• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    酸棗仁皂苷A促進(jìn)大鼠股骨骨折愈合的機(jī)制研究

    2021-10-13 11:39:52張兵朱亞輝王孝玉周思私袁發(fā)胡凌云
    浙江醫(yī)學(xué) 2021年18期
    關(guān)鍵詞:血清

    張兵 朱亞輝 王孝玉 周思私 袁發(fā) 胡凌云

    據(jù)統(tǒng)計(jì),骨折后延遲愈合或不愈合的比例約為10%[1-2]。其中骨折斷端處的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是骨折延遲愈合的重要原因之一[3]。酸棗仁皂苷A是從酸棗仁中分離得到的三萜皂苷,具有抗氧化、抗炎癥、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性[4-5]。本研究團(tuán)隊(duì)通過前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),酸棗仁皂苷A可以通過激活生長轉(zhuǎn)化因子/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)通路誘導(dǎo)小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化,形成骨組織,用于治療骨折延遲愈合或不愈合非常有潛力(尚待發(fā)表)。本研究通過構(gòu)建大鼠股骨骨折模型,探討酸棗仁皂苷A是否通過NF-κB信號通路對骨折愈合產(chǎn)生促進(jìn)作用,以期為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康SPF級雄性SD大鼠40只,體重(220±20)g,購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動物有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(川)2020-030,使用許可證號:SYXK(川)2019-189。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南充市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會倫理審批通過[2021年審(032)號]。

    1.2 主要藥物、試劑和儀器 酸棗仁皂苷A(批號:A0274),純度≥98%,購自成都曼思特生物科技有限公司;BMP-2(批號:ab214821)、NF-κB 抑制劑蛋白-α(nuclear factor kappa B inhibitor protein,IκB-α)(批號:ab32518)、NF-κB 抑制蛋白激酶-β(nuclear factor kappa B inhibitor protein kinase,IκK-β)(批 號 :ab178870)、NF-κB(批號:ab76302)和 β-肌動蛋白(β-actin)(批號:ab6276)抗體均購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司;IL-1β(批號:ml003057)、IL-6(批號:ml102828)、TNF-α(批 號 :ml002859)、ALP(批號:ml003360)、骨鈣素(bone gla protein,BGP)(批號:ml002883)ELISA 檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。VTE1600動物數(shù)字化X線影像系統(tǒng)購自南京普愛醫(yī)療設(shè)備股份有限公司;轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)購自德國徠卡公司;TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(jī)、BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀均購自常州市中威電子儀器有限公司;RS36型全自動染色機(jī)購自常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備有限公司;BA210 Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡購自麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;多功能凝膠成像儀、蛋白質(zhì)電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。

    1.3 方法

    1.3.1 動物分組與大鼠骨折模型的構(gòu)建 將40只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、酸棗仁皂苷A低劑量組和酸棗仁皂苷A高劑量組4組,每組10只。大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,腹腔注射戊巴比妥鈉(劑量為30 mg/kg,3 g溶于100 ml 0.9%氯化鈉注射液中,1 ml/kg)進(jìn)行麻醉。除空白組外,其余3組大鼠麻醉后構(gòu)建左側(cè)股骨閉合骨折模型。待翻正反應(yīng)消失后對大鼠進(jìn)行局部脫毛,使用碘伏在大鼠左股骨髁間窩處消毒,將直徑1.0 mm克氏針從骨髁間窩處垂直刺入直達(dá)髓腔,拔出克氏針后于股骨中段處徒手折斷股骨,注意避免骨折移位,然后將克氏針從原穿針點(diǎn)插到斷骨遠(yuǎn)端,剪斷克氏針外露部分,局部消毒后歸籠,蘇醒后正常飲食飲水。

