2，6，9-三取代嘌呤衍生物三維定量構(gòu)效關(guān)系和靶點(diǎn)相互作用

賈 磊，朱財(cái)盛，2，麥曦*，馮麗華，杜巧麗，何玲，何衛(wèi)保，張其民

(1.南昌大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330006；2.中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203)

嘌呤是一類重要的生命活性物質(zhì)，參與生物體內(nèi)的新陳代謝過(guò)程、生命過(guò)程中的能量轉(zhuǎn)移、核酸合成以及多種生化反應(yīng)，具有廣泛的生物活性，對(duì)嘌呤進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾改造后能獲得抗腫瘤、抗病毒及抗炎等多種活性的藥物[1]，如抗代謝物巰嘌呤和巰鳥(niǎo)嘌呤是傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物[2-3]，嘌呤類核苷藥物奈拉濱、氟達(dá)拉濱、克拉利濱和克羅拉濱等均為廣泛用于臨床的癌癥治療藥物[4-5]。

對(duì)嘌呤母核的2，6，8，9位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾發(fā)現(xiàn)了多種作用機(jī)制的嘌呤類衍生物，主要有細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(cyclin dependent kinase,CDKs)[6-7]、熱休克蛋白90(Hsp90)抑制劑及DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑等；其中的N,N-二甲基腺嘌呤(6-DMAP)是最早應(yīng)用于臨床的嘌呤類CDKs抑制劑，而后進(jìn)一步篩選得到Olomoucine，其對(duì)CDK1(IC50=7.0 μmol·L-1)、CDK2(IC50=7.0 μmol·L-1)和CDK5(IC50=3.0 μmol·L-1)都有抑制作用，對(duì)Olomoucine進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造得到Olomoucine II，發(fā)現(xiàn)其對(duì)CDK1抑制活性顯著提高(IC50=0.1 μmol·L-1)[8]。Bukanov等[9]通過(guò)對(duì)Olomoucine II進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，設(shè)計(jì)合成出化合物R-CR8(IC50約為19.0 nmol·L-1)。Wu等[10]發(fā)現(xiàn)嘌呤類CDKs抑制劑Seliciclib對(duì)CDK1、CDK2、CDK5、CDK7都有很強(qiáng)的抑制作用，現(xiàn)已進(jìn)入多項(xiàng)II期臨床研究。MPC-3100是Myriad Pharmaceutiicals Inc公司研發(fā)的嘌呤類Hsp90抑制劑，并于2011年完成了I期臨床試驗(yàn)[11]；另一個(gè)嘌呤類Hsp90抑制劑Debio 0932已進(jìn)入臨床II期試驗(yàn)，其主要針對(duì)非小細(xì)胞肺癌的治療[12]。Barbara等[13]采用兩階段虛擬篩選的方法，分別從已建立的9-H嘌呤類和1H-吡唑并[3，4]嘧啶類拓?fù)洚悩?gòu)酶IIa抑制劑中篩選出具有微摩爾級(jí)別抑制活性的新化合物，發(fā)現(xiàn)化合物13和22對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)和人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)顯示出良好的抗增殖活性。

定量構(gòu)效關(guān)系(Quantitative Structure-Activity Relationship,QSAR)是一種借助化合物的理化參數(shù)或結(jié)構(gòu)參數(shù)，以數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)手段定量研究化合物結(jié)構(gòu)與生物活性、化合物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄等相關(guān)性質(zhì)的方法。常用的方法有二維QSAR(2D-QSAR)和三維QSAR(3D-QSAR)方法，2D-QSAR通過(guò)計(jì)算分子的物理化學(xué)參數(shù)，建立理化參數(shù)與活性之間的線性模型或非線性模型后，用于新化合物的活性預(yù)測(cè)、篩選及設(shè)計(jì)[14]。3D-QSAR是建立在分子的三維結(jié)構(gòu)與各類活性之間的關(guān)系，通過(guò)力場(chǎng)計(jì)算，建立分子體積、分子形狀、電荷分布與活性之間的關(guān)系，代表性的3D-QSAR方法有比較分子場(chǎng)分析法(Comparative Molecular Field Analysis,CoMFA)[15]與比較相似性指數(shù)分析法(Comparative Molecular Similarity Indices Analysis,CoMSIA)[16]等。易位體比較分子場(chǎng)法(Topomer CoMFA)是由Cramer等[17]基于二維片段分析開(kāi)發(fā)的新型3D-QSAR工具,Topomer CoMFA模型是將化合物分子結(jié)構(gòu)切割成若干個(gè)碎片，運(yùn)用靶點(diǎn)篩選技術(shù)，用其他基團(tuán)或者分子結(jié)構(gòu)替換原分子結(jié)構(gòu)中的某些碎片，利用搜集的活性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立的模型可以基于原碎片的虛擬篩選以及對(duì)分子的官能團(tuán)機(jī)構(gòu)進(jìn)行替換優(yōu)化。與CoMFA和CoMSIA不同的是，Topomer CoMFA是通過(guò)疊合替換規(guī)則完成的3D-QSAR準(zhǔn)備工作,具有重復(fù)性高的優(yōu)勢(shì)，利用Topomer CoMFA可快速建立模型并進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，為構(gòu)建構(gòu)效關(guān)系提供有利的理論依據(jù)。本文擬采用Topomer CoMFA研究2,6,9-三取代嘌呤類衍生物的3D-QSAR，并采用分子對(duì)接Surflex-dock法研究嘌呤類衍生物與CDK2的作用模式和作用機(jī)制，分析影響嘌呤類衍生物抗腫瘤活性的分子結(jié)構(gòu)特征，建立具有顯著預(yù)測(cè)能力的嘌呤類化合物活性預(yù)測(cè)模型，為創(chuàng)新藥物的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 數(shù)據(jù)集來(lái)源和結(jié)構(gòu)構(gòu)建

