酸棗仁皂苷A促進(jìn)大鼠股骨骨折愈合的機(jī)制研究

張兵 朱亞輝 王孝玉 周思私 袁發(fā) 胡凌云

據(jù)統(tǒng)計(jì)，骨折后延遲愈合或不愈合的比例約為10%[1-2]。其中骨折斷端處的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是骨折延遲愈合的重要原因之一[3]。酸棗仁皂苷A是從酸棗仁中分離得到的三萜皂苷，具有抗氧化、抗炎癥、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性[4-5]。本研究團(tuán)隊(duì)通過前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酸棗仁皂苷A可以通過激活生長轉(zhuǎn)化因子/骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）通路誘導(dǎo)小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化，形成骨組織，用于治療骨折延遲愈合或不愈合非常有潛力（尚待發(fā)表）。本研究通過構(gòu)建大鼠股骨骨折模型，探討酸棗仁皂苷A是否通過NF-κB信號(hào)通路對(duì)骨折愈合產(chǎn)生促進(jìn)作用，以期為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體重（220±20）g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2020-030，使用許可證號(hào)：SYXK（川）2019-189。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南充市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)倫理審批通過[2021年審（032）號(hào)]。

1.2 主要藥物、試劑和儀器 酸棗仁皂苷A（批號(hào)：A0274），純度≥98%，購自成都曼思特生物科技有限公司；BMP-2（批號(hào)：ab214821）、NF-κB 抑制劑蛋白-α（nuclear factor kappa B inhibitor protein，IκB-α）（批號(hào)：ab32518）、NF-κB 抑制蛋白激酶-β（nuclear factor kappa B inhibitor protein kinase，IκK-β）（批 號(hào) ：ab178870）、NF-κB（批號(hào)：ab76302）和 β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）（批號(hào)：ab6276）抗體均購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；IL-1β（批號(hào)：ml003057）、IL-6（批號(hào)：ml102828）、TNF-α（批 號(hào) ：ml002859）、ALP（批號(hào)：ml003360）、骨鈣素（bone gla protein，BGP）（批號(hào)：ml002883）ELISA 檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。VTE1600動(dòng)物數(shù)字化X線影像系統(tǒng)購自南京普愛醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)購自德國徠卡公司；TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)、BMJ-Ⅲ型包埋機(jī)、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀均購自常州市中威電子儀器有限公司；RS36型全自動(dòng)染色機(jī)購自常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備有限公司；BA210 Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡購自麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；多功能凝膠成像儀、蛋白質(zhì)電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組與大鼠骨折模型的構(gòu)建 將40只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、酸棗仁皂苷A低劑量組和酸棗仁皂苷A高劑量組4組，每組10只。大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，腹腔注射戊巴比妥鈉（劑量為30 mg/kg，3 g溶于100 ml 0.9%氯化鈉注射液中，1 ml/kg）進(jìn)行麻醉。除空白組外，其余3組大鼠麻醉后構(gòu)建左側(cè)股骨閉合骨折模型。待翻正反應(yīng)消失后對(duì)大鼠進(jìn)行局部脫毛，使用碘伏在大鼠左股骨髁間窩處消毒，將直徑1.0 mm克氏針從骨髁間窩處垂直刺入直達(dá)髓腔，拔出克氏針后于股骨中段處徒手折斷股骨，注意避免骨折移位，然后將克氏針從原穿針點(diǎn)插到斷骨遠(yuǎn)端，剪斷克氏針外露部分，局部消毒后歸籠，蘇醒后正常飲食飲水。

1.3.2 給藥 造模后第2天開始，各組分別給藥，空白組與模型組大鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液（20 ml/kg），酸棗仁皂苷A低劑量組腹腔注射10 mg/kg酸棗仁皂苷A（50 mg溶于 100 ml 0.9%氯化鈉注射液，20 ml/kg），酸棗仁皂苷A高劑量組腹腔注射20 mg/kg酸棗仁皂苷A（100 mg溶于100 ml 0.9%氯化鈉注射液，20 ml/kg）；1次/d，共28 d。給藥開始后28 d進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)檢測。