    1.3.2 給藥 造模后第2天開始,各組分別給藥,空白組與模型組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液(20 ml/kg),酸棗仁皂苷A低劑量組腹腔注射10 mg/kg酸棗仁皂苷A(50 mg溶于 100 ml 0.9%氯化鈉注射液,20 ml/kg),酸棗仁皂苷A高劑量組腹腔注射20 mg/kg酸棗仁皂苷A(100 mg溶于100 ml 0.9%氯化鈉注射液,20 ml/kg);1次/d,共28 d。給藥開始后28 d進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測。

    1.3.3 大鼠骨折愈合情況觀察 各組大鼠于給藥開始后14、28 d使用動物數(shù)字化X線影像系統(tǒng)進(jìn)行拍照,觀察各組大鼠骨折愈合情況。

    1.3.4 大鼠骨折股骨骨痂病理學(xué)評分 給藥開始后28 d分離4組大鼠左側(cè)股骨,剔除分離軟組織,暴露骨痂,拔除髓內(nèi)克氏針,取股骨中段處愈合骨痂進(jìn)行石蠟封片(空白組于相同骨折位置取材),HE染色后在顯微鏡下拍照觀察,并進(jìn)行評分:評分根據(jù)損傷處結(jié)締組織、軟骨、骨增生修復(fù)的程度,分為5級,以軟骨及骨組織占所有增生組織(包括結(jié)締組織、軟骨、骨組織)的比例記分,軟骨及骨組織占1/5者記為1分,軟骨及骨組織占2/5者記為2分,依此類推,損傷處完全由軟骨及骨組織取代者(即軟骨及骨組織占5/5)記為5分,分值越高,提示成骨效果越好。

    1.3.5 骨折大鼠血清炎癥因子與骨形成因子檢測 大鼠給藥后28 d使用戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,收集腹主動脈血,分離血清,采用ELISA法檢測血清中炎癥因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)與骨形成因子(ALP和BGP)的含量。

    1.3.6 大鼠骨痂組織中NF-κB信號通路BMP-2、IκB-α、IκK-β、NF-κB蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。收集4組大鼠股骨中段處骨痂組織進(jìn)行蛋白質(zhì)提取并定量(空白組取相同骨折位置處骨組織),以每個樣本20 μg蛋白量依次進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,4℃過夜孵育一抗,一抗?jié)舛葹椋築MP-2(1:800)、IκB-α(1:800)、IκK-β(1:800)、NF-κB(1:500)、β-actin(1:1 000),室溫條件下孵育二抗2 h,漂洗干凈后使用ECL試劑盒顯影,在凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照,以β-actin作為內(nèi)參反映蛋白表達(dá)水平。

    2 結(jié)果

    2.1 酸棗仁皂苷A對大鼠骨折愈合的影響 給藥開始后14 d,模型組骨折斷端邊緣模糊,骨痂量減少,骨密度低;酸棗仁皂苷A低劑量組斷端邊緣可見,骨痂量增多;酸棗仁皂苷A高劑量組斷端邊緣可見但接近消失,骨痂量增多。給藥開始后28 d,模型組大鼠股骨斷端邊緣仍不整齊,骨痂量雖有生成但不足以填滿缺損;酸棗仁皂苷A低、高劑量組斷端邊緣均完全消失,骨痂填滿缺損并與骨皮質(zhì)相互連接,見圖1。

    圖1 4組大鼠股骨動物數(shù)字化X射線影像系統(tǒng)攝片圖(箭頭所示為骨折處)

