一種檢測(cè)技術(shù)。有研究表明，ALK抑制劑能夠通過(guò)抑制ALK基因相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮抑癌效應(yīng)[11]。本研究中接受ALK-TKI治療者，一定時(shí)間后可達(dá)到完全緩解或部分緩解。在細(xì)胞數(shù)量充足條件下制備細(xì)胞蠟塊進(jìn)行ALK融合基因檢測(cè)，能夠更簡(jiǎn)便、更精準(zhǔn)的診斷肺癌分型，進(jìn)而給予個(gè)性化醫(yī)療。聯(lián)合常規(guī)HE染色、免疫組化和分子檢測(cè)，分析藥物靶標(biāo)、耐藥機(jī)制、免疫檢查點(diǎn)和異質(zhì)性的鑒定，有利于多元化綜合診斷。

綜上所述，細(xì)胞學(xué)樣本可以作為ALK基因突變檢測(cè)的重要樣本來(lái)源，其檢測(cè)結(jié)果可靠，可以作為臨床用藥的重要依據(jù)。