基于超高效液相串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜技術(shù)分析小扁豆豆殼多酚組成及其抗氧化活性

裴敏佳，王曉雅，熊 華，王鳳新，孫 永*

(1.南昌大學食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.江西人之初營養(yǎng)科技股份有限公司，江西 南昌 330052)

小扁豆(Lentil,Lensculinaris)是中國、加拿大、美國、印度等地主要糧食作物之一[1]，通過攝入小扁豆可以降低與生活方式相關(guān)的慢性疾病的患病風險，如降低人體膽固醇和血脂，降低結(jié)腸癌和2型糖尿病的發(fā)病率[2]，因此備受關(guān)注。美國國家心肺血液研究所(NHLBI)將食用小扁豆作為高血壓防治計劃(DASH)中的選項之一，以降低血壓和血液中的低密度脂蛋白[3]。小扁豆在加工過程中會產(chǎn)生一系列副產(chǎn)物，包括豆殼、破碎的子葉以及富含淀粉和蛋白質(zhì)的面粉，在工業(yè)生產(chǎn)中造成10%～21%的損失[4]。豆殼是其主要副產(chǎn)物，其含量約占整顆扁豆種子重量的8%～11%[5]。豆殼富含纖維素、微量元素以及植物化學物，具有很高的應(yīng)用價值。目前黃豌豆殼纖維已廣泛應(yīng)用于食品中，其對老年人健康的益處已被報道[6]。Kaya[7]等人發(fā)現(xiàn)在面條中添加10%的豆殼不僅可以提高其營養(yǎng)價值，還可以增加面條的吸水能力，膨脹體積。此外，在酸奶中添加一定量的小扁豆豆殼可以起到益生元的作用[8]。據(jù)報道，小扁豆豆殼富含多酚類成分[9]。然而，現(xiàn)有報道多集中于對小扁豆中游離態(tài)多酚進行分析，缺乏對小扁豆豆殼中結(jié)合態(tài)多酚組成及其抗氧化活性的研究。

多酚是植物重要的次生代謝物，具有抗炎、抗氧化等生物活性。根據(jù)結(jié)合方式的不同，可以將食品基質(zhì)中的多酚分為游離酚(包括可溶性共軛酚)以及結(jié)合酚兩種形態(tài)[10]。游離態(tài)多酚以單體形式存在于食品基質(zhì)中，易溶于水或有機溶劑，能被直接萃取。結(jié)合態(tài)多酚通過酯鍵、醚鍵、糖苷鍵等共價鍵與食品基質(zhì)(如細胞壁物質(zhì)、蛋白質(zhì)等)相結(jié)合，具有難萃取的特點[11]，需要借助酸水解、堿水解或者酶解的方法，將多酚與其它分子之間的連接斷開后再進行提取。結(jié)合酚不能被胃和小腸消化吸收，但可在結(jié)腸中經(jīng)微生物發(fā)酵釋放并產(chǎn)生生物活性[12]，相較于游離酚，結(jié)合酚類物質(zhì)經(jīng)腸道微生物作用后可能發(fā)揮更強的生物活性[13]。對不同形態(tài)多酚進行定性定量分析有助于進一步探索其構(gòu)效與功能的關(guān)系。

本研究以兩種不同顏色小扁豆豆殼為原料，基于化學法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定其基本成分組成，通過化學法和UPLC-ESI-QTOF-MS2鑒定其不同形態(tài)多酚結(jié)構(gòu)和測定其抗氧化活性。本研究可以為小扁豆豆殼酚類物質(zhì)在食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

小扁豆豆殼：來自兩種小扁豆(ADM Red和ADM Eston Green，分別為紅色扁豆和綠色扁豆)的加工廢棄物，由加拿大圭爾夫農(nóng)業(yè)和農(nóng)業(yè)食品研究和發(fā)展中心饋贈。樣品烘干后粉碎，于-20 ℃保存。