    2.2 酸棗仁皂苷A對大鼠骨折組織病理學(xué)的影響 給藥開始后28 d,空白組股骨未見骨損傷區(qū)域,成骨結(jié)構(gòu)完好。模型組股骨骨組織之間可見骨大面積損傷區(qū)域,斷端周圍大量新生骨小梁形成,斷端處較多纖維組織增生,見較多成纖維細(xì)胞和胞核呈長梭形的纖維細(xì)胞,未完全將斷端連接,大量炎性細(xì)胞浸潤,包括核呈圓形深染的淋巴細(xì)胞,亦見較多的新生血管形成;酸棗仁皂苷A低劑量組股骨骨組織之間可見骨大面積損傷區(qū)域,斷端周圍較多新生骨小梁形成,斷端處較多纖維組織增生,見成纖維細(xì)胞和纖維細(xì)胞,少量的纖維漿液性物質(zhì)滲出,較多炎性細(xì)胞浸潤,以淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞為主,大量的新生血管形成,輕微出血;酸棗仁皂苷A高劑量組股骨骨組織之間可見損傷區(qū)域,面積較小,斷端周圍較多新生骨小梁形成,斷端處多量纖維組織增生,見成纖維細(xì)胞和纖維細(xì)胞,損傷區(qū)域中央見少量軟骨細(xì)胞形成,少量炎性細(xì)胞浸潤,以淋巴細(xì)胞為主。各組大鼠骨痂病理學(xué)檢查情況見圖2(插頁)。與空白組相比,模型組大鼠骨痂病理學(xué)組織評分明顯降低(P<0.01);與模型組相比,酸棗仁皂苷A高、低劑量組骨痂病理學(xué)組織評分均升高(均 P<0.05),見表1。

    圖2 各組大鼠骨痂病理學(xué)檢查所見(HE染色)

    2.3 酸棗仁皂苷A對骨折大鼠血清中炎癥因子的影響 給藥開始后28 d,與空白組相比,模型組大鼠血清中 IL-1β、IL-6與 TNF-α 含量均升高(均 P<0.01);與模型組相比,酸棗仁皂苷A高劑量組血清中IL-1β、IL-6與TNF-α含量均降低(均P<0.05),但酸棗仁皂苷A低劑量組降低不明顯(均P>0.05),見表2。

    表2 4組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較(ng/L)

    2.4 酸棗仁皂苷A對骨折大鼠血清中骨形成因子的影響 給藥開始后28 d,與空白組相比,模型組大鼠血清中ALP與BGP含量均下降(均P<0.01);與模型組相比,酸棗仁皂苷A高劑量組血清中ALP與BGP含量均升高(均P<0.05),但酸棗仁皂苷A低劑量組升高不明顯(均P>0.05),見表 3。

    表3 4組大鼠血清中ALP與BGP含量比較

    2.5 酸棗仁皂苷A對骨折大鼠骨痂組織中NF-κB信號通路各蛋白的影響 與空白組相比,模型組大鼠骨痂中 BMP-2 蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01),IκB-α、IκK-β、NF-κB蛋白表達(dá)水平均升高(均P<0.01);與模型組相比,酸棗仁皂苷A高、低劑量組骨痂中BMP-2蛋白表達(dá)水平均升高(均P<0.01),酸棗仁皂苷A高劑量組中IκB-α、IκK-β、NF-κB 蛋白表達(dá)水平均降低(均 P<0.05),但酸棗仁皂苷A低劑量組降低不明顯(均P>0.05),見圖 3和表4。

    圖3 4組大鼠骨痂中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、NF-κB抑制劑蛋白 -α(IκB-α)、NF-κB 抑制蛋白激酶 -β(IκK-β)、NF-κB蛋白表達(dá)的電泳圖(β-actin為β-肌動蛋白)

    表4 4組大鼠骨痂組織中 BMP-2、IκB-α、IκK-β、NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較

    3 討論

    近年來,人們?yōu)榱颂剿鞲苯佑行У墓钦壑委煼桨?,對骨折愈合的過程進(jìn)行了廣泛的研究和了解[6]。骨愈合分為直接愈合和間接愈合,前者是指不受外力影響的自然愈合,后者是指通過治療手段達(dá)到的愈合[7]。動物數(shù)字化X線影像系統(tǒng)攝片可以顯示骨折的具體情況,直接反映骨折的程度,同時也是判斷骨折是否愈合的有效方法之一。本實(shí)驗(yàn)通過動物數(shù)字化X線影像系統(tǒng)攝片發(fā)現(xiàn),模型組大鼠骨折后14 d骨折愈合速度緩慢,愈合程度低,28 d后仍未完全愈合。而使用酸棗仁皂苷A后,無論是高劑量組還是低劑量組骨折均快速愈合,28 d后基本愈合,說明酸棗仁皂苷A對股骨骨折具有促進(jìn)愈合的作用。

