預(yù)熱超聲對(duì)菠蘿蜜種子分離蛋白起泡性及結(jié)構(gòu)的影響

周若楠，張彥軍，鐘俊楨*，周 磊，劉 偉，劉成梅

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047； 2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，海南 萬(wàn)寧 571533)

菠蘿蜜(Artocarpus heterophyllus Lam)屬桑科，又稱(chēng)“木菠蘿、樹(shù)菠蘿”，其果實(shí)清甜可口，香味濃郁，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，被譽(yù)為“熱帶水果皇后”，廣泛種植于墨西哥、馬來(lái)西亞等熱帶國(guó)家[1]。在我國(guó)主要種植于海南、云南等熱帶和亞熱帶等地區(qū)。菠蘿蜜種子占果實(shí)總重量的8%～15%，是淀粉(67%)和蛋白質(zhì)(20%)的良好來(lái)源[2]。菠蘿蜜含有許多植物化學(xué)物質(zhì)，如木質(zhì)素、異黃酮、多酚等，它們具有優(yōu)異的生物活性，如抗衰老、抗高血壓、抗癌和抗氧化等[3]。研究發(fā)現(xiàn)菠蘿蜜種子分離蛋白(Jackfruit Seed Isolate Protein,JSPI)中的必需氨基酸占總氨基酸的48.39%，高于大豆蛋白(37.79%)，其中蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸含量均高于大豆蛋白，其它必需氨基酸含量與大豆蛋白無(wú)異。作為世界上最重的水果，其種子產(chǎn)量高，但只有少量被用來(lái)食用，大部分被丟棄，既造成了資源的浪費(fèi)，又降低了菠蘿蜜的經(jīng)濟(jì)效益[4]。

由于植物蛋白在人類(lèi)健康和營(yíng)養(yǎng)中的重要作用，使其作為食品加工中的一種功能成分的需求越來(lái)越大。起泡性是蛋白質(zhì)重要的功能性質(zhì)之一，對(duì)蛋糕、冰激凌、飲料等起泡性要求較高的食品十分重要，已逐漸成為研究熱點(diǎn)[5]。動(dòng)物蛋白，如蛋清蛋白和乳清蛋白，具有良好的起泡性被廣泛用做發(fā)泡劑。但動(dòng)物蛋白價(jià)格昂貴，應(yīng)用成本高，可以考慮用優(yōu)質(zhì)的植物蛋白作為替代品[6]。菠蘿蜜具有優(yōu)異的功能和營(yíng)養(yǎng)特性，可以成為一種新的蛋白來(lái)源。但與動(dòng)物蛋白相比，JSPI的起泡性較差，在食品工業(yè)中的應(yīng)用不如動(dòng)物蛋白。所以改善JSPI的起泡性，擴(kuò)大在食品工業(yè)中的應(yīng)用，具有重要的科研意義和經(jīng)濟(jì)意義。

改善起泡性的方法包括化學(xué)、物理或酶法改性等?；瘜W(xué)改性可能會(huì)產(chǎn)生或引入有毒或影響食品風(fēng)味的物質(zhì)；酶法改性會(huì)使蛋白質(zhì)在酶解過(guò)程中產(chǎn)生苦味肽，影響產(chǎn)品的風(fēng)味和口感；物理改性作用時(shí)間短、安全性好，對(duì)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值損失小[7]。超聲是一種綠色、安全、高效的新型非熱物理技術(shù)，超聲引起的空化效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致高溫、高壓、高剪切能波和湍流，從而改變蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)性質(zhì)[8]。Feng等[9]發(fā)現(xiàn)在pH 2.0～10.0條件下，超聲(400，600 W)可以顯著提高李子分離蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性。Xiong等[10]發(fā)現(xiàn)超聲后的豌豆蛋白，起泡能力從145.6%提高到200.0%，泡沫穩(wěn)定性從58.0%增加到73.3%。Flores-Jiménez等[11]也得出類(lèi)似的結(jié)論。超聲可以作為改善蛋白質(zhì)起泡性的技術(shù)手段，在蛋白質(zhì)的開(kāi)發(fā)與利用上具有廣闊的應(yīng)用前景和潛力[12]。

本研究針對(duì)JSPI的起泡性，通過(guò)預(yù)熱超聲技術(shù)改善JSPI的起泡性，并探究結(jié)構(gòu)對(duì)起泡性的影響,期望拓寬JSPI在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用，也為超聲改性蛋白方面提供一些新的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠蘿蜜種子 海南萬(wàn)寧(熱帶香料飲料作物研究所)；其它化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