1.3.3 大鼠骨折愈合情況觀察 各組大鼠于給藥開始后14、28 d使用動(dòng)物數(shù)字化X線影像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，觀察各組大鼠骨折愈合情況。

1.3.4 大鼠骨折股骨骨痂病理學(xué)評(píng)分 給藥開始后28 d分離4組大鼠左側(cè)股骨，剔除分離軟組織，暴露骨痂，拔除髓內(nèi)克氏針，取股骨中段處愈合骨痂進(jìn)行石蠟封片（空白組于相同骨折位置取材），HE染色后在顯微鏡下拍照觀察，并進(jìn)行評(píng)分：評(píng)分根據(jù)損傷處結(jié)締組織、軟骨、骨增生修復(fù)的程度，分為5級(jí)，以軟骨及骨組織占所有增生組織（包括結(jié)締組織、軟骨、骨組織）的比例記分，軟骨及骨組織占1/5者記為1分，軟骨及骨組織占2/5者記為2分，依此類推，損傷處完全由軟骨及骨組織取代者（即軟骨及骨組織占5/5）記為5分，分值越高，提示成骨效果越好。

1.3.5 骨折大鼠血清炎癥因子與骨形成因子檢測 大鼠給藥后28 d使用戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，收集腹主動(dòng)脈血，分離血清，采用ELISA法檢測血清中炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）與骨形成因子（ALP和BGP）的含量。

1.3.6 大鼠骨痂組織中NF-κB信號(hào)通路BMP-2、IκB-α、IκK-β、NF-κB蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。收集4組大鼠股骨中段處骨痂組織進(jìn)行蛋白質(zhì)提取并定量（空白組取相同骨折位置處骨組織），以每個(gè)樣本20 μg蛋白量依次進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，4℃過夜孵育一抗，一抗?jié)舛葹椋築MP-2（1:800）、IκB-α（1:800）、IκK-β（1:800）、NF-κB（1:500）、β-actin（1:1 000），室溫條件下孵育二抗2 h，漂洗干凈后使用ECL試劑盒顯影，在凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，以β-actin作為內(nèi)參反映蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 酸棗仁皂苷A對(duì)大鼠骨折愈合的影響 給藥開始后14 d，模型組骨折斷端邊緣模糊，骨痂量減少，骨密度低；酸棗仁皂苷A低劑量組斷端邊緣可見，骨痂量增多；酸棗仁皂苷A高劑量組斷端邊緣可見但接近消失，骨痂量增多。給藥開始后28 d，模型組大鼠股骨斷端邊緣仍不整齊，骨痂量雖有生成但不足以填滿缺損；酸棗仁皂苷A低、高劑量組斷端邊緣均完全消失，骨痂填滿缺損并與骨皮質(zhì)相互連接，見圖1。

圖1 4組大鼠股骨動(dòng)物數(shù)字化X射線影像系統(tǒng)攝片圖（箭頭所示為骨折處）

2.2 酸棗仁皂苷A對(duì)大鼠骨折組織病理學(xué)的影響 給藥開始后28 d，空白組股骨未見骨損傷區(qū)域，成骨結(jié)構(gòu)完好。模型組股骨骨組織之間可見骨大面積損傷區(qū)域，斷端周圍大量新生骨小梁形成，斷端處較多纖維組織增生，見較多成纖維細(xì)胞和胞核呈長梭形的纖維細(xì)胞，未完全將斷端連接，大量炎性細(xì)胞浸潤，包括核呈圓形深染的淋巴細(xì)胞，亦見較多的新生血管形成；酸棗仁皂苷A低劑量組股骨骨組織之間可見骨大面積損傷區(qū)域，斷端周圍較多新生骨小梁形成，斷端處較多纖維組織增生，見成纖維細(xì)胞和纖維細(xì)胞，少量的纖維漿液性物質(zhì)滲出，較多炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞為主，大量的新生血管形成，輕微出血；酸棗仁皂苷A高劑量組股骨骨組織之間可見損傷區(qū)域，面積較小，斷端周圍較多新生骨小梁形成，斷端處多量纖維組織增生，見成纖維細(xì)胞和纖維細(xì)胞，損傷區(qū)域中央見少量軟骨細(xì)胞形成，少量炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主。各組大鼠骨痂病理學(xué)檢查情況見圖2（插頁）。與空白組相比，模型組大鼠骨痂病理學(xué)組織評(píng)分明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，酸棗仁皂苷A高、低劑量組骨痂病理學(xué)組織評(píng)分均升高（均 P＜0.05），見表1。