硫酸、石油醚、正己烷、甲醇：分析純，均購于西隴科學股份有限公司；福林酚：美國Sigma公司；沒食子酸(Gallic acid,GAE)、兒茶素(Catechin,CAE)、奎諾二甲基丙烯酸酯(Trolox)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、2,2-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、甲醇：色譜純，美國TEDIA試劑公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：ME204/02,梅特勒-拖利多儀器(上海)有限公司；高速離心機：LXJ-IIB，上海安亭科學儀器廠；冷凍干燥機：LGJ-18，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；自動凱氏定氮儀：K9840，濟南海能儀器股份有限公司；純水機：PTC-MBR-M，上海和泰儀器有限公司；全自動氨基酸分析儀：S-433D，德國Sykam公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：8860/5977，美國安捷倫公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RV10，德國IKA公司；酶標儀：Synergy H1，美國Bio Tek儀器公司；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：6545 LC/Q-TOF，美國安捷倫公司

1.2 方法

1.2.1 基礎(chǔ)營養(yǎng)成分測定

蛋白質(zhì)含量的測定參照《GB 5009.5-2016食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》中的“凱氏定氮法”[14]，蛋白質(zhì)換算系數(shù)為6.25；粗脂肪含量的測定參照《GB 5009.6-2016食品安全國家標準食品中脂肪的測定》中的“索氏抽提法”[15]；灰分的測定參照《GB 5009.4-2016食品安全國家標準食品中灰分的測定》[16]。

1.2.2 脂肪酸組成

樣品油脂甲酯化參考馮明菊[17]等人的方法。GC條件如下：氣相色譜柱：DB-FATWAX UI(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，流速：1 mL·min-1，進樣口溫度230℃，載氣：氦氣，升溫程序為40℃保持2 min，55 ℃/min升溫至170℃，保持25 min后以10℃/min的速率上升到215℃，保持25 min，分流比為20：1。MS條件：EI離子源，70 eV電子能量，掃描方式為全掃描，質(zhì)量掃描范圍35～500 amu。脂肪酸的鑒定是基于與脂肪酸甲酯的標準化合物相比的保留時間，通過面積歸一法進行定量。

1.2.3 游離氨基酸測定

稱取1g左右樣品，用50 mL 0.01N鹽酸浸提30 min，搖勻后過濾，準確吸取濾液2 mL，加入2 mL 8%磺基水楊酸，混勻，靜置15 min，3000 r·min-1離心20 min，取上清液過0.45 μm膜后上機檢測。

1.2.4 游離酚的提取

游離酚的提取參考Guo[18]等人的方法，樣品于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 結(jié)合酚的提取

結(jié)合酚的提取參考Chen[10]等人的堿水解法，樣品于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 總酚含量測定

總酚含量的測定采用福林酚比色法[19]。以沒食子酸為標準品制作標準曲線，所有測定執(zhí)行3次重復(fù)，結(jié)果以每克豆殼干樣品中沒食子酸當量(mg GAE/g DW)表示。

1.2.7 總黃酮含量測定

總黃酮含量的測定采用NaNO2-AlCl3法[20]。以兒茶素為標準品制作標準曲線，所有測定執(zhí)行3次重復(fù)，結(jié)果以每克豆殼干樣品中兒茶素當量(mg CAE/g DW)表示。

1.2.8 抗氧化能力測定

(1) DPPH自由基清除能力測定 參考Zhang[21]等人的方法，結(jié)果以每克豆殼干樣品中Trolox當量(μmol TE/g DW)表示。

(2) ABTS自由基清除能力測定 參考Zhang[21]等人的方法，結(jié)果以每克豆殼干樣品中Trolox當量(μmol TE/g DW)表示。

(3) 鐵離子還原能力測定 參考Li[22]等人的方法并稍作修改。簡單來說，10 μL豆殼多酚提取物與300 μL的Fe-TPTZ試劑反應(yīng)，并在室溫下反應(yīng)5 min后于593 nm波長條件下測定吸光度值。以FeSO4為標準品制作標準曲線，所有測定執(zhí)行3次重復(fù)，結(jié)果以每克豆殼干樣品中FeSO4當量(mmol Fe/g DW)表示。

