基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建前列腺癌相關(guān)miRNA預(yù)后模型

張泉波 李玉蓮 陳綺 張艷艷 陳國(guó)榮

前列腺癌是男性最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，全世界每年新發(fā)病例約130萬(wàn)例[1-3]。盡管前列腺癌的治療策略已有了明顯進(jìn)步，患者的存活率得到了顯著提高[4]，但患者的總體生存期仍未得到提升，5年總存活率只有28%左右[5-6]。目前，患者的預(yù)后評(píng)估方法主要依靠臨床TNM分期和常規(guī)組織病理學(xué)檢查[7-8]，然而這并不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)前列腺癌患者的預(yù)后情況，因此迫切需要新的早期診斷標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)來(lái)協(xié)助改善前列腺癌患者的預(yù)后。miRNA是一類(lèi)短鏈非編碼RNA，目前科學(xué)家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了1 400多個(gè)人類(lèi)miRNA，這些miRNA可以通過(guò)抑制翻譯或促進(jìn)mRNA降解從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[9-10]。眾所周知，miRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)來(lái)影響多種生物途徑，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、血管生成、腫瘤侵襲遷移等[11-12]。Wei等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-296可以通過(guò)減少高遷移率族蛋白A1（HMGA1）基因的表達(dá)來(lái)抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖與侵襲。Gan等[14]研究證明miR-16-5p能夠調(diào)節(jié)相關(guān)通路導(dǎo)致細(xì)胞停滯在G0/G1期，從而提高前列腺癌細(xì)胞對(duì)放射治療的靈敏度。這些研究均表明，許多miRNA或許可以作為前列腺癌的診斷標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。雖然已有研究證實(shí)了個(gè)別miRNA與前列腺癌預(yù)后之間的關(guān)系[15-17]，但目前仍沒(méi)有研究能夠系統(tǒng)地闡明前列腺癌中的差異表達(dá)miRNA與預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)。因此，本研究利用癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)（the cancer genome atlas，TCGA）中前列腺癌患者的miRNA和mRNA數(shù)據(jù)及臨床信息，構(gòu)建由miRNA組成的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 基因數(shù)據(jù)的提取 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/）中下載了499例前列腺癌組織樣本和52例正常組織樣本的miRNA和mRNA數(shù)據(jù)，并確立篩選標(biāo)準(zhǔn)：（1）錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05；（2）表達(dá)差異＞2 倍以上[log2差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞1，F(xiàn)C＞2]。最終篩選出131個(gè)差異表達(dá)miRNA及524個(gè)差異mRNA，利用R語(yǔ)言繪制了火山圖和熱圖。

1.2 Kaplan-Meier預(yù)后分析 分別利用R語(yǔ)言的survival包以及基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析（gene expression profiling interactive analysis,GEPIA）（http://gepia2.cancerpku.cn）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)前列腺癌患者的差異表達(dá)miRNA及mRNA進(jìn)行預(yù)后分析。

1.3 構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 利用TargetScan（http://www.targetscan.org）、miRDB（http://mirdb.org/miRDB）和miRanda（http://www.microrna.org）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)納入模型的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。使用 Venny 2.1（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)這些靶基因的生物信息學(xué)可信度。使用Cytoscape軟件繪制miRNA-mRNA調(diào)控機(jī)制網(wǎng)絡(luò)。

1.4 基因功能富集分析 基因本體論（gene ontology,GO）的功能注釋由生物學(xué)過(guò)程（biological process,BP）、細(xì)胞組分（cellular component,CC）和分子功能（molecular function,MF）3部分組成，通過(guò)京都基因和基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)分析相關(guān)信號(hào)通路。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 差異miRNA及mRNA表達(dá)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不同臨床病理分期的基因表達(dá)水平比較采用單因素方差分析；基因表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系分析采用Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)，兩組生存率比較采用log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌差異表達(dá)miRNA篩選及預(yù)后鑒定 按照預(yù)先設(shè)定的篩選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所獲取的miRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析并進(jìn)一步進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析探究預(yù)后相關(guān)的miRNA，結(jié)果提示miR-19a-3p、miR-144-3p、miR-223-5p和miR-483-3p與患者總生存期（overall survival,OS）密切相關(guān)，miR-144-3p、miR-223-5p、miR-483-3p高表達(dá)組OS均高于低表達(dá)組（均P＜0.05），而miR-19a-3p高表達(dá)組OS低于低表達(dá)組（P＜0.05）[圖1（見(jiàn)插頁(yè)）和圖2]。

圖1 差異表達(dá)miRNA（a：前列腺癌組織與正常組織之間的差異miRNA基因熱圖；b：差異miRNA火山圖，紅點(diǎn)代表上調(diào)的miRNA，綠點(diǎn)代表下調(diào)的miRNA）