本論文合成了45個(gè)2，6，9-三取代嘌呤類衍生物，，結(jié)構(gòu)通式如圖1所示用MTT法測(cè)定所有化合物對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)抑制作用，計(jì)算各化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，采用改良寇式法計(jì)算各化合物的半數(shù)抑制濃度IC50值(μmol·L-1)，所有IC50值均將單位轉(zhuǎn)化為mol·L-1，然后均轉(zhuǎn)化為負(fù)對(duì)數(shù)pIC50(=-lgIC50)。用SYBYL進(jìn)行3D-QSAR建模和分子對(duì)接，使用Sketch Molecule模塊構(gòu)建了所有化合物圖像的3D結(jié)構(gòu)(表1和圖1)，利用Tripos力場(chǎng)和Gasteiger-Huckel電荷優(yōu)化每個(gè)分子(創(chuàng)建訓(xùn)練集，測(cè)試集和分子對(duì)接)，使用Powell梯度算法進(jìn)行結(jié)構(gòu)能量最小化，其收斂準(zhǔn)則為0.005 kcal·mol-1，最大值為10 000次迭代。

表1 嘌呤衍生物分子結(jié)構(gòu)和活性值a)

1.2 Topomer CoMFA模型的構(gòu)建

將45個(gè)化合物隨機(jī)分組，36個(gè)化合物組成訓(xùn)練集(80%)，9個(gè)化合物組成測(cè)試集(20%)。采用Topomer技術(shù)將化合物分子切割成幾個(gè)片段，并生成碎片三維結(jié)構(gòu)，碎片根據(jù)一定的經(jīng)驗(yàn)規(guī)則進(jìn)行調(diào)整后，進(jìn)行Topomer CoMFA分析，計(jì)算分子的電性參數(shù)和立體參數(shù)，以電性和立體參數(shù)為自變量，pIC50為因變量，采用偏最小二乘法(Partial least squares,PLS)進(jìn)行模型擬合，抽一法(Leave-One-Out)交互驗(yàn)證檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膬?nèi)部預(yù)測(cè)能力，測(cè)試集驗(yàn)證模型的外部預(yù)測(cè)能力。

1.3 分子對(duì)接

采用Surflex-dock研究化合物與CDK2的作用模式和作用機(jī)制，CDK2三維晶體結(jié)構(gòu)來(lái)源于PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www．rcsb．org/，登錄號(hào)1HCK)，為三磷酸腺苷(ATP)活性位點(diǎn)共晶結(jié)構(gòu)，經(jīng)提取ATP配體、去水、加氫等修飾后，以配體方式產(chǎn)生活性位點(diǎn)，設(shè)置Surflex-dock配體輸出構(gòu)象個(gè)數(shù)為20個(gè)，其余參數(shù)默認(rèn)，以原配體結(jié)構(gòu)作參照對(duì)比，進(jìn)行化合物與CDK2活性位點(diǎn)的對(duì)接及打分，以Total score為輸出構(gòu)象的總打分函數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 Topomer CoMFA建模結(jié)果和評(píng)價(jià)