    骨折愈合大致可分為3個階段:血腫炎癥期、骨痂形成期和骨板形成塑型期,炎癥期會出現(xiàn)疼痛、組織腫脹和功能障礙等癥狀,嚴(yán)重的會產(chǎn)生骨裂,所以消除血腫炎癥、促進(jìn)骨痂形成是促進(jìn)骨折愈合的重要環(huán)節(jié)[8]。炎癥刺激會導(dǎo)致骨組織沉積和纖維細(xì)胞不斷增殖,使組織血管壁增厚,影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞,導(dǎo)致骨折延遲愈合[9]。本實(shí)驗(yàn)通過對新生骨組織進(jìn)行HE染色后發(fā)現(xiàn),模型組股骨斷端處纖維細(xì)胞與炎性細(xì)胞聚集明顯,28 d后情況未好轉(zhuǎn),說明血腫炎癥期仍在持續(xù)。使用酸棗仁皂苷A的兩組大鼠28 d后血腫炎癥期已經(jīng)度過,具體表現(xiàn)為炎性細(xì)胞減少,骨小梁形成增多,并伴有軟骨細(xì)胞形成,血清中IL-1β、IL-6與TNF-α含量均明顯降低,說明酸棗仁皂苷A能促進(jìn)骨痂的形成,加快骨折愈合。骨形成是骨折愈合的最后階段,ALP與BGP都是骨形成的標(biāo)志。隨著成骨細(xì)胞的分化成熟,ALP去磷酸化后,磷酸根能與鈣離子結(jié)合形成磷酸鈣幫助骨形成;BGP是骨基質(zhì)的成分之一,由于骨形成會吸收骨基質(zhì),在這個階段BGP會被釋放到血液中,成為反映骨代謝與骨周轉(zhuǎn)率的指標(biāo)之一[10-11]。BMP在骨折愈合中通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號通路,發(fā)揮刺激組織再生、成骨細(xì)胞分化、基因表達(dá)和細(xì)胞遷移等作用[12]。其中BMP-2會誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞釋放BGP促進(jìn)骨基質(zhì)形成,通過細(xì)胞外鈣的流入和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣的釋放顯著增加了鈣的濃度,促進(jìn)磷酸鈣的形成[13-14],因此,BMP與成骨細(xì)胞的分化和骨形成有密切的關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn),在濃縮間充質(zhì)干細(xì)胞中持續(xù)單獨(dú)或共同傳遞BMP-2可在體外誘導(dǎo)軟骨形成和成骨,并在體內(nèi)誘導(dǎo)顱骨缺損的軟骨再生[15-16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),使用酸棗仁皂苷A后骨痂組織中BMP-2蛋白表達(dá)水平升高,說明成骨細(xì)胞正在快速分化與成熟,同時血清中ALP與BGP含量均明顯升高,說明骨形成正在進(jìn)行,符合成骨的特征,提示酸棗仁皂苷A能促進(jìn)骨折愈合。

    為了探討酸棗仁皂苷A是否通過NF-κB通路降低炎癥反應(yīng)來促進(jìn)骨折愈合,本實(shí)驗(yàn)對骨痂中NF-κB信號通路上的 IκB-α、IκK-β、NF-κB 蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用酸棗仁皂苷A后,IκB-α、IκK-β、NF-κB蛋白表達(dá)水平均明顯降低,說明骨痂組織中NF-κB信號通路被抑制,酸棗仁皂苷A可能通過抑制NF-κB通路來減少血清中IL-1β、IL-6與TNF-α含量,使骨折愈合階段中血腫炎癥期縮短并過渡到骨痂形成期和骨形成期,加速骨折愈合。

