胃富于淋巴間質(zhì)的癌的臨床病理特征及EB病毒、錯(cuò)配修復(fù)蛋白和HER-2表達(dá)情況

謝樂斯 周虹 趙盼 王煒 項(xiàng)晶晶

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥之一，其發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中分別位于第5位和第3位，雖然近年來有所下降，但總體5年生存率仍在30%以下[1-2]。依據(jù)顯微鏡下組織形態(tài)的不同將胃癌分成多種組織學(xué)類型，其中胃富于淋巴間質(zhì)的癌（gastric carcinoma with lymphoid stroma,GCLS）是一種少見的特殊類型胃癌。隨著精準(zhǔn)治療需求的日益提高，僅對(duì)胃癌進(jìn)行組織學(xué)分型已經(jīng)不能滿足臨床診斷和治療需求。胃癌是一組異質(zhì)性腫瘤，根據(jù)癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas,TCGA）可將胃癌分為4種分子亞型：EB病毒陽性型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability,MSI）型（錯(cuò)配修復(fù)缺陷型）、染色體不穩(wěn)定型和基因組穩(wěn)定型[3]。多數(shù)研究認(rèn)為GCLS與EV病毒感染或MSI相關(guān)，通常不伴有人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2,HER-2）過表達(dá)[4-7]。國內(nèi)報(bào)道的 GCLS多與EB病毒感染相關(guān)[8-9]，但對(duì)錯(cuò)配修復(fù)蛋白和HER-2表達(dá)情況的研究很少。本研究總結(jié)8例GCLS的臨床病理特征，并對(duì)EB病毒、錯(cuò)配修復(fù)蛋白和HER-2表達(dá)情況進(jìn)行研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2013年3月至2021年3月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市第一人民醫(yī)院收治的8例GCLS患者的臨床資料。診斷均由兩位有經(jīng)驗(yàn)的高年資病理醫(yī)生復(fù)核，并排除鼻咽癌轉(zhuǎn)移可能，出院后進(jìn)行電話隨訪。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 免疫組化染色 8例標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡觀察。選取有代表性組織蠟塊用于免疫組化染色，切片厚度4 μm，使用瑞士羅氏公司自動(dòng)免疫組化儀對(duì)HER-2（克隆號(hào)4B5，瑞士羅氏公司）進(jìn)行免疫組化染色，使用丹麥Dako公司Link48自動(dòng)免疫組化儀對(duì)錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1、PMS、MSH2和MSH6（丹麥Dako公司）進(jìn)行免疫組化染色，同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照。DAB染色、蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，由兩位有經(jīng)驗(yàn)的高年資病理醫(yī)生閱片判讀。

1.3 EB病毒編碼的小RNA（Epstein-Barr virus encoded small RNA，EBER）檢測 采用原位雜交法。EBER探針購自德國Leica公司。8例標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片厚度4 μm，烤片、脫蠟后上機(jī)，采用德國Leica公司Bond Ⅲ免疫組化檢測平臺(tái)及自動(dòng)化EBER制片程序完成制片。同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照。

1.4 HER-2熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測 對(duì)1例HER-2判讀為2+的患者進(jìn)行HER-2 FISH檢測。石蠟包埋組織塊切片厚度4 μm，HER-2探針購自美國Abbott公司，F(xiàn)ISH制片程序詳見試劑盒說明書。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)依照《胃癌HER-2檢測指南（2016 版）》[10]。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征分析 除1例為殘胃吻合口癌外，其余7例腫瘤均位于近端胃。其中男7例，女1例；年齡46～81歲，中位年齡69歲。臨床表現(xiàn)沒有特殊性，胃鏡下主要表現(xiàn)為潰瘍，有2例表現(xiàn)為黏膜下隆起性病變。8例患者臨床特征見表1。

