7項(xiàng)腫瘤相關(guān)自身抗體在早期非小細(xì)胞肺癌中的診斷價值

鄒燕萍 章于瀟 陳海欣 陳婷婷

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，患者5年生存率約4%～17%[1]。早診斷、早治療能明顯延長患者的生存周期[2]。肺癌的組織分型主要包括非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌等[3]。目前，胸部低劑量CT（low dose chest CT，LDCT）已廣泛用于肺癌的篩查，其靈敏度高，但特異度低[4]。根據(jù)Fleischner協(xié)會制定的《偶發(fā)肺結(jié)節(jié)管理指南》，需要結(jié)合結(jié)節(jié)性質(zhì)以及風(fēng)險因素進(jìn)行評估[5]，但風(fēng)險因素缺乏可量化的指標(biāo)，導(dǎo)致對結(jié)節(jié)性質(zhì)的判斷存在偏差[6]。而癌胚抗原、神經(jīng)元特異性烯醇化酶等血清學(xué)腫瘤指標(biāo)靈敏度和特異度均達(dá)不到早診斷的要求[7-9]。作為“金標(biāo)準(zhǔn)”的組織病理學(xué)檢查，因存在創(chuàng)傷性，不適合中低風(fēng)險結(jié)節(jié)性質(zhì)判斷。因此，如何對早期肺癌進(jìn)行篩查，在臨床上是一個挑戰(zhàn)。

腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigens，TAAs）是腫瘤細(xì)胞表面的多肽成分或其釋放的能夠刺激機(jī)體免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)[10-11]。機(jī)體能夠針對TAAs產(chǎn)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生腫瘤相關(guān)自身抗體（tumor-associated autoantibodies，TAAbs）[12]。TAAbs在血液中較 TAAs穩(wěn)定，由于免疫放大效應(yīng)更利于臨床檢測[13]。本研究對照分析早期（病理分期為Ⅰ～Ⅱ期）NSCLC患者7項(xiàng)TAAbs[抑癌基因 53（tumor protein p53，p53）、蛋白基因產(chǎn)物 9.5（protein gene product 9.5，PGP9.5）、干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子 2（SRY-box transcription factor 2，SOX2）]、腫瘤睪丸抗原 7（G antigen 7，GAGE7）、腫瘤抗原 4-5（RNA helicase 4-5，GBU4-5）、黑色素瘤抗原 A1（MAGE family member A1，MAGE A1）和人癌抗原（cancer antigen 1，CAGE）的表達(dá)水平，探討7項(xiàng)TAAbs在早期NSCLC中的診斷價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年9月至2019年12月在浙江省中醫(yī)院呼吸科初診的早期NSCLC患者63例作為NSCLC組，男38例，女25例；年齡37～68歲，中位年齡54歲；所有診斷依據(jù)中國臨床腫瘤學(xué)會《原發(fā)性肺癌診療指南 2019 版》[14]。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡 25～70 歲；（2）初診患者，且未接受手術(shù)、放化療及靶向藥物治療等；（3）病理分期為Ⅰ～Ⅱ期；（4）排除肺外腫瘤等。選取同期進(jìn)行LDCT及7項(xiàng)TAAbs檢測且年齡為25～70歲的體檢者，根據(jù)《中國肺部結(jié)節(jié)分類、診斷與治療指南（2016版）》[15]，將有低風(fēng)險肺結(jié)節(jié)者作為良性肺結(jié)節(jié)組，無明顯肺部異常者作為健康對照組。良性肺結(jié)節(jié)組147例，男94例，女53例；年齡32～65歲，中位年齡50歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡 25～70 歲；（2）LDCT 檢查為肺部結(jié)節(jié)，且根據(jù)2017 Fleischer協(xié)會制定的《偶發(fā)肺結(jié)節(jié)管理指南》，結(jié)合臨床因素判斷為低風(fēng)險肺結(jié)節(jié)；（3）排除肺外腫瘤及其他結(jié)節(jié)。健康對照組65例，男43例，女22例；年齡32～63歲，中位年齡47歲；經(jīng)LDCT檢查肺部無明顯異常，且排除其他腫瘤、結(jié)節(jié)等。本研究經(jīng)浙江省中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過（2020-K-267-01），所有研究對象均知情同意。