GA92-IIDB超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 無(wú)錫市上佳生物有限公司；F-7000熒光分光光度計(jì) 日本日立公司； MOS-450光譜儀 法國(guó)Biologico；T 25 digital高速分散機(jī) 德國(guó)IKA公司； NanoZsp電位儀 英國(guó)Malven公司；Ms3000LvAeros激光衍射粒度分析儀 英國(guó)Malvern公司；Synergy H1酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio Tek 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菠蘿蜜種子分離蛋白(JSPI)制備

參考Zhang等[13]的方法制備JSPI。用研磨機(jī)將菠蘿蜜種子研磨成粉，在室溫下風(fēng)干過(guò)篩(40目)。用石油醚對(duì)種子粉(1:5，V/w)脫脂并得到脫脂粉。將脫脂粉(1:10，w/V)分散在蒸餾水中，用1 mol NaOH調(diào)節(jié)至pH 10.0，攪拌1 h，在4 800 r·min-1條件下離心15 min。取上清液，用1 mol HCl調(diào)節(jié)至pH 4.3，在4 ℃條件下保持1 h。在4 800 r·min-1條件下離心15 min收集沉淀物，再用1 mol NaOH 調(diào)節(jié)至pH 7.0使沉淀物溶解。用透析袋(7 kDa)透析24 h，將樣品冷凍干燥。

1.3.2 起泡性條件優(yōu)化

(1) 預(yù)熱溫度

將JSPI(5%，w/v)溶于蒸餾水中，室溫下攪拌1 h。在50 ℃～80 ℃條件下，用磁力攪拌水浴鍋加熱30 min，用冰水浴快速冷卻至室溫，將樣品冷凍干燥。

(2) 超聲功率及超聲時(shí)間

將JSPI(5%，w/v)溶于蒸餾水中，室溫下攪拌1 h。分別在超聲功率200，400，600 W，超聲時(shí)間10，20，30 min(脈沖時(shí)間為2 s，關(guān)閉時(shí)間為2 s)條件下處理JSPI，超聲探頭在液體表面1.5 cm以下，冰水浴中進(jìn)行并每10 min更換1次冰水，處理后的樣品冷凍干燥[14]。

1.3.3 起泡性及泡沫穩(wěn)定性

參考Somruedee等[15]的方法測(cè)定起泡性。蛋白樣品(20 mg·mL-1)溶于0.01 mol磷酸緩沖液(pH 9.0)中，取15 mL蛋白溶液倒入50 mL量筒中。用高速分散機(jī)攪打1 min，轉(zhuǎn)速為20000 r·min-1。起泡能力以2 min后泡沫的體積與初始體積的百分比表示。泡沫穩(wěn)定性以30 min后泡沫的體積與2 min時(shí)泡沫體積的百分比表示。

起泡性(%)=[(V0-15)/15]×100;

泡沫穩(wěn)定性(%)=[(V1-15)/(V0-15)]×100;

其中V0是2 min時(shí)泡沫體積，V1是30 min時(shí)泡沫體積。

1.3.5 SDS-PAGE凝膠電泳

參考Ma等[16]的方法測(cè)定在還原和非還原條件下的SDS-PAGE。制備12%的分離凝膠和4%的濃縮凝膠。取30 μL蛋白溶液(2 mg·mL-1)，加入10 μL 4×含β-巰基乙醇或4×不含β-巰基乙醇的上樣緩沖液，沸水浴加熱7 min，離心2 min。在凝膠泳道加入10 μL樣品或5 μL Mark。電壓調(diào)整為80 V，15 min后再調(diào)至120 V，運(yùn)行40 min。用考馬斯亮藍(lán)(R-250)染色50 min，再用脫色液脫色至條帶清晰可見(jiàn)。

1.3.6 圓二色譜

參考Zheng等[17]的方法測(cè)定蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。用0.01 mol磷酸鹽(pH 9.0)緩沖液配制0.1 mg·mL-1的蛋白溶液，路徑長(zhǎng)度為1 mm，掃描波長(zhǎng)范圍為190～240 nm。在25 ℃條件下進(jìn)行測(cè)定，以0.01 mol磷酸鹽(pH 9.0)作為空白對(duì)照。采用Dichro Web網(wǎng)站的CONTIN程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行擬合分析并計(jì)算出二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3.7 熒光光譜