表1 8例患者臨床特征分析

2.2 病理特征分析 8例患者病理特征見表2。

表2 8例患者病理特征分析

2.2.1 鏡下形態(tài) 8例患者鏡下病理形態(tài)相似，在HE切片上多數(shù)患者邊界清楚并呈膨脹性生長，個(gè)別患者彌漫浸潤生長。腫瘤細(xì)胞呈片狀、巢團(tuán)狀、梁索狀或單個(gè)分布于密集增生的淋巴背景上，瘤細(xì)胞大而界限不清，呈合體狀，核空泡狀，核仁明顯，胞質(zhì)紅染，個(gè)別患者瘤細(xì)胞呈低黏附性單個(gè)散在伴偏位核。腫瘤背景為多少不等腫瘤相關(guān)淋巴組織增生，以淋巴細(xì)胞增生為主，部分有漿細(xì)胞浸潤，少數(shù)患者伴有少量中性粒細(xì)胞浸潤。淋巴組織與腫瘤細(xì)胞關(guān)系密切，增生淋巴細(xì)胞位于反應(yīng)性腫瘤間質(zhì)內(nèi)、圍繞腫瘤細(xì)胞巢周圍、分布于腫瘤細(xì)胞巢之間或浸潤腫瘤細(xì)胞巢內(nèi)，個(gè)別患者形成明顯的淋巴濾泡。有2例同時(shí)伴有腺體分化成分，其中1例中分化腺癌位于腔面而GCLS位于深部（圖1），另1例腺體成分混雜生長。8例患者背景黏膜均未見幽門螺桿菌（HP）感染。

2.2.2 EBER檢測結(jié)果 EBER原位雜交陽性定位于細(xì)胞核，以≥25個(gè)陽性細(xì)胞/中倍視野為判讀標(biāo)準(zhǔn)。8例患者中有6例EBER彌漫陽性，陽性均定位于腫瘤細(xì)胞核，背景淋巴組織無EBER陽性，陽性患者和陰性患者形態(tài)上沒有明顯差異，不過2例伴有普通腺癌的患者EBER在腺癌區(qū)域也陽性（圖1）。

圖1 例1 EB病毒編碼的小RNA（EBER）陽性胃富于淋巴間質(zhì)的癌（GCLS）患者病理檢查所見（a：超低倍鏡顯示腫瘤有兩種形態(tài)，左上黏膜內(nèi)有瘤細(xì)胞顯示腺性分化，成腺管、篩狀、條索形態(tài)，右下深部瘤細(xì)胞成大小不等巢團(tuán)狀、合體狀形態(tài)，兩種成分周圍都有大量淋巴細(xì)胞浸潤；HE染色，×10；b：低倍鏡下兩種形態(tài)的瘤細(xì)胞之間沒有截然分界，腺性分化越往腔面越明顯，深部腺體形成減少、消失，瘤細(xì)胞呈成條索、團(tuán)巢狀生長；HE染色，×40；c：EBER原位雜交，瘤細(xì)胞核EBER彌漫強(qiáng)陽性，×100；d：錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1免疫組化染色，瘤細(xì)胞核MLH1染色陽性，×200）

2.2.3 錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)情況 錯(cuò)配修復(fù)蛋白陽性定位于腫瘤細(xì)胞核，周圍正常上皮細(xì)胞和浸潤淋巴細(xì)胞均為正常陽性內(nèi)對(duì)照，只要有腫瘤細(xì)胞核出現(xiàn)著色即判讀為表達(dá)未缺失，所有腫瘤細(xì)胞核完全不著色判讀為表達(dá)缺失。8例中有2例（25.0%）錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失，其中MLH1和PMS2聯(lián)合缺失1例（圖2），PMS2單獨(dú)缺失1例，未見MSH2或MSH6缺失，該2例患者均為EBER陰性。錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失患者與未缺失患者在形態(tài)上未見明顯差異。

圖2 例2錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失胃富于淋巴間質(zhì)的癌（GCLS）患者病理檢查所見[a：鏡下腫瘤細(xì)胞成大片狀、合體狀生長，細(xì)胞巢周邊淋巴細(xì)胞套狀增生，腫瘤內(nèi)散在淋巴細(xì)胞浸潤；HE染色，×40；b：EB病毒編碼的小RNA（EBER）原位雜交，瘤細(xì)胞核EBER陰性，×40；c：瘤細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1免疫組化染色，瘤細(xì)胞核MLH1染色陰性，表達(dá)缺失，腫瘤內(nèi)浸潤淋巴細(xì)胞MLH1陽性為正常內(nèi)對(duì)照；×100；d：瘤細(xì)胞錯(cuò)配修復(fù)蛋白PMS2免疫組化染色，瘤細(xì)胞核PMS2染色陰性，表達(dá)缺失，腫瘤內(nèi)浸潤淋巴細(xì)胞PMS2陽性為正常內(nèi)對(duì)照；×100]