1.2 樣本收集及處理 所有入組者均采集清晨空腹靜脈血5 ml，3 500 r/min離心5 min，分離血清，8 h內(nèi)完成檢測，不能及時檢測的將分離后血清于-20℃凍存。7項(xiàng)TAAbs檢測試劑盒（ELISA法，規(guī)格：9人份/盒，批號：20180702、20181204、20190405 和 20191004）購自杭州凱保羅公司；BIO-RAD iMark酶標(biāo)儀購自美國伯樂公司。實(shí)驗(yàn)前將所有血清樣本及試劑置于室溫30 min，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作，在反應(yīng)結(jié)束30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀取450 nm處吸光度（OD450）值。正常參考范圍：p53 為 0～13.1 U/ml、PGP9.5 為 0～11.1 U/ml、SOX2 為 0～10.3 U/ml、GAGE7 為 0～14.4 U/ml、GBU4-5 為 0～7.0 U/ml、MAGE A1為 0～11.9 U/ml、CAGE 為 0～7.2 U/ml。如果 7項(xiàng)TAAbs表達(dá)水平均在參考值范圍內(nèi)則判為陰性，若其中任意一種自身抗體水平超過正常參考上限范圍則判為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以 M（P25，P75）表示，多組間比較采用 Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用ROC曲線分析7項(xiàng)TAAbs單獨(dú)檢測和聯(lián)合檢測對早期NSCLC的診斷效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組研究對象血清中7項(xiàng)TAAbs表達(dá)水平比較3組研究對象血清中p53、GUB4-5和CAGE表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），但PGP9.5、SOX2、GAGE7和MAGE A1表達(dá)水平比較均差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05），見表 1。

表1 3組研究對象血清中7項(xiàng)TAAbs表達(dá)水平比較（U/ml）

2.2 7項(xiàng)TAAbs單項(xiàng)檢測和聯(lián)合檢測對早期NSCLC的診斷效能 以NSCLC組作為疾病組，健康對照組作為對照組，繪制ROC曲線，分析7項(xiàng)TAAbs單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測對早期NSCLC的診斷效能，p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGE A1、CAGE 及 7 項(xiàng)TAAbs聯(lián)合檢測的 AUC 分別為 0.601、0.601、0.604、0.610、0.603、0.595、0.601和 0.705，見圖1（插頁）。7項(xiàng) TAAbs單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測診斷早期NSCLC的靈敏度和特異度比較，聯(lián)合檢測靈敏度最高，其次是MAGE A1、GBU4-5；CAGE 特異度最高，其次是 SOX2、p53，見表2。

表2 7項(xiàng)TAAbs單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測診斷早期NSCLC的效能

圖1 7項(xiàng)腫瘤相關(guān)自身抗體（TAAbs）單獨(dú)檢測及聯(lián)合檢測診斷早期非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的ROC曲線（p53為抑癌基因53；PGP9.5為蛋白基因產(chǎn)物9.5；SOX2為干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2；GAGE7為腫瘤睪丸抗原7；GBU4-5為腫瘤抗原4-5；MAGE A1為黑色素瘤抗原A1；CAGE為人癌抗原）

2.3 3組研究對象7項(xiàng)TAAbs單項(xiàng)檢測和聯(lián)合檢測的陽性率比較 3組研究對象p53、PGP9.5、SOX2、MAGE A1單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測的陽性率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；NSCLC組患者SOX2單項(xiàng)檢測及7項(xiàng)TAAbs聯(lián)合檢測的陽性率均高于健康對照組（均P＜0.05）；良性肺結(jié)節(jié)組患者M(jìn)AGE A1單項(xiàng)檢測的陽性率低于健康對照組（P＜0.05）；NSCLC 組患者 p53、PGP9.5、GAGE7、MAGE A1單項(xiàng)檢測及7項(xiàng)TAAbs聯(lián)合檢測的陽性率均高于良性肺結(jié)節(jié)組（均P＜0.05），見表3。

表3 3組研究對象7項(xiàng)TAAbs單項(xiàng)檢測和聯(lián)合檢測的陽性率比較[例（%）]

3 討論

惡性腫瘤是導(dǎo)致人類死亡的重要疾病之一，而肺癌是所有惡性腫瘤中發(fā)病率和死亡率最高的。隨著空氣污染的加重及吸煙比例的增加，每年很多人被診斷為肺癌并因此導(dǎo)致死亡[1]。早期肺癌患者5年生存率可達(dá)60%～70%，而中晚期肺癌患者5年生存率僅為20%左右，有證據(jù)表明早期診斷并及時治療能夠提高生存率[3]。由于以往醫(yī)療資源不充足，而且早期肺癌癥狀不典型，導(dǎo)致85%以上肺癌患者被檢出時已經(jīng)處于中晚期[16]。隨著健康意識的提高，體檢的普及，LDCT的廣泛應(yīng)用，越來越多的微小肺結(jié)節(jié)在體檢時被檢出。但是現(xiàn)有的技術(shù)很難做到對肺結(jié)節(jié)的性質(zhì)直接進(jìn)行判斷。單純依賴LDCT隨訪，有時會增加患者的焦慮，而組織病理作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，并不適合微小肺結(jié)節(jié)患者的直接診斷。TAAbs作為近些年來新發(fā)展的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床[13]。有很多關(guān)于TAAbs在肺癌中診斷價值的研究，但大多數(shù)入組患者包括中晚期肺癌患者，單獨(dú)在早期肺癌中的研究并不多[17-18]；其次，對早期肺癌和良性肺結(jié)節(jié)的比較研究較少，很多研究選擇肺炎、慢性阻塞性肺疾病等作為肺部良性組，但是事實(shí)上在LDCT上較難區(qū)別的是肺癌與肺部良性肺結(jié)節(jié)[19]。由于肺癌的主要類型是NSCLC，本研究通過對早期NSCLC患者7項(xiàng)TAAbs單獨(dú)檢測及聯(lián)合檢測進(jìn)行分析，以體檢中未發(fā)現(xiàn)明顯異常的人員作為健康對照，研究7項(xiàng)TAAbs在早期NSCLC中的診斷價值，并分析其在早期NSCLC組、良性肺結(jié)節(jié)組及健康對照組3組中表達(dá)水平的差異，判斷其能否用于NSCLC與良性肺結(jié)節(jié)鑒別診斷。