Topomer CoMFA建模過(guò)程中，斷裂方式的選擇對(duì)模型的質(zhì)量影響較大，本研究中的嘌呤衍生物主要以6，9位取代為主，因此采用圖1所示對(duì)A鍵和B鍵進(jìn)行3種方式的Topomer切割斷裂后，將化合物分為2個(gè)或3個(gè)片段，計(jì)算各片段的電性參數(shù)和立體參數(shù)，采用PLS通過(guò)交叉驗(yàn)證得到最佳主成分?jǐn)?shù)n后進(jìn)行非交叉驗(yàn)證回歸，建立了3個(gè)3D-QSAR模型(表2)；同時(shí)，得到交叉驗(yàn)證系數(shù)Q2和非交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)r2，預(yù)測(cè)值的標(biāo)準(zhǔn)誤差SD以及顯著性檢驗(yàn)F。交叉驗(yàn)證系數(shù)Q2越大，相關(guān)系數(shù)r2越大，SD值越小，表示相關(guān)性越好，模型的預(yù)測(cè)能力越強(qiáng)。而F主要用于判斷樣本間是否有顯著差別，其值越大，說(shuō)明差別越顯著。對(duì)于TopomerCoMFA模型，一般Q2>0.5，r2>0.6，F(xiàn)>100,即表明所建模型具有較好的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和預(yù)測(cè)能力。

表2 Topomer CoMFA模型驗(yàn)證結(jié)果a)

圖1 嘌呤衍生物結(jié)構(gòu)及斷裂方式

Experimental pIC50

2.2 構(gòu)效關(guān)系分析

化合物3結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，以該化合物為樣本分子做3D-QSAR分析。如圖3(A)所示，化合物3按表2模型1的的斷裂方式切割為Ra及Rb二個(gè)分子片段，圖3(B)和圖3(D)分別為Ra及Rb的立體場(chǎng)三維等勢(shì)圖，圖中綠色區(qū)域表示此處引入體積較大的取代基有利于活性的提高，而黃色區(qū)域表示此區(qū)域不宜有大體積的取代基，在圖3(B)中，嘌呤8位附近聚集了較大體積黃色等勢(shì)域，表明8位不宜引入取代基；9位取代基的中段和遠(yuǎn)端聚集了大片綠色等勢(shì)域，表明引入較大體積取代基有利于化合物活性提高，如9位取代基為n=7碳鏈取代的化合物15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25的活性均高于相應(yīng)的n=3碳鏈取代的相應(yīng)化合物1，2，3，4，5，6，8，10，11，12，13，14，尤其是化合物24為活性最高的化合物；圖3(D)中，嘌呤6位取代基甲氨基處有體積較大的綠色區(qū)域，表明嘌呤6位可以引入體積較大取代基，因此用體積更大的丙胺和丁胺取代后生成的化合物4和5的活性逐漸提高。

圖3(C)和圖3(E)分別為Ra及Rb的靜電場(chǎng)三維等勢(shì)圖，圖中紅色等勢(shì)域表示引入負(fù)電性基團(tuán)有利于化合物活性的增加，而藍(lán)色等勢(shì)域表示此區(qū)域可引入正電性基團(tuán)；由圖3(C)可知，嘌呤2位取代基周圍被紅色等勢(shì)域所包圍，表明嘌呤2位宜引入負(fù)電性取代基，在本類化合物中，化合物28～44均為2位具有負(fù)電性氯取代基的衍生物，它們的活性與相應(yīng)沒(méi)有氯取代的化合物相比有部分化合物活性有增加，如28，29，34分子與相對(duì)應(yīng)在2位無(wú)氯取代基的1，2，13相比均增加了活性；但有的化合物引入氯取代基后活性降低了，如36，38，39分子與無(wú)氯取代基的15，25，18相比，活性均有所下降；這種現(xiàn)象與嘌呤環(huán)中雜原子氮對(duì)氯取代基影響有關(guān)，在鮑林電負(fù)性中氯的電負(fù)性大于氮的電負(fù)性，而在阿萊-羅周的電負(fù)性中卻是氮的電負(fù)性大于氯的電負(fù)性，即氮和氯的電負(fù)性是近似的，因此嘌呤2位的取代氯雖然為負(fù)電性，但對(duì)活性的影響并無(wú)規(guī)律性。由圖3(E)可知，Rb的近端和中端為紅色和藍(lán)色等勢(shì)域交錯(cuò)，表明此區(qū)域可引入一些極性取代基，遠(yuǎn)端為藍(lán)色等勢(shì)域，表明遠(yuǎn)端宜引入帶正電取代基，此結(jié)果表明在嘌呤6位宜引入一些極性基團(tuán)。

(A)化合物3的斷裂方式；(B)Ra的立體場(chǎng)等勢(shì)圖;(C)Ra的靜電場(chǎng)等勢(shì)圖;(D)Rb的立體場(chǎng)等勢(shì)圖;(E)Rb的靜電場(chǎng)等勢(shì)圖。