1.2.9 UPLC-ESI-QTOF-MS2鑒定酚類組成

參考Sun[19]等人的方法，稍作修改。具體實驗條件如下：

液相色譜條件：采用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(2.1×100 mm，1.8-Micron，Agilent.)。流動相由含0.1%甲酸的水溶液(A)和含0.1%甲酸的95%甲醇/5%乙腈(B)組成。溶劑梯度如下：0～5 min，5%～12%B；5～15 min，12%～23%B；15～30 min，23%～50%B；30～40 min，50%～80%B；40～42 min，80%～100%B；42～44.5 min，100%～0%。后運行6 min以重新平衡色譜柱。進樣量10 μL，流速設(shè)置為0.3 mL·min-1，柱溫控制在40℃。檢測波長為280 nm。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，負離子模式，電壓：175 v，一級質(zhì)荷比100～1500，碰撞能量25v；自動MS/MS模式下掃描m·z-1100～1500，設(shè)置多級碰撞能量10,20,30,40,50 V。數(shù)據(jù)獲取和加工的質(zhì)譜軟件為Qualitative Analysis 10.0。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示，采用Origin軟件作圖，并采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，通過單因素方差分析進行顯著性差異分析(P<0.05)，并用Pearson法進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆殼基礎(chǔ)成分分析

兩種豆殼的基礎(chǔ)營養(yǎng)成分含量見表1。紅色小扁豆豆殼中粗脂肪含量高于綠色小扁豆豆殼，而灰分和粗蛋白含量均低于后者，結(jié)果差異均具有顯著性(P<0.05)。兩種豆殼中粗脂肪含量分別為1.03%±0.01%和0.81%±0.03%，低于文獻報道的普通大豆豆殼的脂肪含量(約15 mg·g-1DW)[23]。兩種豆殼中粗蛋白含量分別為18.66%±0.25%和20.42%±0.19%，高于文獻報道的9.7%[24]，主要原因是豆殼脫殼過程會伴隨破碎的子葉以及富含淀粉和蛋白質(zhì)的面粉的產(chǎn)生[9]，使得樣品中粗蛋白含量較高。這一現(xiàn)象在Wang[25]等人的研究中得到驗證，該團隊對小扁豆脫殼廢棄物中的豆殼的蛋白質(zhì)含量測定，發(fā)現(xiàn)其含量為27.6%，可能是由于小扁豆

表1 豆殼中基礎(chǔ)營養(yǎng)成分含量

品質(zhì)和脫殼工藝的差異。由此可知，小扁豆豆殼含有一定量的基礎(chǔ)營養(yǎng)成分，可被用于食品原料來源。

2.2 豆殼油脂中脂肪酸組成

豆殼油脂脂肪酸組成見表2。在紅色扁豆豆殼中檢測到9種脂肪酸，綠色扁豆豆殼中檢測到10種脂肪酸，兩種豆殼中不飽和脂肪酸為主要成分，分別占85.85%和84.09%，其中單不飽和脂肪酸分別占20.81%和23.24%，多不飽和脂肪酸分別占65.04%和60.85%，亞油酸是豆殼中主要的多不飽和脂肪酸，占56.62%和51.16%，其次為油酸，分別占20.13%和22.2%。不飽和脂肪酸具有降低心血管疾病發(fā)病風險、維持人體正常生理功能的作用[26]，在飲食中添加豆殼有助于提高人體對不飽和脂肪酸的攝入量。結(jié)果表明，小扁豆豆殼富含不飽和脂肪酸，可作為食品組分發(fā)揮健康效應(yīng)。

表2 豆殼油脂脂肪酸組成

2.3 豆殼游離氨基酸組成

游離氨基酸是以游離態(tài)存在的單個氨基酸分子，可被直接吸收利用。豆殼中游離氨基酸組成見表3。兩種豆殼中的游離氨基酸分布相似，精氨酸作為為條件性必需氨基酸，在兩種豆殼中的含量最豐富，其次是絲氨酸和谷氨酸。兩種豆殼必需氨基酸含量分別為84.11和115.11 mg·g-1DW，約占總氨基酸含量的17.39%和17.60%。除了亮氨酸、酪氨酸和賴氨酸外，兩種豆殼的氨基酸成分均具有顯著性差異(P<0.05)，綠色小扁豆豆殼含有更高的必需氨基酸和總氨基酸含量。結(jié)果表明，小扁豆豆殼富含必需氨基酸，可作為食品組分發(fā)揮健康效應(yīng)。

表3 豆殼中游離氨基酸組成

2.4 豆殼中總酚、總黃酮含量

豆殼中不同酚類組分的總酚、總黃酮含量見表4。兩種豆殼游離態(tài)總酚含量分別為(8.32±0.24)和(12.75±0.12) mg GAE/g DW，高于結(jié)合態(tài)的總酚含量((3.68±0.05)和(4.30±0.10) mg GAE/g DW)，總黃酮含量分別為(5.28±0.49)和(8.44±0.23) mg CAE/g DW，高于結(jié)合態(tài)總黃酮含量((2.87±0.05)和(3.62±0.13) mg CAE/g DW)。紅色小扁豆豆殼在不同組分中的總酚、總黃酮含量均低于綠色小扁豆豆殼。而相較于其他植物性加工廢棄物原料如紅松殼(4.05 mg·g-1DW)[27]、榴蓮殼(1.86 mg·g-1DW)[28]，豆殼具有更高的酚類含量，可作為功能性食品的原料。