2.2.4 HER-2表達(dá)情況 8例中僅有1例HER-2陽性，免疫組化染色2+，且HER-2 FISH檢測陽性（圖3，見插頁）。此例患者同時(shí)EBER陽性且錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)未缺失。

圖3 例4人表皮生長因子受體-2（HER-2）陽性胃富于淋巴間質(zhì)的癌（GCLS）患者病理檢查所見[a：鏡下圖右側(cè)近腔面的瘤細(xì)胞成梁索狀、小巢狀生長，左側(cè)深部的瘤細(xì)胞呈合體狀、大巢團(tuán)狀生長，間質(zhì)內(nèi)有大量淋巴組織增生；HE染色，×40；b：EB病毒編碼的小RNA（EBER）原位雜交，瘤細(xì)胞核EBER彌漫強(qiáng)陽性，×40；c：HER-2免疫組化染色，部分腫瘤細(xì)胞膜中到強(qiáng)陽性染色，腫瘤細(xì)胞存在異質(zhì)性，可見陽性和陰性兩群細(xì)胞，左側(cè)瘤細(xì)胞HER-2染色2+，右側(cè)瘤細(xì)胞HER-2染色1+或0，×200；d：HER-2熒光原位雜交（FISH）檢測，紅色信號(hào)為HER-2陽性信號(hào)，綠色信號(hào)為17號(hào)染色體著絲粒（CEP17）陽性信號(hào)；瘤細(xì)胞具有異質(zhì)性，HER-2陽性組腫瘤細(xì)胞HER-2陽性信號(hào)數(shù)15.6，CEP17陽性信號(hào)數(shù)2.4，HER-2/CEP17=6.5，約占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的50%；HER-2陰性組腫瘤細(xì)胞HER-2陽性信號(hào)數(shù)3.1，CEP17陽性信號(hào)數(shù)2.5，HER-2/CEP17=1.2，約占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的50%，判讀為HER-2 FISH陽性]

3 討論

GCLS是一種少見的胃腺癌類型，又稱為淋巴上皮瘤樣癌或髓樣癌。其鏡下組織學(xué)表現(xiàn)類似鼻咽部未分化非角化性癌，主要形態(tài)特征為在豐富的淋巴間質(zhì)背景上分布多少不等瘤細(xì)胞巢團(tuán)，瘤細(xì)胞呈大空泡狀，多數(shù)患者瘤細(xì)胞呈合體狀生長。GCLS絕大多數(shù)為單純的經(jīng)典GCLS形態(tài)，少數(shù)可以伴有腺體分化[11]。本研究在8例GCLS中發(fā)現(xiàn)2例患者伴有腺體分化成分。兩種構(gòu)型的瘤細(xì)胞之間有模糊的移行關(guān)系或兩種成分混雜存在，且這兩種成分分子特征相似，提示這兩種形態(tài)的瘤細(xì)胞具有同源性，有部分GCLS細(xì)胞可能是腺癌細(xì)胞失分化后的形態(tài)轉(zhuǎn)化。

GCLS在所有胃癌中僅占1%～4%，個(gè)別亞洲的報(bào)道占比達(dá)到20%[12]，男性發(fā)病率明顯高于女性，中老年相對(duì)多見，且多見于近端胃和殘胃[4]。本研究中8例GCLS在同期診斷的胃癌中占1.2%，絕大多數(shù)為男性（7/8，占87.5%），中老年人為主，除1例發(fā)生于殘胃吻合口外，其余7例均發(fā)生于胃體以上部位，尤其是賁門胃底部，這些特征均與文獻(xiàn)報(bào)道相似。胃癌的發(fā)生、發(fā)展中，HP是已知明確的強(qiáng)致癌因素[13]，但本研究中8例患者中均未找到HP感染的證據(jù)，提示HP感染在GCLS發(fā)生、發(fā)展中作用有限。