圖2 各組大鼠骨痂病理學(xué)檢查所見（HE染色）

2.3 酸棗仁皂苷A對(duì)骨折大鼠血清中炎癥因子的影響 給藥開始后28 d，與空白組相比，模型組大鼠血清中 IL-1β、IL-6與 TNF-α 含量均升高（均 P＜0.01）；與模型組相比，酸棗仁皂苷A高劑量組血清中IL-1β、IL-6與TNF-α含量均降低（均P＜0.05），但酸棗仁皂苷A低劑量組降低不明顯（均P＞0.05），見表2。

表2 4組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較（ng/L）

2.4 酸棗仁皂苷A對(duì)骨折大鼠血清中骨形成因子的影響 給藥開始后28 d，與空白組相比，模型組大鼠血清中ALP與BGP含量均下降（均P＜0.01）；與模型組相比，酸棗仁皂苷A高劑量組血清中ALP與BGP含量均升高（均P＜0.05），但酸棗仁皂苷A低劑量組升高不明顯（均P＞0.05），見表 3。

表3 4組大鼠血清中ALP與BGP含量比較

2.5 酸棗仁皂苷A對(duì)骨折大鼠骨痂組織中NF-κB信號(hào)通路各蛋白的影響 與空白組相比，模型組大鼠骨痂中 BMP-2 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.01），IκB-α、IκK-β、NF-κB蛋白表達(dá)水平均升高（均P＜0.01）；與模型組相比，酸棗仁皂苷A高、低劑量組骨痂中BMP-2蛋白表達(dá)水平均升高（均P＜0.01），酸棗仁皂苷A高劑量組中IκB-α、IκK-β、NF-κB 蛋白表達(dá)水平均降低（均 P＜0.05），但酸棗仁皂苷A低劑量組降低不明顯（均P＞0.05），見圖 3和表4。

圖3 4組大鼠骨痂中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）、NF-κB抑制劑蛋白 -α（IκB-α）、NF-κB 抑制蛋白激酶 -β（IκK-β）、NF-κB蛋白表達(dá)的電泳圖（β-actin為β-肌動(dòng)蛋白）

表4 4組大鼠骨痂組織中 BMP-2、IκB-α、IκK-β、NF-κB 蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

近年來，人們?yōu)榱颂剿鞲苯佑行У墓钦壑委煼桨?，?duì)骨折愈合的過程進(jìn)行了廣泛的研究和了解[6]。骨愈合分為直接愈合和間接愈合，前者是指不受外力影響的自然愈合，后者是指通過治療手段達(dá)到的愈合[7]。動(dòng)物數(shù)字化X線影像系統(tǒng)攝片可以顯示骨折的具體情況，直接反映骨折的程度，同時(shí)也是判斷骨折是否愈合的有效方法之一。本實(shí)驗(yàn)通過動(dòng)物數(shù)字化X線影像系統(tǒng)攝片發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠骨折后14 d骨折愈合速度緩慢，愈合程度低，28 d后仍未完全愈合。而使用酸棗仁皂苷A后，無論是高劑量組還是低劑量組骨折均快速愈合，28 d后基本愈合，說明酸棗仁皂苷A對(duì)股骨骨折具有促進(jìn)愈合的作用。