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)通過動物數(shù)字化X線影像系統(tǒng)攝片與病理學(xué)檢查明確酸棗仁皂苷A能促進(jìn)骨折愈合;通過檢測血清中IL-1β、IL-6與TNF-α含量與骨痂中IκB-α、IκK-β、NF-κB 蛋白表達(dá)水平說明酸棗仁皂苷 A促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制是抑制炎癥通路,減少炎癥因子的釋放;最后通過檢測血清中ALP與BGP的含量與骨痂中BMP-2的表達(dá)明確酸棗仁皂苷A還具有促進(jìn)骨形成的作用。但由于骨形成階段所涉及的因子與通路網(wǎng)十分復(fù)雜,本實(shí)驗(yàn)只著眼于愈合前期的炎癥階段,對酸棗仁皂苷A誘導(dǎo)骨形成的機(jī)制尚未深入探討,今后將設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步研究。

    猜你喜歡
    血清
    血清免疫球蛋白測定的臨床意義
    中老年保健(2021年3期)2021-08-22 06:50:04
    Meigs綜合征伴血清CA-125水平升高1例
    慢性腎臟病患者血清HIF-1α的表達(dá)及臨床意義
    慢性鼻-鼻竇炎患者血清IgE、IL-5及HMGB1的表達(dá)及其臨床意義
    血清H-FABP、PAF及IMA在冠心病患者中的表達(dá)及其臨床意義
    血清IL-6、APC、CRP在膿毒癥患者中的表達(dá)及臨床意義
    血清HBV前基因組RNA的研究進(jìn)展
    血清馴化在豬藍(lán)耳病防控中的應(yīng)用
    LC-MS/MS法同時測定養(yǎng)血清腦顆粒中14種成分
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:18:47
    血清胱抑素C與小動脈閉塞型卒中的關(guān)系
    亚洲av男天堂| 精品久久久久久久末码| 18禁动态无遮挡网站| 国产在线男女| 久久久久久九九精品二区国产| 中国三级夫妇交换| 丝袜美腿在线中文| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲精品自拍成人| 麻豆国产97在线/欧美| 国产在视频线精品| 又爽又黄a免费视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 成人毛片60女人毛片免费| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 黄色一级大片看看| 久久久久精品久久久久真实原创| 一级爰片在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产乱人视频| 成人漫画全彩无遮挡| 免费黄色在线免费观看| 久久这里有精品视频免费| 亚洲欧美精品自产自拍| 男女边吃奶边做爰视频| 一级黄片播放器| 成人午夜精彩视频在线观看| 一区二区三区精品91| 香蕉精品网在线| 午夜福利视频1000在线观看| 久久ye,这里只有精品| 97热精品久久久久久| 禁无遮挡网站| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 欧美变态另类bdsm刘玥| 五月开心婷婷网| 亚洲精品亚洲一区二区| 成人黄色视频免费在线看| 久久久久久伊人网av| 国产精品一及| 欧美精品国产亚洲| 舔av片在线| 久久精品久久精品一区二区三区| 精品久久久久久久末码| 男人和女人高潮做爰伦理| 熟女人妻精品中文字幕| 久久精品久久久久久久性| 国产爽快片一区二区三区| 观看免费一级毛片| 另类亚洲欧美激情| 黄色配什么色好看| 国产成人精品久久久久久| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 国产男女内射视频| 亚洲国产精品成人综合色| 天天躁日日操中文字幕| 黄片wwwwww| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久久久久久午夜电影| 日韩强制内射视频| 在线观看三级黄色| 国产高清有码在线观看视频| 少妇熟女欧美另类| 联通29元200g的流量卡| av福利片在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲国产av新网站| 91在线精品国自产拍蜜月| 大香蕉97超碰在线| 成人二区视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产毛片在线视频| 亚洲在久久综合| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲精品色激情综合| 丝袜美腿在线中文| 三级国产精品片| 久久这里有精品视频免费| 亚洲欧美精品自产自拍| 99久久精品热视频| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产精品蜜桃在线观看| 中文资源天堂在线| 国产成人精品久久久久久| 91久久精品电影网| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲av免费在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 国产高清有码在线观看视频| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲人成网站在线播| 热re99久久精品国产66热6| 观看免费一级毛片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 岛国毛片在线播放| 全区人妻精品视频| 精品久久久久久久久亚洲| 激情 狠狠 欧美| 一本一本综合久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲人成网站在线播| 夜夜爽夜夜爽视频| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产老妇女一区| 亚洲av国产av综合av卡| 美女国产视频在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 日韩亚洲欧美综合| 成人二区视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲电影在线观看av| 