表4 豆殼中總酚、總黃酮含量

2.5 豆殼酚類物質(zhì)抗氧化能力

豆殼酚類物質(zhì)的DPPH、ABTS自由基清除能力和總還原能力FRAP結(jié)果見圖1。綠色小扁豆豆殼游離酚組分抗氧化能力高于紅色小扁豆豆殼，且兩種豆殼中游離態(tài)多酚抗氧化能力均高于結(jié)合態(tài)多酚(P<0.05)，表明豆殼多酚具有很強的抗氧化活性，可作為食品中抗氧化劑的來源。

(A)DPPH清除能力；(B)ABTS自由基清除能力；(C)鐵離子還原能力。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.6 多酚、黃酮含量與抗氧化能力之間的相關(guān)性

由表5可知，兩種豆殼多酚、黃酮含量與3種抗氧化能力之間均存在顯著正相關(guān)，且ABTS、FRAP與多酚含量間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(R2>0.99)，此結(jié)果與劉仙俊[29]等人發(fā)現(xiàn)一致，說明豆殼的抗氧化能力主要與多酚含量有關(guān)，并且與多酚化合物種類和結(jié)構(gòu)存在一定關(guān)系。此外，朱昱琳[30]等人研究發(fā)現(xiàn)長黑青稞的多酚含量與3種抗氧化能力之間均存在顯著正相關(guān)(R2=0.998,0.935和0.966)。Baojun Xu[31]等人研究發(fā)現(xiàn)扁豆DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力FRAP主要和酚酸類物質(zhì)有關(guān)(P<0.05)。

表5 豆殼多酚含量與抗氧化能力的相關(guān)性

2.7 豆殼酚類化合物組成

豆殼游離酚和結(jié)合酚的鑒定結(jié)果如圖2和表6所示，共鑒定出12種游離酚和9種結(jié)合酚。具體結(jié)果如下：

表6 豆殼中游離酚、結(jié)合酚物質(zhì)鑒定

圖2 豆殼游離酚(A)、結(jié)合酚(B)280 nm波長處的DAD圖

在游離酚組分中，化合物1的質(zhì)荷比為m·z-1169.0120，其二級圖譜如圖3(A)所示，主要離子碎片為m·z-1125.0236，推測為失去一分子CO2形成，根據(jù)參考文獻[8]該物質(zhì)被鑒定為沒食子酸?；衔?分子離子為m·z-1305.0671，其主要離子碎片在m·z-1139.0388和m·z-1125.0238，通過與Massbank數(shù)據(jù)庫比對，初步判定其為沒食子酰兒茶素[32]?；衔?，4，5，8為4種低聚原花青素物質(zhì)，化合物3分子離子峰為m·z-1593.1285，其主要碎片離子峰包括m·z-1407.0755，m·z-1289.0713和m·z-1125.0238，其中最強離子峰為m·z-1289.0713(去質(zhì)子化表/兒茶素特征峰)，根據(jù)文獻報道[33]，初步鑒定為原飛燕草素二聚體；同理，化合物4和8為兩種B型原花青素二聚體，其二級圖譜見圖3(B)，化合物5的分子離子峰為m·z-1865.1956，其主要碎片離子為m·z-1577.1351和m·z-1289.0697，表明該物質(zhì)由黃烷醇二聚體和單體構(gòu)成，因此判定為原花青素三聚體?；衔?分子離子峰為m·z-1451.1256，主要離子碎片包括m·z-1137.0239和m·z-1125.0239，其可能的裂解規(guī)律見圖3(C)，初步鑒定其為兒茶素葡萄糖苷[19]?；衔?分子離子峰為m·z-1163.0397，其片段離子為m·z-1119.0500，為失去一分子CO2后形成，對比文獻初步鑒定為對香豆酸[19]?；衔?分子離子為m·z-1193.0503，主要離子峰為m·z-1178.0263([M-H-CH3]-)，m·z-1134.0367([M-H-CH3-CO2]-)，通過與Massbank數(shù)據(jù)庫比對，判定該物質(zhì)為阿魏酸[32]。化合物10分子離子峰為m·z-1901.2608，主要離子峰為m·z-1755.2032，可能是脫去一分子脫氧己糖后形成，根據(jù)文獻報道，初步判定該物質(zhì)為山奈酚四葡萄糖苷化合物[21]；同理，化合物11分子離子峰為m·z-11047.2970，主要碎片離子峰為m·z-1901.2382，m·z-1755.1993和m·z-1284.0314，可能是該物質(zhì)連續(xù)脫去一分子脫氧己糖后形成，初步鑒定該物質(zhì)為山奈酚糖苷衍生物[34]。化合物12(m·z-1=447.0923)的二級圖譜見圖3(D)，在m·z-1285.0397處產(chǎn)生了碎片離子峰，推測是由于糖苷鍵裂解形成，初步鑒定為木犀草素糖苷[20]。