參考He等[18]的方法測(cè)定蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。用0.01 mol磷酸鹽(pH 9.0)緩沖液將蛋白樣品配制成0.1 mg·mL-1的蛋白溶液，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為2.5 nm，掃描速度1 200 nm·min-1，在25 ℃條件下記錄290～450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。

1.3.8 表面疏水性測(cè)定(H0)

參照Haskard等[19]的ANS探針?lè)y(cè)定蛋白質(zhì)的表面疏水性。蛋白樣品用0.01 mol磷酸鹽(pH 9.0)緩沖液配制成0.04～0.12 mg·mL-1的蛋白溶液。取50 μL 8.0 mmol·L-1的ANS加到4 mL的蛋白溶液中，激發(fā)波長(zhǎng)390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)470 nm。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白濃度作圖，斜率即為蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)(H0)。

1.3.9 電位、粒徑測(cè)定

蛋白樣品用0.01 mol磷酸鹽(pH 9.0)配制成0.1 mg·mL-1蛋白溶液，在25 ℃條件下測(cè)定溶液電位。蛋白樣品(0.1 g·mL-1)溶于蒸餾水中，遮光率為8%～12%，泵速為2000 r·min-1，分散相折射率和吸收參數(shù)分別為1.330和0.001[9]，測(cè)定樣品粒徑。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)使用SPSS Statistics 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，Tukey法計(jì)算平均值之間的顯著性差異(P<0.05)。用Origin 8.5軟件用于數(shù)據(jù)繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 起泡性條件優(yōu)化

從圖1(A)中，隨著預(yù)熱溫度的升高，JSPI的起泡能力先增強(qiáng)后下降，60 ℃時(shí)的起泡能力最好，為200%。50 ℃(55.95%)，60 ℃(57.71%)，70 ℃(47.71%)時(shí)的泡沫穩(wěn)定性沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，80 ℃時(shí)的泡沫穩(wěn)定性最差，為42.34%。圖1(B)中，起泡性隨超聲功率的增加而增加，600 W時(shí)的起泡能力為216.45%，泡沫穩(wěn)定性(66.79%)與400 W(63.39%)的沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。200 W處理的起泡能力(158%)和泡沫穩(wěn)定性(59.55%)最差。圖1(C)中，超聲20與30 min的起泡性無(wú)明顯差異(P>0.05)，均高于10 min時(shí)的起泡性。不同處理時(shí)間對(duì)泡沫穩(wěn)定性沒(méi)有顯著性差異。由以上分析得到最佳條件：預(yù)熱溫度60 ℃，超聲功率為600 W，超聲時(shí)間20 min。在此基礎(chǔ)上，還研究了60 ℃與600 W共同處理JSPI，探究JSPI起泡性與其結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。

其中(A)，(B)，(C)分別為不同預(yù)熱溫度、超聲功率及超聲時(shí)間對(duì)JSPI起泡性的影響。不同大寫(xiě)字母FC有顯著性差異，不同小寫(xiě)字母表示FS有顯著差異(P<0.05)。

2.2 起泡性及泡沫穩(wěn)定性

起泡性是指蛋白在快速攪打后吸附到水-空氣界面，分子部分展開(kāi)，大量空氣進(jìn)入，在氣-液界面形成一層薄而堅(jiān)韌的膜，并形成氣泡[6]。泡沫穩(wěn)定性可以通過(guò)在一定時(shí)間內(nèi)，泡沫體積變化量來(lái)表示，根據(jù)起泡能力和泡沫穩(wěn)定性測(cè)定泡沫的質(zhì)量[20]。影響起泡性的因素很多，如蛋白種類(lèi)、pH、表面疏水性、凈電荷等。圖2中，與未處理的JSPI相比，600 W超聲處理后的起泡能力增加了45.25%，泡沫穩(wěn)定性沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。超聲的空化效應(yīng)使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，并通過(guò)增加泡沫的粘結(jié)性和柔韌性改善起泡能力和泡沫性能[21]。Alejandro等[22]發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度超聲處理的蠶豆蛋白，起泡能力從145.8%增加至258.3%。Mei等[23]發(fā)現(xiàn)超聲處理的乳清蛋白，起泡能力提高了18%，泡沫穩(wěn)定性提高了35%。60 ℃處理JSPI的起泡能力增加了29.64%,泡沫穩(wěn)定性下降至61.81%。Chao等[24]發(fā)現(xiàn)豌豆蛋白在80 ℃～100 ℃處理后，在任何pH條件下其起泡能力都較低。在pH 5.0條件下，50 ℃和70 ℃處理都有較高的起泡能力。60 ℃+600 W超聲處理的JSPI起泡能力增加了58.44%，表明熱處理和超聲對(duì)JSPI起泡能力表現(xiàn)為協(xié)同作用，泡沫穩(wěn)定性下降至64.00%。Morales等[25]研究發(fā)現(xiàn)，超聲(750 W)與70 ℃，80 ℃，85 ℃共同處理大豆分離蛋白的起泡能力均高于單獨(dú)超聲或單獨(dú)溫度處理。適當(dāng)?shù)纳邷囟瓤梢愿纳瞥晫?duì)蛋白質(zhì)修飾的作用，從而進(jìn)一步提高起泡性[25]。