胃癌是一種異質(zhì)性腫瘤，其中EB病毒陽性型占胃癌的8.8%，MSI型占21.7%，這兩種類型中多數(shù)患者的組織學(xué)特點(diǎn)為腫瘤內(nèi)富于炎癥細(xì)胞或呈GCLS形態(tài)[3]。GCLS的發(fā)病機(jī)制目前還不十分清楚，多數(shù)研究認(rèn)為EB病毒在其發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。GCLS中EBER陽性率報(bào)道不一，歐美地區(qū)陽性率較低，Hissong等[6]在31例GCLS患者中檢出7例EV病毒陽性（22.6%），Tsai等[12]報(bào)道的陽性率為26%。本研究收集的8例GCLS中6例EBER陽性，陽性率為75.0%，與胡春芳等[8]報(bào)道的陽性率相近，表明EB病毒是GCLS主要的致病因素，但其致病機(jī)制仍需要更多研究來闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)GCLS中有部分患者為EB病毒陰性，這部分患者中微衛(wèi)星穩(wěn)定狀態(tài)越來越受到研究者們的關(guān)注。Hissong等[6]在31例GCLS患者中檢出12例錯(cuò)配修復(fù)缺陷且EBER陰性（38.7%），均表現(xiàn)為MLH1/PMS2表達(dá)缺失，沒有檢出MSH2/MSH6表達(dá)缺失。Tsai等[12]在EB病毒陰性GCLS中檢出更高比例的錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失，缺失比例達(dá)到48%。國內(nèi)對(duì)GCLS中錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)情況或MSI狀態(tài)鮮有研究。本研究在8例GCLS中檢出2例錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)缺失，缺失率25.0%，均為MLH1/PMS2表達(dá)缺失，同時(shí)這2例EBER均陰性。Tsai等[12]比較了GCLS中EB病毒陽性型與錯(cuò)配修復(fù)缺陷型之間的形態(tài)差異，發(fā)現(xiàn)EB病毒陽性型內(nèi)淋巴組織浸潤比例比錯(cuò)配修復(fù)缺陷型要高，但本研究未發(fā)現(xiàn)這兩型之間有明顯形態(tài)學(xué)上的差異，可能還需要更大樣本的研究來分析。EV病毒陽性型和MSI型胃癌中程序性死亡配體-1（programmed death ligand 1,PD-L1）表達(dá)升高，提示這兩種類型都可能從抗PD-L1的免疫治療中獲益[14-15]，筆者后續(xù)將對(duì)這些患者進(jìn)行相關(guān)分析。GCLS中還存在EB病毒陰性同時(shí)錯(cuò)配修復(fù)未缺失的患者[6]，本研究中未發(fā)現(xiàn)這一類型的存在，這些患者可能存在的分子遺傳改變目前尚不清楚，還需要更多病例積累和研究。

HER-2是目前胃癌靶向治療最有用的標(biāo)志物之一，胃癌中HER-2過表達(dá)比例為12%～20%不等，且腸型胃癌和染色體穩(wěn)定型中陽性率更高[3，7，13]。國內(nèi)外關(guān)于GCLS中HER-2狀態(tài)的報(bào)道很少。Hissong等[6]研究了31例GCLS，未發(fā)現(xiàn)HER-2過表達(dá)。Tsai等[12]也有相似的發(fā)現(xiàn)，與TCGA分型觀點(diǎn)一致。有很少的研究在EB病毒陽性胃癌中檢出HER-2基因擴(kuò)增，陽性率均非常低[9，16]。本研究僅在1例EBER陽性但錯(cuò)配修復(fù)蛋白表達(dá)無缺失患者中發(fā)現(xiàn)HER-2過表達(dá)，這表明GCLS中HER-2過表達(dá)和EBER陽性可以并存，但比例確實(shí)很低，且本例中HER-2的表達(dá)具有顯著異質(zhì)性。

綜上所述，GCLS是一種少見形態(tài)的胃癌類型，其臨床和病理特征鮮明，且與EB病毒感染和錯(cuò)配修復(fù)蛋白缺陷密切相關(guān)，個(gè)別患者存在HER-2過表達(dá)。這些分子改變表明形態(tài)上相似的GCLS在分子層面仍有較大的異質(zhì)性，在日常工作中有必要對(duì)胃癌患者同時(shí)檢測多種標(biāo)志物，更好地對(duì)其進(jìn)行形態(tài)-分子聯(lián)合分型并指導(dǎo)更精準(zhǔn)的治療。