本研究顯示血液中7項(xiàng)TAAbs單個指標(biāo)及聯(lián)合指標(biāo)中位水平均高于良性肺結(jié)節(jié)組和健康對照組，其中PGP9.5、SOX2、GAGE7及 MAGE A1存在統(tǒng)計學(xué)差異，這與Zhu等[20]研究結(jié)果一致，表明7項(xiàng)TAAbs在早期NSCLC鑒別有一定的臨床意義。另外，通過對7項(xiàng)TAAbs在早期NSCLC診斷的ROC曲線分析，單項(xiàng)檢測AUC主要介于0.60～0.70，提示單項(xiàng)檢測準(zhǔn)確性不高，聯(lián)合檢測AUC為0.705，＞0.70，提示聯(lián)合檢測較單項(xiàng)檢測準(zhǔn)確性好。聯(lián)合檢測靈敏度是最高的，但是其特異度略有下降。焦揚(yáng)[21]的研究結(jié)果顯示，7項(xiàng)TAAbs單獨(dú)檢測靈敏度較低，為9.1%～17.0%，特異度為89.4%～100%，診斷符合率不足50%；聯(lián)合診斷時靈敏度升高至61.0%，而特異度下降至90.0%，這與本研究結(jié)果接近。Wang等[22]采用5項(xiàng)TAAbs聯(lián)合檢測，其肺癌診斷效能低于本研究，說明在聯(lián)合使用時，多指標(biāo)的使用能夠提高其診斷效能。但是趙娟等[23]報道的7項(xiàng)TAAbs聯(lián)合檢測的診斷效能優(yōu)于本研究，主要考慮和入組的患者有關(guān)，本研究肺癌患者均處于早期，而趙娟等研究中肺癌組則混有不同分期的患者。相對早期患者，中晚期肺癌患者的TAAbs表達(dá)水平有所提高。3組研究對象p53、PGP9.5、SOX2、MAGE A1單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測的陽性率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；NSCLC組患者SOX2單項(xiàng)檢測及7項(xiàng)TAAbs聯(lián)合檢測的陽性率均高于健康對照組，p53、PGP9.5、GAGE7、MAGE A1 單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測的陽性率均高于良性肺結(jié)節(jié)組，說明7項(xiàng)TAAbs在NSCLC以及肺部良性疾病中表達(dá)存在差異，有可能被用于NSCLC的輔助鑒別診斷，但是本研究發(fā)現(xiàn)部分指標(biāo)，如SOX2，在NSCLC組和健康對照組中存在差異，但在NSCLC組和良性肺結(jié)節(jié)組卻無統(tǒng)計學(xué)差異，說明SOX2不適合單獨(dú)應(yīng)用于早期肺癌和良性肺結(jié)節(jié)的鑒別，同時3組研究對象GAGE7、GBU4-5及CAGE單項(xiàng)檢測及7項(xiàng)TAAbs聯(lián)合檢測的陽性率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，表明單個指標(biāo)對肺癌診斷差異很大，聯(lián)合診斷陽性率明顯高于單個指標(biāo)。

綜上所述，7項(xiàng)TAAbs聯(lián)合檢測在早期NSCLC診斷效能優(yōu)于單項(xiàng)檢測。但是，聯(lián)合檢測時AUC也不是很高，略高于0.70，準(zhǔn)確性依然有待提升。在早期NSCLC組中，聯(lián)合檢測陽性率也低于50%，單項(xiàng)指標(biāo)低于20%，如果單純使用7項(xiàng)TAAbs作為肺癌診斷指標(biāo)，漏檢率很大，不建議其用于肺癌的初篩。如果患者經(jīng)濟(jì)允許，臨床上可以將7項(xiàng)TAAbs作為輔助指標(biāo)，對于陽性患者，應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)視管理。本研究還存在一些不足，如良性肺結(jié)節(jié)組，本研究選擇低風(fēng)險結(jié)節(jié)的體檢者，事實(shí)上低風(fēng)險結(jié)節(jié)中可能存在約5%的惡性腫瘤，但是現(xiàn)有的技術(shù)很難快速進(jìn)行區(qū)分；另外入組的患者不夠多，有些結(jié)果需要大批量樣本或多中心研究去驗(yàn)證。