圖2 差異表達(dá)miRNA與患者總生存期的關(guān)系

2.2 miRNA表達(dá)量與前列腺癌患者的臨床病理特征的關(guān)系 4個(gè)預(yù)后相關(guān)miRNA中，miR-483-3p表達(dá)量與T分期有關(guān)，在不同T分期患者中呈現(xiàn)為T(mén)4＞T2＞T3（P＜0.05）；miR-19a-3p表達(dá)量與患者年齡有關(guān)，＞60歲以上患者miR-19a-3p表達(dá)量明顯高于≤60歲患者（P＜0.05）；miR-223-5p表達(dá)量與Gleason評(píng)分有關(guān)，在7分時(shí)表達(dá)量最高，而≤6分時(shí)表達(dá)量最低（P＜0.05）（圖3）。

圖3 miRNA表達(dá)量與前列腺癌患者的臨床病理特征的關(guān)系（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3 預(yù)測(cè)相關(guān)靶基因 利用TargetScan、miRDB和mi-Randa數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)4個(gè)miRNA作用的靶基因，結(jié)果顯示 miR-19a-3p、miR-144-3p、miR-223-5p 和 miR-483-3p潛在靶基因分別有713、521、420和49個(gè)（圖4）。隨后結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中mRNA差異分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中上述4個(gè)miRNA的潛在靶基因有41個(gè)（圖5，見(jiàn)插頁(yè)）。既往已有文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA可以通過(guò)結(jié)合mRNA導(dǎo)致基因沉默[18]，因此最終確定4個(gè)miR-NA的潛在靶基因有33個(gè)并構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)顯示其關(guān)系（圖6）。

圖4 差異miRNA的靶基因預(yù)測(cè)

圖5 差異表達(dá)mRNA（a：前列腺癌組織與正常組織之間差異mRNA基因熱圖；b：差異mRNA火山圖，紅點(diǎn)代表上調(diào)的基因，綠點(diǎn)代表下調(diào)的基因；c：41個(gè)差異mRNA的表達(dá)量）

圖6 miRNA與靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（深灰色三角形代表上調(diào)的miRNA，淺色三角形代表向下調(diào)節(jié)的miRNA；淺灰色橢圓代表下調(diào)的mRNA，而深灰色橢圓代表上調(diào)的mRNA）

2.4 差異表達(dá)基因的功能富集分析 對(duì)這33個(gè)潛在靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，表明其BP主要與肌肉細(xì)胞分化、發(fā)育以及上皮細(xì)胞發(fā)育有關(guān)；CC主要與肌原纖維、纖維的收縮和細(xì)胞-基質(zhì)黏附連接相關(guān)；MF主要與肌動(dòng)蛋白結(jié)合和細(xì)胞黏附分子結(jié)合相關(guān)。此外，KEGG通路分析結(jié)果提示靶基因主要涉及到叉頭轉(zhuǎn)錄因子（forkhead box sub-group O,FoxO）和磷脂酰肌醇 3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/AKT serine/threonine kinase 1,PI3K/Akt）信號(hào)通路（圖7，見(jiàn)插頁(yè)）。

圖7 差異表達(dá)基因的功能富集分析[a-b：生物學(xué)過(guò)程（BP）；c-d：細(xì)胞組分（CC）；e-f：分子功能（MF）；g-h：京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）通路分析]

2.5 差異表達(dá)基因與患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier生存分析顯示，前列腺癌患者心肌肌動(dòng)蛋白α1（actin alpha cardiac muscle 1,ACTC1）、CD177、絲切蛋白 2（cofilin 2，CFL2）、肌蛋白修飾調(diào)節(jié)因子2（muscleblind like splicing regulator 2，MBNL2）、含鈀蛋白（palladin，PALLD）、磷酸二酯酶 5A（phosphodies terase 5A，PDE5A）、聯(lián)絲蛋白（synemin，SYNM）或突觸極蛋白 2（synaptopodin 2，SYNPO2）高表達(dá)組患者無(wú)病生存期均長(zhǎng)于低表達(dá)組患者（均P＜0.05）（圖 8）。

圖8 差異表達(dá)基因與患者預(yù)后的關(guān)系（ACTC1為心肌肌動(dòng)蛋白α1；CFL2為絲切蛋白2；MBNL2為肌蛋白修飾調(diào)節(jié)因子2；PALLD為含鈀蛋白；PDE5A為磷酸二酯酶5A；SYNM為聯(lián)絲蛋白；SYNPO2為突觸極蛋白2）

3 討論

隨著對(duì)前列腺癌研究的日益深入，患者的預(yù)后得到了極大的改善。然而，由于對(duì)前列腺癌的篩查指標(biāo)仍有爭(zhēng)議，因此，進(jìn)一步探索前列腺癌的相關(guān)機(jī)制，挖掘有效的基因靶點(diǎn)對(duì)前列腺癌的診斷治療及預(yù)后評(píng)估具有重要的臨床意義[19-20]。

越來(lái)越多的研究表明miRNA可以建立復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并參與多種生物途徑，從而影響癌癥的發(fā)病機(jī)制[21-22]。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中，miRNA是一把雙刃劍，腫瘤類(lèi)型、臨床階段、遺傳背景，甚至治療方案都能影響到它在腫瘤中的作用[23]。