2.3 與靶點(diǎn)作用模式

腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞周期調(diào)控缺陷由CDKs/Cyclin失調(diào)直接或間接導(dǎo)致，即與Cyclin和CDKs過(guò)量表達(dá)或活性異常增強(qiáng)有關(guān)[19]。由于CDKs在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡中起關(guān)鍵作用，抑制CDKs可有效阻止癌細(xì)胞周期進(jìn)程，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[20]，研究嘌呤類衍生物對(duì)CDKs的作用模式可以探究其抗腫瘤作用機(jī)制，為其結(jié)構(gòu)改造提供依據(jù)，本文采用Surflex-dock分子對(duì)接法研究了本類嘌呤衍生物與ATP的活性位點(diǎn)CDK2的作用模式與機(jī)制，ATP的活性位點(diǎn)共晶結(jié)構(gòu)的PDB號(hào)為1HCK,是研究得最為深入的一個(gè)CDK亞型結(jié)構(gòu)[21-22]，其活性結(jié)構(gòu)主要分為絞鏈區(qū)、核糖/磷酸鹽結(jié)合區(qū)和Phe80口袋區(qū)，絞鏈區(qū)(殘基81-84)存在著一些氫鍵供體和受體的結(jié)合位點(diǎn)，其中最關(guān)鍵的為L(zhǎng)eu83和Glu81，ATP的腺嘌呤環(huán)能夠與Leu83和Glu81同時(shí)形成氫鍵，一些強(qiáng)效的抑制劑CDKs抑制劑，如R-roscovitine、Purvalanol B和Olmoucine等都能與Leu83的羰基之間形成氫鍵[23];CDKs結(jié)構(gòu)中有一個(gè)由Phe80形成的淺腔，雖然沒(méi)有被ATP占據(jù)，但是在一些抑制劑中都將疏水環(huán)伸向了該位點(diǎn)[22]；ATP中的磷酸基團(tuán)能與CDKs晶體結(jié)構(gòu)中的Lys33、Asp145作用，這一區(qū)域具有高度的親水性和柔性。對(duì)化合物進(jìn)行設(shè)計(jì)時(shí)將該親水性區(qū)域加以考慮可能對(duì)提高化合物的活性和選擇性有幫助。圖4(A)和4(B)分別為高活性化合物24和低活性化合物1的氫鍵作用圖，化合物24嘌呤環(huán)的6位芳環(huán)取代基的羥基能夠與絞鏈區(qū)的Leu83和Glu81形成2個(gè)氫鍵，嘌呤環(huán)的5位N與核糖/磷酸鹽結(jié)合區(qū)的Lys33形成1個(gè)氫鍵，9-位長(zhǎng)側(cè)鏈的酯基氧與Gln131形成第1個(gè)氫鍵；而化合物1僅形成2個(gè)氫鍵，分別為5位N與Asn132及9位側(cè)鏈?；跖cLys89形成，化合物1沒(méi)有與關(guān)鍵的氨基酸殘基Leu83和Glu81形成氫鍵，或許是其活性低于化合物24的原因之一，同時(shí)也與其6位僅為氯取代基有關(guān)，該結(jié)果表明在嘌呤6位宜引入能形成氫鍵的基團(tuán)。圖4(C)和4(D)是為化合物24和化合物1在CDK2活性口袋中的鍵合模式圖，化合物24將嘌呤6-位取代的芳環(huán)伸向Phe80和Phe82形成的疏水腔，9位取代側(cè)鏈伸向Asp145處的親水腔；而化合物1則是將嘌呤9-位取代側(cè)鏈伸向疏水腔，6-位取代氯伸向親水腔。

圖4 化合物24(A)(C)和化合物1(B)(D)與CDK2鍵合模式圖(綠色虛線代表氫鍵)

3 結(jié)論

本文通過(guò)Topomer CoMFA方法成功建立了2，6，9-三取代嘌呤類衍生物的3D-QSAR模型，其交叉驗(yàn)證系數(shù)為0.929，F(xiàn)檢驗(yàn)值為100.35，外部交叉驗(yàn)證系數(shù)為0.566，模型具有優(yōu)良的預(yù)測(cè)能力；3D-QSAR模型表明，嘌呤9-位引入較大體積取代基有利于化合物活性提高；嘌呤2-位宜引入一些負(fù)電性取代基；2，6，9-三取代嘌呤類衍生物與CDK2靶點(diǎn)的作用模式進(jìn)一步表明，嘌呤6-位如引入能形成氫鍵的取代基將有利于與CDK2絞鏈區(qū)的關(guān)鍵氨基酸殘基Leu83和Glu81形成氫鍵，因此綜合3D-QSAR模型和分子對(duì)接研究結(jié)果，嘌呤6-位引入較大體積并能形成氫鍵的取代基將有利于化合物活性的提高。