FC:起泡能力；FS：泡沫穩(wěn)定性。

2.3 SDS-PAGE凝膠電泳

圖3中，在非還原條件下，JSPI的分子量主要在17～26 kDa之間(Line 1)。由于JSPI中存在二硫鍵，在β-巰基乙醇作用下出現(xiàn)了新的條帶，主要集中在10～17 kDa之間(Line 5)。與未處理的JSPI相比，600 W處理的JSPI的電泳圖譜沒(méi)有發(fā)生明顯變化(Line 1與Line 3，Line 5與Line 7)，這表明600 W超聲不能改變使JSPI的分子量。Hu等[14]研究發(fā)現(xiàn)超聲處理的大豆分離蛋白的電泳圖譜沒(méi)有明顯變化。Flores-Jiménez等[11]也得出相似的結(jié)論。然而，Jambrak等[26]報(bào)道，蛋白分子量發(fā)生改變是由于超聲的空化效應(yīng)引起較高的剪切應(yīng)力和湍流效應(yīng)，導(dǎo)致蛋白分子結(jié)構(gòu)分裂所致。Resendiz-Vazquez等[27]研究得出超聲(200，400，600 W)可以使JSPI分子量發(fā)生變化。該結(jié)論與本研究結(jié)果不同，可能與蛋白的種類(lèi)、來(lái)源和超聲條件有關(guān)。經(jīng)過(guò)60 ℃處理的JSPI(Line 2,4,6,8)均出現(xiàn)了一條新的分子量條帶(a,d，b,e)，可能是加熱使可溶性蛋白分子聚集，形成大分子量蛋白。60 ℃+600 W處理的JSPI(Line 4， 8)在熱處理和超聲處理的共同調(diào)控下有條帶消失(c， f)，可能是熱處理后的可溶性蛋白在超聲的空化作用下空間結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致條帶消失。安然[28]研究發(fā)現(xiàn)，與未處理的相比，熱處理(60 ℃，80 ℃，100 ℃)的可溶性大豆分離蛋白進(jìn)行超聲處理(600 W)后，在電泳圖譜上可以看出11S蛋白的B亞基含量顯著降低。從圖譜中可以看出，熱處理和超聲都沒(méi)有破壞JSPI的二硫鍵。

非還原性條件：Line 1-4:JSPI；60 ℃；600 W；60 ℃+600 W;還原性條件：Line 5-8:JSPI；60 ℃；600 W；60 ℃+600 W。

2.4 圓二色譜

從表1中看出，JSPI的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為β-折疊和不規(guī)則卷曲。經(jīng)過(guò)處理的JSPI均表現(xiàn)出α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量下降，β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲含量上升。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)既取決于氨基酸的局部序列，也取決于分子不同部分之間的相互作用，超聲處理可以破壞這些相互作用，導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)變化[9]。熱處理對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的損失具有時(shí)間依賴(lài)性，較長(zhǎng)的加熱時(shí)間，二級(jí)結(jié)構(gòu)的損失更大。α-螺旋含量減少表明蛋白分子在加熱時(shí)發(fā)生變性，而β-折疊含量增加表明變性分子重新排列并結(jié)合成更穩(wěn)定的產(chǎn)物[29]。Fan等[30]研究發(fā)現(xiàn)，隨著熱處理時(shí)間增加，β-乳球蛋白的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量減少，β-折疊含量增加。較高的β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲含量會(huì)使蛋白分子柔性增加，結(jié)構(gòu)變松散，蛋白分子內(nèi)部的疏水位點(diǎn)暴露在環(huán)境中，疏水性增強(qiáng)，可以在一定程度上提高蛋白的起泡性[31]。計(jì)等[6]研究得出，大豆蛋白的起泡性與α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量成負(fù)相關(guān)，與β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲含量呈正相關(guān)。此外，β-折疊含量與蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，β-折疊含量增加可以誘導(dǎo)色氨酸殘基從親水環(huán)境轉(zhuǎn)移到疏水環(huán)境中，從而表現(xiàn)出更高的熒光強(qiáng)度[30]。