又大又黄又爽视频免费| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 嫩草影院精品99| 一区二区三区四区激情视频| 一本久久精品| 国产91av在线免费观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 高清午夜精品一区二区三区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 精品一区在线观看国产| 久久久色成人| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 蜜臀久久99精品久久宅男| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产亚洲最大av| 日韩 亚洲 欧美在线| 日韩电影二区| av天堂中文字幕网| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 午夜亚洲福利在线播放| 内射极品少妇av片p| 成人免费观看视频高清| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产黄色免费在线视频| 97超视频在线观看视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲av不卡在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 成人美女网站在线观看视频| 国产毛片在线视频| 在线天堂最新版资源| 看非洲黑人一级黄片| 久久久精品欧美日韩精品| 国产成人a∨麻豆精品| 毛片女人毛片| 三级国产精品片| av黄色大香蕉| 日韩欧美一区视频在线观看 | 久久99精品国语久久久| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲精品国产成人久久av| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 永久网站在线| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 老司机影院成人| 国产毛片在线视频| 国产成人91sexporn| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲精品乱久久久久久| 香蕉精品网在线| 日本免费在线观看一区| 日本av手机在线免费观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产黄频视频在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美日韩精品成人综合77777| 最近中文字幕高清免费大全6| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲不卡免费看| 国产精品人妻久久久久久| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| eeuss影院久久| 我要看日韩黄色一级片| 韩国av在线不卡| 免费少妇av软件| 伦精品一区二区三区| 午夜福利高清视频| 日日撸夜夜添| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲国产色片| 最近最新中文字幕大全电影3| 99久久九九国产精品国产免费| 国产精品偷伦视频观看了| 中文精品一卡2卡3卡4更新| av国产久精品久网站免费入址| 午夜爱爱视频在线播放| 在线观看一区二区三区激情| 看免费成人av毛片| 欧美日韩在线观看h| 麻豆国产97在线/欧美| 久久精品久久精品一区二区三区| 人妻系列 视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产欧美亚洲国产| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲色图综合在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 欧美丝袜亚洲另类| 99热全是精品| 欧美潮喷喷水| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲精品久久午夜乱码| 黄色视频在线播放观看不卡| 18+在线观看网站| 久久国产乱子免费精品| 美女内射精品一级片tv| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产男人的电影天堂91| 国产高清国产精品国产三级 | 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产av码专区亚洲av| 久久精品综合一区二区三区| 亚洲av成人精品一区久久| 日本午夜av视频| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲av不卡在线观看| 国产永久视频网站| 91久久精品国产一区二区成人| 精品视频人人做人人爽| av免费在线看不卡| 欧美极品一区二区三区四区| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲综合精品二区| 久久久久久久久久久免费av| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲国产精品999| 五月玫瑰六月丁香| 一级av片app| 亚洲av日韩在线播放| 色播亚洲综合网| 日韩在线高清观看一区二区三区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 中文字幕制服av| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 中文字幕久久专区| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产爽快片一区二区三区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲图色成人| 日韩中字成人| 婷婷色av中文字幕| 日本与韩国留学比较| 亚洲国产精品成人久久小说| 在线天堂最新版资源| 久久97久久精品| 国产成人午夜福利电影在线观看| 精品久久久久久久久av| 黄色欧美视频在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 18禁在线播放成人免费| 看黄色毛片网站| 亚洲av福利一区| 亚洲不卡免费看| 