干預(yù)miR-31對哮喘小鼠肺組織TGF-β1/Smad3、TLR2/MyD88/NF-κB信號通路的影響

李玲 李慶玲 劉文春

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種由嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等參與的異質(zhì)性疾病，其主要特征為氣道組織慢性炎癥反應(yīng)，患者主要臨床表現(xiàn)為胸悶、咳嗽、反復(fù)喘息等，對患者身體健康、生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[1-3]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，兒童、老年人群為哮喘主要發(fā)病群體，近年來我國哮喘發(fā)病率一直居高不下，癥狀嚴(yán)重程度隨時間變化而不斷改變，多數(shù)患者清晨、夜晚時間癥狀較為嚴(yán)重[4]。研究發(fā)現(xiàn)，若哮喘癥狀不能及時根治，病情可能會不斷發(fā)展而造成氣道重塑[5]。因此，對哮喘進(jìn)行及時有效的治療具有重要意義。目前尚無一種特效的治療哮喘的藥物。研究發(fā)現(xiàn)，miR-31在哮喘癥狀中表達(dá)異常，其表達(dá)變化與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，與哮喘病情具有一定的相關(guān)性，miR-31對哮喘具有一定的診斷價值[6]。但關(guān)于調(diào)控miR-31表達(dá)對哮喘干預(yù)效果的研究還鮮有報道。本研究通過建立小鼠哮喘模型，探討干預(yù)miR-31對哮喘小鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/果蠅 MAD 基因 3 哺乳動物類似基因（drosophila mad gene 3 mammalian like gene，Smad3）、Toll樣受體 2（toll-like receptor 2，TLR2）/髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/NF-κB 信號通路的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SD健康雄性小鼠40只，年齡7～10（8.5±1.2）周，體重 19～28（23.5±3.6）g，購自洛陽普萬泰生物技術(shù)有限公司。在相對濕度50%～55%、溫度（23.1±1.9）℃的環(huán)境中喂養(yǎng)1周，光照12 h/d。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過。

1.2 主要試劑和儀器 大鼠抗小鼠miR-31抗體（美國Invitrogen公司，批號：C1358）；兔抗小鼠 CD44抗體（美國BD公司，批號：N3667）；小鼠抗兔IFN-γ抗體（丹麥Dako公司，批號：D8569）；小鼠抗大鼠 IL-2、IL-4、IL-22、IL-3 抗體（美國 Selleck 公司，批號：S8753、S2357、S1675、S2565）；大鼠抗小鼠總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）、一氧化氮（nitric oxide，NO）抗體（美國Hyclone 公司，批號：A25291、A23652）；小鼠抗兔 TGF-β1、Smad3抗體（美國Gibco公司，批號：A25291、A23652）；兔抗小鼠TLR2、MyD88抗體（丹麥Dako公司，批號：D9231、D8563）；小鼠抗大鼠 NF-κB p65抗體（美國 Sigma公司，批號：D9423）；卵白蛋白（上海澤葉生物科技有限公司，批號：ZY9000，規(guī)格：1 g）；硫酸鋁鉀（北京百奧萊博科技有限公司，規(guī)格：50 g，批號：Y16210）；miR-31激動劑（agomiR-31）、miR-31拮抗劑（antagomiR-31）（美國Hyclone公司，批號：A32265、A26719）；酶標(biāo)分析儀（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，型號：ML-dr3518）。