表1 4種蛋白樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量

2.5 熒光光譜

蛋白質(zhì)的熒光主要來(lái)自芳香族氨基酸，通過(guò)測(cè)量酪氨酸和色氨酸所處微環(huán)境中的變化，可以表征蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化[32]。從圖5中可以看出，600 W處理的JSPI的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，表明超聲可以促進(jìn)JSPI分子展開(kāi)，暴露了更多的色氨酸殘基，這導(dǎo)致微環(huán)境的非極性增加，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)[33]。60 ℃處理出現(xiàn)了最高的熒光強(qiáng)度和最大紅移量(△λ=3 nm)，表明熱處理對(duì)JSPI的結(jié)構(gòu)變化作用更為明顯，處于內(nèi)部疏水環(huán)境的色氨酸和酪氨酸殘基暴露出來(lái)。60 ℃+600 W處理的熒光強(qiáng)度有所下降，可能是60 ℃和600 W超聲共同作用,使JSPI發(fā)生較大的變性，導(dǎo)致部分色氨酸和酪氨酸暴露在親水環(huán)境中。熒光強(qiáng)度增強(qiáng)與圓二色譜結(jié)果中β-折疊含量的增加相對(duì)應(yīng)，進(jìn)一步可以證明，JSPI結(jié)構(gòu)變松散，內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露在分子表面[34]，疏水基團(tuán)的暴露導(dǎo)致疏水性增加，進(jìn)而可以改善JSPI的起泡性質(zhì)。

圖4 4種蛋白樣品的熒光光譜圖

2.6 表面疏水性(H0)

表面疏水性反映了疏水基團(tuán)的暴露，表面疏水性指數(shù)(H0)可以看作是蛋白分子表面疏水基團(tuán)數(shù)量的一個(gè)指標(biāo)，影響著蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)，較松散的蛋白結(jié)構(gòu)和多肽鏈的展開(kāi)可以暴露出更多的疏水腔和基團(tuán)，較高的疏水性可以改善蛋白質(zhì)的起泡性和乳化性[35]。圖5中，600 W處理的JSPI的H0增加了46.58%，表明超聲可以誘導(dǎo)JSPI分子展開(kāi)，減少分子間締合，使更多的疏水區(qū)域暴露在溶劑環(huán)境中[14]。60 ℃處理JSPI的H0增加了60.35%，熱變性可以將蛋白質(zhì)解離成亞單位，分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露出更多的疏水基團(tuán)[36]。F.Peyrano等[36]曾報(bào)道，在70°C，pH 10.0時(shí)，豇豆分離蛋白H0的最大增量為149%，90°C處理的H0增量為74%～81%。經(jīng)過(guò)60 ℃+600 W處理的JSPI的H0則有最大增量，為96.34%，表明熱處理和超聲對(duì)JSPI的H0也表現(xiàn)為協(xié)同作用。表面疏水性增加可以改善JSPI的起泡性。

圖5 4種蛋白樣品的表面疏水性(H0)

2.7 電位

蛋白質(zhì)溶液表面的基團(tuán)具有電離作用，在酸性溶液中帶正電荷，在堿性溶液中帶負(fù)電荷[37]。當(dāng)電位絕對(duì)值低時(shí)，表明溶液體系中的蛋白質(zhì)分子表面帶有負(fù)電氨基酸的含量低，表面電荷少，分子間容易聚集形成沉淀，導(dǎo)致溶液體系不穩(wěn)定；表面電荷越多，說(shuō)明蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力越強(qiáng)，通過(guò)破壞和抑制蛋白質(zhì)分散體的進(jìn)一步聚集，可以維持溶液體系的穩(wěn)定[38,39]，也有助于維持蛋白泡沫的穩(wěn)定性。從圖7中可以看出，600 W處理后JSPI的電位從-22.03 mV增強(qiáng)至-24.53 mV，這是因?yàn)檩^高強(qiáng)度的超聲作用會(huì)破壞蛋白質(zhì)分子聚集體，使帶有負(fù)電的氨基酸更多的暴露在蛋白分子表面，表面負(fù)電荷增加。Bahman等[40]曾報(bào)道,超聲后的小米蛋白濃縮物的電位從-32.9增強(qiáng)至-42.2 mV。60 ℃處理后JSPI的負(fù)電位值增加，說(shuō)明熱處理會(huì)出暴露更多的疏水氨基酸，蛋白質(zhì)分子表面電荷減少。60 ℃+600 W處理的負(fù)電位值最高，可能是兩種條件作用下，使更多的疏水氨基酸暴露在外部環(huán)境中，電荷量下降。負(fù)電位值增加，會(huì)導(dǎo)致溶液體系不穩(wěn)定，泡沫穩(wěn)定性下降。