国产真实伦视频高清在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品久久久久久久电影| 国产精品久久久久久av不卡| 97超碰精品成人国产| 精品午夜福利在线看| 亚洲精品国产av蜜桃| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国内精品宾馆在线| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产免费视频播放在线视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲av福利一区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 少妇人妻久久综合中文| 中文字幕亚洲精品专区| 精品久久久久久久久亚洲| 久久久久性生活片| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 日日啪夜夜撸| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲欧美精品自产自拍| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 五月开心婷婷网| 观看美女的网站| 国产在线男女| 一级毛片电影观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 精品午夜福利在线看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 精品一区二区免费观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 青春草国产在线视频| 午夜福利高清视频| 精品人妻熟女av久视频| 男女边摸边吃奶| 下体分泌物呈黄色| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 大香蕉久久网| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 午夜老司机福利剧场| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 色视频在线一区二区三区| 熟女av电影| 精品一区在线观看国产| 在线播放无遮挡| av一本久久久久| 免费少妇av软件| 亚洲精品成人久久久久久| 国产片特级美女逼逼视频| 国产日韩欧美在线精品| 国内精品美女久久久久久| 色吧在线观看| 春色校园在线视频观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 22中文网久久字幕| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 欧美日韩亚洲高清精品| 精品熟女少妇av免费看| 青春草亚洲视频在线观看| 又爽又黄a免费视频| 草草在线视频免费看| 美女视频免费永久观看网站| 婷婷色综合大香蕉| 18禁动态无遮挡网站| 免费观看a级毛片全部| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 街头女战士在线观看网站| 99热这里只有是精品在线观看| 国产黄色免费在线视频| 一级黄片播放器| 亚洲av中文av极速乱| 久久精品夜色国产| 日本与韩国留学比较| 美女高潮的动态| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 日韩一区二区三区影片| 国产一区二区三区av在线| 久久精品久久久久久久性| av播播在线观看一区| 久久久久性生活片| 亚洲熟女精品中文字幕| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国内揄拍国产精品人妻在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 一本色道久久久久久精品综合| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲自偷自拍三级| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产av不卡久久| 联通29元200g的流量卡| 综合色av麻豆| 人妻一区二区av| 午夜亚洲福利在线播放| 成人免费观看视频高清| 一本久久精品| 亚洲精品aⅴ在线观看| 国产精品一区www在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 国产中年淑女户外野战色| 免费高清在线观看视频在线观看| 免费看av在线观看网站| 成人国产麻豆网| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲综合色惰| 男人添女人高潮全过程视频| 综合色av麻豆| 不卡视频在线观看欧美| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲欧美精品自产自拍| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产精品无大码| 特大巨黑吊av在线直播| 精品国产三级普通话版| 男女那种视频在线观看| 国产男女内射视频| 尾随美女入室| 欧美zozozo另类| av福利片在线观看| 久久久久网色| 一区二区三区精品91| 国产一级毛片在线| 亚洲伊人久久精品综合| 99热这里只有是精品50| 成人特级av手机在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲国产精品999| 精品午夜福利在线看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| videossex国产| 国产淫语在线视频| 亚洲国产精品专区欧美| 免费在线观看成人毛片| 亚洲电影在线观看av| av国产精品久久久久影院| 久久久欧美国产精品| www.