1.3 建模及分組干預(yù) 隨機(jī)選取10只小鼠作為正常組，不做任何處理。其余30只小鼠建立哮喘模型：將0.2 mg卵白蛋白、1 mg硫酸鋁鉀溶于2 ml 0.9%氯化鈉注射液制作致敏液，分別于建模第1、7、14天腹腔注射0.2 ml致敏溶液；建模第15天起將小鼠置于3 L密閉玻璃箱，霧化吸入含有1%卵白蛋白的0.9%氯化鈉溶液噴霧，隔日1次，0.5 h/次，持續(xù)干預(yù)1周。建模成功標(biāo)準(zhǔn)：打噴嚏、抓耳撓鼻，喘息，毛發(fā)無光，活動量減少。建模成功后，將30只小鼠分為哮喘組、上調(diào)組和下調(diào)組，每組各10只。上調(diào)組小鼠尾部靜脈注射30 mg/kg agomiR-31干預(yù)，下調(diào)組小鼠尾部靜脈注射30 mg/kg antagomiR-31干預(yù)，正常組、哮喘組小鼠尾部靜脈注射等量0.9%氯化鈉注射液（3 ml）干預(yù)，尾部靜脈注射方法參照余濤等[7]研究中操作方法。

1.4 標(biāo)本采集 干預(yù)結(jié)束后，取各組小鼠腹腔靜脈血3 ml，采血過程參照伍磊等[8]研究中操作方法，2 000 r/min離心15 min后分離上清液，-40℃保存待檢。各組小鼠麻醉后頸椎脫臼法處死，取小鼠肺組織保存待檢。

1.5 各組小鼠肺組織病理學(xué)檢查 采用HE染色。將小鼠肺組織完全浸泡在4%甲醛中，1 d后行常規(guī)石蠟包埋、4 μm連續(xù)切片。將切片烤干后進(jìn)行脫蠟處理，之后順序置入70%、75%、80%、90%、95%濃度的乙醇溶液中各復(fù)水3 min。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，使用鹽酸乙醇分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用95%乙醇進(jìn)行脫水處理后進(jìn)行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡觀察各組小鼠肺組織病理學(xué)改變情況。

1.6 各組小鼠肺組織miR-31、CD44 mRNA表達(dá)水平檢測 采用RT-PCR法。將TRIzol試劑添加至各組肺組織標(biāo)本中靜置溶解，添加三氯甲烷600 μl攪拌，呈乳白色后離心處理提取總RNA，檢測完整性之后合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄處理，使用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2-ΔΔCt方法計(jì)算 miR-31、CD44 mRNA 表達(dá)量，內(nèi)參為U6。U6 上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。miR-31上游引物：5'-AGGCAAGAUGCUGGCAUAGUC-3'，下游引物：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAT-3'。CD44 上游引物：5'-ACCAAGAAGACATCGATGCC-3'，下游引物：5'-TGTCCAGCTAATTCGGATCC-3'。

1.7 各組小鼠血清Th1/Th2趨化因子、炎癥反應(yīng)指標(biāo)水平檢測 將血清標(biāo)本、稀釋液以及檢測卡平衡至24℃，對檢測卡進(jìn)行編號后置于平臺之上，配制標(biāo)準(zhǔn)液并按照1∶10比例對待測標(biāo)本進(jìn)行稀釋，將血清標(biāo)本、稀釋后標(biāo)準(zhǔn)液置于酶標(biāo)板中，使用酶標(biāo)分析儀檢測Th1/Th2趨化因子（IFN-γ、IL-2、IL-4）及炎癥反應(yīng)指標(biāo)（IL-22、IL-3）水平。

1.8 各組小鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)水平檢測 采用免疫透射比濁法。取3個清潔試管，并分別記作空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管，每管中添加350 μl緩沖液。此外，空白管添加蒸餾水 20 μl，標(biāo)準(zhǔn)管添加 TAOC、NO 標(biāo)準(zhǔn)液 20 μl，測定管添加血清標(biāo)本20 μl，震蕩均勻，27℃靜置10 min，使用分光光度計(jì)比色，500 nm波長處以空白管調(diào)零，記錄吸光度值，計(jì)算TAOC、NO水平。