骨折愈合大致可分為3個(gè)階段：血腫炎癥期、骨痂形成期和骨板形成塑型期，炎癥期會(huì)出現(xiàn)疼痛、組織腫脹和功能障礙等癥狀，嚴(yán)重的會(huì)產(chǎn)生骨裂，所以消除血腫炎癥、促進(jìn)骨痂形成是促進(jìn)骨折愈合的重要環(huán)節(jié)[8]。炎癥刺激會(huì)導(dǎo)致骨組織沉積和纖維細(xì)胞不斷增殖，使組織血管壁增厚，影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，導(dǎo)致骨折延遲愈合[9]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)新生骨組織進(jìn)行HE染色后發(fā)現(xiàn)，模型組股骨斷端處纖維細(xì)胞與炎性細(xì)胞聚集明顯，28 d后情況未好轉(zhuǎn)，說明血腫炎癥期仍在持續(xù)。使用酸棗仁皂苷A的兩組大鼠28 d后血腫炎癥期已經(jīng)度過，具體表現(xiàn)為炎性細(xì)胞減少，骨小梁形成增多，并伴有軟骨細(xì)胞形成，血清中IL-1β、IL-6與TNF-α含量均明顯降低，說明酸棗仁皂苷A能促進(jìn)骨痂的形成，加快骨折愈合。骨形成是骨折愈合的最后階段，ALP與BGP都是骨形成的標(biāo)志。隨著成骨細(xì)胞的分化成熟，ALP去磷酸化后，磷酸根能與鈣離子結(jié)合形成磷酸鈣幫助骨形成；BGP是骨基質(zhì)的成分之一，由于骨形成會(huì)吸收骨基質(zhì)，在這個(gè)階段BGP會(huì)被釋放到血液中，成為反映骨代謝與骨周轉(zhuǎn)率的指標(biāo)之一[10-11]。BMP在骨折愈合中通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，發(fā)揮刺激組織再生、成骨細(xì)胞分化、基因表達(dá)和細(xì)胞遷移等作用[12]。其中BMP-2會(huì)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞釋放BGP促進(jìn)骨基質(zhì)形成，通過細(xì)胞外鈣的流入和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣的釋放顯著增加了鈣的濃度，促進(jìn)磷酸鈣的形成[13-14]，因此，BMP與成骨細(xì)胞的分化和骨形成有密切的關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，在濃縮間充質(zhì)干細(xì)胞中持續(xù)單獨(dú)或共同傳遞BMP-2可在體外誘導(dǎo)軟骨形成和成骨，并在體內(nèi)誘導(dǎo)顱骨缺損的軟骨再生[15-16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用酸棗仁皂苷A后骨痂組織中BMP-2蛋白表達(dá)水平升高，說明成骨細(xì)胞正在快速分化與成熟，同時(shí)血清中ALP與BGP含量均明顯升高，說明骨形成正在進(jìn)行，符合成骨的特征，提示酸棗仁皂苷A能促進(jìn)骨折愈合。

為了探討酸棗仁皂苷A是否通過NF-κB通路降低炎癥反應(yīng)來促進(jìn)骨折愈合，本實(shí)驗(yàn)對(duì)骨痂中NF-κB信號(hào)通路上的 IκB-α、IκK-β、NF-κB 蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用酸棗仁皂苷A后，IκB-α、IκK-β、NF-κB蛋白表達(dá)水平均明顯降低，說明骨痂組織中NF-κB信號(hào)通路被抑制，酸棗仁皂苷A可能通過抑制NF-κB通路來減少血清中IL-1β、IL-6與TNF-α含量，使骨折愈合階段中血腫炎癥期縮短并過渡到骨痂形成期和骨形成期，加速骨折愈合。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過動(dòng)物數(shù)字化X線影像系統(tǒng)攝片與病理學(xué)檢查明確酸棗仁皂苷A能促進(jìn)骨折愈合；通過檢測血清中IL-1β、IL-6與TNF-α含量與骨痂中IκB-α、IκK-β、NF-κB 蛋白表達(dá)水平說明酸棗仁皂苷 A促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制是抑制炎癥通路，減少炎癥因子的釋放；最后通過檢測血清中ALP與BGP的含量與骨痂中BMP-2的表達(dá)明確酸棗仁皂苷A還具有促進(jìn)骨形成的作用。但由于骨形成階段所涉及的因子與通路網(wǎng)十分復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)只著眼于愈合前期的炎癥階段，對(duì)酸棗仁皂苷A誘導(dǎo)骨形成的機(jī)制尚未深入探討，今后將設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步研究。