色视频.com| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产在线男女| 国产高清有码在线观看视频| 国产av码专区亚洲av| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 18+在线观看网站| 午夜亚洲福利在线播放| av天堂中文字幕网| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 91aial.com中文字幕在线观看| 中文字幕制服av| 一级毛片 在线播放| 联通29元200g的流量卡| 国产综合精华液| 国产黄片美女视频| 成年人午夜在线观看视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 欧美成人精品欧美一级黄| 99热网站在线观看| 久久久精品免费免费高清| 国产综合精华液| h日本视频在线播放| 国内精品宾馆在线| 亚洲精品,欧美精品| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 最近最新中文字幕免费大全7| 秋霞伦理黄片| 亚洲色图综合在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲天堂av无毛| 涩涩av久久男人的天堂| av又黄又爽大尺度在线免费看| tube8黄色片| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产成人一区二区在线| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 18禁动态无遮挡网站| 免费电影在线观看免费观看| 国产精品福利在线免费观看| 久久99热6这里只有精品| 亚洲精品成人久久久久久| videos熟女内射| 国国产精品蜜臀av免费| 国产毛片a区久久久久| 久久国内精品自在自线图片| 男人舔奶头视频| 91精品国产九色| www.色视频.com| 午夜免费观看性视频| 午夜免费鲁丝| 免费观看av网站的网址| 国产乱来视频区| 草草在线视频免费看| 男女无遮挡免费网站观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 免费电影在线观看免费观看| 免费av观看视频| 国产成人a∨麻豆精品| 两个人的视频大全免费| 久热久热在线精品观看| xxx大片免费视频| 尾随美女入室| 一级毛片我不卡| 久久精品人妻少妇| 九九爱精品视频在线观看| 国产成人精品婷婷| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 欧美高清性xxxxhd video| 一边亲一边摸免费视频| 久久久久国产网址| 亚洲国产色片| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产精品女同一区二区软件| 日本免费在线观看一区| 色视频www国产| 国产成人免费观看mmmm| 久久亚洲国产成人精品v| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品 | 美女主播在线视频| 日本三级黄在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 黄色欧美视频在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 午夜免费鲁丝| 国产成人a区在线观看| 97超视频在线观看视频| 国产成人精品一,二区| 99热网站在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲av免费在线观看| 亚洲在线观看片| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲国产精品成人综合色| 久久女婷五月综合色啪小说 | 国产乱人偷精品视频| 精品久久久久久久久亚洲| 国产 精品1| 亚洲欧美精品专区久久| 乱系列少妇在线播放| 男女啪啪激烈高潮av片| videossex国产| 亚洲国产高清在线一区二区三| 午夜福利视频1000在线观看| 免费大片黄手机在线观看| 视频中文字幕在线观看| av福利片在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲精品成人av观看孕妇| 神马国产精品三级电影在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 国产极品天堂在线| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲天堂av无毛| 九九爱精品视频在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 免费黄网站久久成人精品| 国内揄拍国产精品人妻在线| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久久久久久久大av| 天堂网av新在线| 大片电影免费在线观看免费| 欧美变态另类bdsm刘玥| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久精品国产亚洲av涩爱| 丝袜美腿在线中文| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 在线看a的网站| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产精品福利在线免费观看| 国产精品久久久久久久久免| 精品久久国产蜜桃| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久精品久久久久久久性| 啦啦啦在线观看免费高清www| 99久久九九国产精品国产免费| 在线免费观看不下载黄p国产| 中国三级夫妇交换| 国产欧美亚洲国产| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲精品一二三| 国产亚洲精品久久久com| 看非洲黑人一级黄片| 另类亚洲欧美激情| 免费观看的影片在线观看| 日韩中字成人| 久久久欧美国产精品| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日韩伦理黄色片| 免费av观看视频| 热99国产精品久久久久久7| 在线观看一区二区三区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 男人和女人高潮做爰伦理| 成人国产麻豆网| 亚洲国产精品999| 精品一区二区三区视频在线| 精品久久久久久电影网| 久久久久久久久久成人| 亚洲成人久久爱视频| 免费电影在线观看免费观看| 看免费成人av毛片| 99热6这里只有精品| 亚洲国产欧美在线一区| 成年版毛片免费区| 国产亚洲一区二区精品| 一边亲一边摸免费视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 综合色av麻豆| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 大话2 男鬼变身卡| 久久精品国产鲁丝片午夜精品|