(A)沒食子酸;(B)原花青素二聚體;(C)兒茶素葡萄糖苷;(D)木樨草素葡萄糖苷

在結(jié)合酚組分中，化合物1，3，6的分子離子峰均為m·z-1137.0235，且含有主要離子碎片m·z-1109.0292，推測為失去一分子CO形成，初步判定三種物質(zhì)均為對羥基苯甲酸衍生物[19]?；衔?和5分子離子峰為m·z-1153.0191，主要離子碎片為m·z-1125.0239，m·z-1109.0293，推測分別為失去一分子CO和CO2后形成，初步判斷該物質(zhì)為二羥基肉桂酸衍生物，化合物4的分子離子峰為m·z-1289.0720，對比參考文獻[19]中的出峰時間和Massbank數(shù)據(jù)庫[32]中裂解規(guī)律，初步判定該物質(zhì)為兒茶素。

多酚的抗氧化能力主要與其B環(huán)上的羥基取代基個數(shù)、位置以及聚合度有關(guān)。研究表明，在酚酸類物質(zhì)中，含有三個鄰位酚羥基的化合物抗氧化能力明顯強于只含有兩個或一個酚羥基的化合物，含有鄰位酚羥基的化合物抗氧化能力強于含有間位酚羥基化合物[35]，本實驗中游離酚組分含有沒食子酸(3,4,5-三羥基苯甲酸)，其抗氧化能力強于結(jié)合酚中的對羥基苯甲酸衍生物和二羥基肉桂酸衍生物。同時，游離酚組分中還存在四種低聚原花色素，劉彥霞[36]等人發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，低聚原花色素的抗氧化能力隨聚合度的增大而增強，這也可能是導致游離酚抗氧化能力強的原因。綜上所述，小扁豆豆殼中除含有豐富的游離態(tài)多酚外，還含有具有較高活性的結(jié)合態(tài)多酚，其可能被體內(nèi)消化酶和腸道微生物進一步利用，并釋放出來，提高其健康效益。

3 結(jié)論

本研究首先對兩種小扁豆殼的主要營養(yǎng)成分進行了分析，發(fā)現(xiàn)其含有較高的粗蛋白、不飽和脂肪酸和多種人體必需氨基酸。而對豆殼中游離態(tài)和結(jié)合態(tài)多酚進行進一步研究發(fā)現(xiàn)，兩種豆殼均含有豐富的酚類成分，且無論是游離態(tài)還是結(jié)合態(tài)多酚的含量均與其抗氧化能力呈顯著正相關(guān)。據(jù)報道，多酚的抗氧化能力主要與其B環(huán)上的羥基取代基個數(shù)、位置以及聚合度有關(guān)，通過UPLC-ESI-QTOF-MS2對豆殼中游離和結(jié)合酚組成進行結(jié)構(gòu)表征，發(fā)現(xiàn)游離酚中主要含有羥基苯甲酸、羥基肉桂酸、黃酮類化合物及其糖苷化合物，結(jié)合酚中主要含有羥基苯甲酸、二羥基苯甲酸、黃酮類及其糖苷化合物。綜上所述，小扁豆豆殼作為食品加工副產(chǎn)物具有豐富的酚類成分，本研究的結(jié)果為進一步開發(fā)和應(yīng)用小扁豆豆殼提供了科學依據(jù)。