本研究所構(gòu)建的預(yù)后模型共納入4個(gè)miRNA，分別為 miR-19a-3p、miR-144-3p、miR-223-5p 和 miR-483-3p。miR-19a-3p已被證實(shí)在乳腺癌、肝細(xì)胞癌及膠質(zhì)瘤等[24-25]多種癌癥中呈現(xiàn)為低表達(dá)狀態(tài)，而其在前列癌細(xì)胞系中的表達(dá)量卻大不相同，如miR-19a-3p在原發(fā)性前列腺癌細(xì)胞22RV1中表達(dá)量上升，但在骨轉(zhuǎn)移前列腺癌細(xì)胞系（PC-3、C4-2B和VCAP）中明顯減少?，F(xiàn)有研究表明，miR-19a-3p可以通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β通路的下游SMAD家族成員2（SMAD2）和SMAD家族成員4（SMAD4），從而影響前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[26]。此外，miR-144-3p被證實(shí)參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，相關(guān)研究顯示它可以作為腫瘤抑制因子，通過(guò)下調(diào)中心體蛋白55（CEP55）從而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞的凋亡，并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來(lái)抑制細(xì)胞增殖[27]。miR-483-3p與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切的關(guān)聯(lián)。研究表明，miR-483-3p可以通過(guò)與p53凋亡上調(diào)基因（PUMA）mRNA 3'UTR相互作用，從而抑制抗凋亡因子B細(xì)胞淋巴瘤因子3（BCL3）和B細(xì)胞淋巴瘤因子X(jué)L（BCLXL）來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用[28]。此外，miR-223-5p與乳腺癌、胃癌和肝細(xì)胞肝癌等多種腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移相關(guān)。有研究表明，miR-223-5p在非小細(xì)胞肺癌組織中呈低表達(dá)趨勢(shì)，研究人員在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中上調(diào)了miR-223-5p的表達(dá)量后，發(fā)現(xiàn)E2F轉(zhuǎn)錄因子8（E2F8）作為miR-223-5p的功能靶點(diǎn)，出現(xiàn)了表達(dá)量的下降，并抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[29]。雖然已有研究證明miR-483-3p、miR-223-5p與腫瘤之間的相關(guān)性，但是暫時(shí)沒(méi)有研究能證明這兩種miRNA與前列腺癌患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)。

為了探索 miR-19a-3p、miR-144-3p、miR-223-5p和miR-483-3p的潛在靶基因，本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)及基因功能富集分析，最終證實(shí)了ACTC1、CD177、CFL2、MBNL2、PALLD、PDE5A、SYNM、SYNPO2 均與前列腺癌患者預(yù)后相關(guān)。ACTC1作為肌動(dòng)蛋白家族中的一員，早期研究發(fā)現(xiàn)其在心力衰竭、高血壓等心血管疾病中起到重要作用；而在后續(xù)的研究中，發(fā)現(xiàn)其在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用；現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌雄激素剝奪治療后患者中ACTC1基因表達(dá)量上調(diào)[30]。CD177作為一種糖磷脂素基醇-細(xì)胞外膜結(jié)合蛋白，屬于Ly-6家族[31]。研究表明CD177的下調(diào)與β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)傳導(dǎo)的增加有關(guān)，它能夠作為上皮細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)因子參與前列腺癌的進(jìn)展[32]。CFL2基因是肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族的重要成員，主要在哺乳動(dòng)物的骨骼肌和心肌中表達(dá)，對(duì)維持肌肉正常的生長(zhǎng)發(fā)育和功能起著非常重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)CFL2基因可通過(guò)miR-1299/CFL2、miR-369-3p/CFL2等多種途徑影響前列腺腫瘤的進(jìn)展[33-34]。研究發(fā)現(xiàn)PDE5A的抑制劑可以通過(guò)放大有絲分裂阻滯信號(hào)，協(xié)同長(zhǎng)春新堿在去勢(shì)抵抗性前列腺癌中起到治療作用[35]。SYNPO2作為一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白和侵襲性癌癥生物標(biāo)志物，在細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)形成復(fù)雜的應(yīng)激纖維網(wǎng)絡(luò)。已有研究表明SYNPO2可以通過(guò)誘導(dǎo)周?chē)?dòng)蛋白束的組裝從而促進(jìn)PC-3前列腺癌細(xì)胞的遷移[36]。雖然已有研究證明了MBNL2、PALLD、SYNM與腫瘤之間的相關(guān)性，但是暫時(shí)未能證明這兩種miRNA與前列腺癌患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)[37-39]。

綜上所述，本研究對(duì)miRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行了綜合分析，為探索差異表達(dá)miRNA在前列腺癌中的作用提供了有效的統(tǒng)計(jì)方法，然而本研究也存在一定的局限性。首先，本研究的數(shù)據(jù)僅來(lái)源于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，應(yīng)該結(jié)合更多數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)增加樣本量；其次，所篩選到的 mRNA表達(dá)與生存情況未在蛋白質(zhì)層面進(jìn)行分析，未對(duì)有研究?jī)r(jià)值的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這些將在后續(xù)研究中進(jìn)一步完善。