1.9 各組小鼠肺組織 TGF-β1/Smad3、TLR2/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。提取各組小鼠肺組織總蛋白，取蛋白質(zhì)樣本20 μg，SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫封閉1.5 h，1:1 000加入待測蛋白抗體，1:2 000添加內(nèi)參抗體，過夜孵育，次日取出，TBST液清洗后1:5 000添加稀釋后二抗孵育，1 h后使用TBST液洗滌5次，顯色、曝光、成像后檢測條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變情況比較 正常組小鼠氣道上皮完整，細(xì)胞排列整齊且緊密，結(jié)構(gòu)較為清晰，大小均一，無炎性細(xì)胞浸潤情況；哮喘組、上調(diào)組小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重氣道壁增厚情況，細(xì)胞排列雜亂且疏松，炎性細(xì)胞浸潤情況較為嚴(yán)重；下調(diào)組小鼠氣道壁增厚情況明顯減輕，細(xì)胞排列較為整齊，結(jié)構(gòu)較為清晰，炎性細(xì)胞浸潤狀況明顯減輕，見圖1（插頁）。

圖1 各組小鼠肺組織病理學(xué)檢查所見（a：正常組；b：哮喘組；c：上調(diào)組；d：下調(diào)組；HE染色，×400）

2.2 各組小鼠miR-31、CD44 mRNA表達(dá)水平比較 與正常組比較，其他3組小鼠miR-31、CD44 mRNA表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與哮喘組、上調(diào)組比較，下調(diào)組小鼠miR-31、CD44 mRNA表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 各組小鼠miR-31、CD44 mRNA表達(dá)水平比較

2.3 各組小鼠Th1/Th2趨化因子水平比較 與正常組比較，其他3組小鼠IFN-γ水平均降低，IL-2、IL-4水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與哮喘組、上調(diào)組比較，下調(diào)組小鼠IFN-γ水平升高，IL-2、IL-4水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 各組小鼠Th1/Th2趨化因子水平比較（ng/L）

2.4 各組小鼠氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度比較 與正常組比較，其他3組小鼠TAOC、NO、IL-22、IL-3水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與哮喘組、上調(diào)組比較，下調(diào)組小鼠TAOC、NO、IL-22、IL-3水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表3。

表3 各組小鼠氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度比較

2.5 各組小鼠TGF-β1/Smad3信號通路蛋白水平比較 與正常組比較，其他3組小鼠TGF-β1、Smad3水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與哮喘組、上調(diào)組比較，下調(diào)組小鼠TGF-β1、Smad3水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表4。

表4 各組小鼠TGF-β1/Smad3信號通路蛋白水平比較

2.6 各組小鼠TLR2/MyD88/NF-κB信號通路蛋白水平比較 與正常組比較，其他3組小鼠TLR2、MyD88、NF-κB p65水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與哮喘組、上調(diào)組比較，下調(diào)組小鼠TLR2、MyD88、NF-κB p65水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表5。

表5 各組小鼠TLR2/MyD88/NF-κB信號通路蛋白水平比較

3 討論

哮喘是一種臨床常見的、易反復(fù)發(fā)作的呼吸系統(tǒng)疾病[9]，主要臨床表現(xiàn)為胸悶、咳嗽、喘息等。目前哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未明確，過敏、呼吸道感染、運(yùn)動、外界刺激等均為常見的導(dǎo)致哮喘發(fā)病的危險因素[10-11]。臨床常用的治療哮喘的手段為糖皮質(zhì)激素藥物治療，但研究發(fā)現(xiàn)長時間使用糖皮質(zhì)激素治療會出現(xiàn)臨床療效下降、不良反應(yīng)增加、病情復(fù)發(fā)等情況，因此尋找一種安全有效的治療手段成為目前哮喘研究的主要方向[12-13]。