圖6 4種蛋白樣品的電位圖

圖7 4種蛋白樣品的粒徑圖

2.8 粒徑

從圖8中看出，JSPI的粒子分布主要在1～100 nm之間，在0.5～1 nm之間有較少的分布。600 W處理后JSPI在0.5～1，1～100 nm粒徑峰升高，且1～100 nm的粒徑峰向粒徑小的方向偏移，說(shuō)明超聲作用可以將JSPI分解成更小的蛋白顆粒。Jambrak等[26]曾報(bào)道，在超聲頻率20 kHz條件下，乳清蛋白顆粒尺寸減小，比表面積增加，40 kHz處理的顆粒尺寸則顯著減小。60 ℃處理的JSPI在0.5-1 nm和1～10 nm處的粒徑峰下降，大于100 nm的粒徑體積增多，且在100 nm處出現(xiàn)了最高峰，表明熱處理使JSPI分子聚集形成了大分子蛋白顆粒。Xiong等[41]研究發(fā)現(xiàn)，熱處理后的牛奶血清蛋白的粒徑峰從68變化到92 nm，乳鐵蛋白和牛奶血清混合物的粒徑峰從79變化到125 nm。60 ℃+600 W處理JSPI的粒徑分布基本介于600 W處理和60 ℃處理之間,說(shuō)明超聲處理分散了部分60 ℃處理形成的大分子蛋白聚集體。Morales等[25]探究了大豆分離蛋白粒徑與起泡性的關(guān)系，超聲處理的大豆分離蛋白粒徑減小，同時(shí)起泡性也顯著增加。80 ℃，超聲和80 ℃處理后的粒徑增加，但起泡性也顯著增加。該研究指出，在較低的比例下，粒徑較高的蛋白群體也可以提高起泡性。本研究也得到相似的結(jié)論，粒徑減小或較低比例存在的大分子蛋白均可以增加JSPI的起泡性。粒徑的部分變化與SDS-PAGE圖譜中蛋白分子量的變化一致。

3 結(jié)論

本研究在最佳起泡性性條件下探究了結(jié)構(gòu)變化對(duì)JSPI起泡性的影響。起泡性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，60 ℃+600 W處理的JSPI起泡性增加了58.44%，高于600 W超聲(45.25%)和60 ℃ (29.64%)，表明兩者對(duì)JSPI起泡性表現(xiàn)為協(xié)同作用，但泡沫穩(wěn)定性沒(méi)有提高。結(jié)構(gòu)變化對(duì)起泡性有顯著的影響。SDS-PAGE結(jié)果表明，600 W超聲沒(méi)有改變JSPI分子量，60°C處理使部分可溶性蛋白分子聚集，形成了較大分子量蛋白。圓二結(jié)果表明，起泡性的增強(qiáng)與β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲含量增加有關(guān)，較高的β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲含量會(huì)使蛋白分子柔性增加，結(jié)構(gòu)變松散，疏水性增強(qiáng)，在一定程度上提高起泡性。熒光強(qiáng)度增強(qiáng)和表面疏水性(H0)增加進(jìn)一步說(shuō)明，起泡性增加與蛋白結(jié)構(gòu)變松散，內(nèi)部的疏水基團(tuán)的暴露有關(guān)。電位值會(huì)影響泡沫的穩(wěn)定性，電位絕對(duì)值越大表明蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力越強(qiáng)，可以有效阻止蛋白質(zhì)分散體的聚集，維持體系的穩(wěn)定。粒徑大小也在一定程度上影響起泡性，粒徑減小或在較低比例下，粒徑較大的蛋白分子均可以提高JSPI的起泡性。本研究采用預(yù)熱超聲技術(shù)JSPI起泡性進(jìn)行改性處理，期望拓寬JSPI的應(yīng)用范圍，促進(jìn)菠蘿蜜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，也為超聲改性蛋白方面提供一些新的理論參考。