miRNA廣泛存在于多數(shù)生物體之中，miRNA水平變化與微生物感染、炎癥反應(yīng)及機(jī)體免疫狀態(tài)等病理學(xué)改變均有一定的關(guān)系，越來越多的專家學(xué)者致力于miRNA在哮喘發(fā)生、發(fā)展過程中的作用研究[14-15]。有研究表示，miRNA在機(jī)體氣道炎癥反應(yīng)中具有重要作用，miR-31為miRNA家族的重要組成成員，其水平變化對T細(xì)胞活化、機(jī)體炎癥反應(yīng)具有一定的調(diào)控作用[16]。CD44為廣譜的細(xì)胞黏附因子，對炎癥細(xì)胞增殖、聚集具有一定的促進(jìn)作用。有研究表示，CD44水平變化與機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)具有密切聯(lián)系，參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘模型小鼠miR-31、CD44 mRNA水平較高，下調(diào)miR-31的哮喘小鼠CD44 mRNA水平下降，說明下調(diào)miR-31能夠調(diào)控CD44 mRNA表達(dá)水平，從而對哮喘模型小鼠起到一定的治療作用。

目前哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未明確，有研究表示，Th1/Th2趨化因子水平變化與哮喘患者免疫應(yīng)答具有密切聯(lián)系[19-20]。IFN-γ、IL-2、IL-4 為廣譜的 Th1/Th2 趨化因子，本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘模型小鼠IFN-γ水平較低，IL-2、IL-4水平均較高，下調(diào)miR-31的哮喘小鼠IFN-γ水平上升，IL-2、IL-4水平均下降，出現(xiàn)這一研究結(jié)果的原因可能是下調(diào)miR-31能夠調(diào)節(jié)哮喘小鼠Th1/Th2平衡，從而改善免疫功能，減輕哮喘小鼠炎癥反應(yīng)。

大量實(shí)驗(yàn)研究表明，哮喘癥狀的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體氣道氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)具有密切聯(lián)系[21-22]。TAOC、NO是常用的評價機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的指標(biāo)；IL-22、IL-3是常用的評價機(jī)體炎癥反應(yīng)的指標(biāo)，兩者水平變化與機(jī)體炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘模型小鼠TAOC、NO、IL-22、IL-3水平均上升，說明哮喘的發(fā)生、發(fā)展伴隨著氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-31 的哮喘小鼠 TAOC、NO、IL-22、IL-3 水平均下降，說明下調(diào)miR-31能夠減輕哮喘模型小鼠氣道氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度。

氣道重塑為哮喘發(fā)生、發(fā)展過程中的標(biāo)志性病理變化，在哮喘發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。TGF-β1/Smad3信號通路對哮喘氣道重塑具有一定的調(diào)控作用，對哮喘患者病情發(fā)展、肺功能變化具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘模型小鼠TGF-β1、Smad3水平均較高，下調(diào)miR-31的哮喘小鼠TGF-β1、Smad3水平均下降，出現(xiàn)這一研究結(jié)果的原因可能是哮喘小鼠伴有氣道重塑，下調(diào)miR-31能夠?qū)GF-β1/Smad3信號通路蛋白水平造成一定影響，從而起到改善哮喘模型小鼠氣道重塑的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)哮喘癥狀的發(fā)生、發(fā)展伴隨著炎癥反應(yīng)，因此本研究對調(diào)控miR-31水平改善炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制進(jìn)行研究。TLR2/MyD88/NF-κB信號通路蛋白水平與機(jī)體炎癥反應(yīng)具有密切聯(lián)系，參與氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘模型小鼠TLR2、MyD88、NF-κB p65水平均較高，下調(diào)miR-31的哮喘小鼠TLR2、MyD88、NF-κB p65 水平均下調(diào)，出現(xiàn)這一研究結(jié)果的原因可能是下調(diào)miR-31能夠靶向TLR2/MyD88/NF-κB信號通路蛋白水平，從而起到抑制哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，下調(diào)哮喘小鼠miR-31，能夠調(diào)控CD44 mRNA水平，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，減輕哮喘小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度，其作用機(jī)制可能與調(diào)控TGF-β1/Smad3、TLR2/MyD88/NF-κB信號通路蛋白水平有關(guān)。