煙粉虱細(xì)胞色素CYP6EM1基因的克隆及對(duì)吡蟲啉抗性的作用

趙倩楠 黃明嬌 危學(xué)高 楊靜 杜田華 殷城 向文勝 楊鑫 張友軍

摘要 煙粉虱是一種世界性農(nóng)業(yè)害蟲，其防治手段以化學(xué)防治為主，新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉常年用于防治煙粉虱，田間煙粉虱已經(jīng)形成嚴(yán)重的抗藥性。本研究通過(guò)分析煙粉虱吡蟲啉抗性和敏感種群，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素CYP6EM1基因在吡蟲啉抗性品系中上調(diào)了4.7倍，進(jìn)而克隆了其全長(zhǎng)基因，進(jìn)行了熒光定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)該基因在吡蟲啉抗性煙粉虱3齡若蟲期和雄蟲成蟲期過(guò)量表達(dá)，并且在抗性成蟲胸部和腹部過(guò)量表達(dá)。最后通過(guò)RNA干擾的方法使成蟲的CYP6EM1基因表達(dá)量下降了54.8%，之后發(fā)現(xiàn)當(dāng)煙粉虱暴露于吡蟲啉時(shí)死亡率顯著升高了3965%，這表明CYP6EM1與煙粉虱對(duì)吡蟲啉抗性的形成相關(guān)。研究結(jié)果對(duì)于揭示煙粉虱對(duì)吡蟲啉產(chǎn)生抗性的機(jī)制有幫助，也為煙粉虱抗性水平田間監(jiān)測(cè)及煙粉虱綜合治理提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 煙粉虱; 吡蟲啉; 細(xì)胞色素P450; RNA干擾

中圖分類號(hào)： S 481.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.

2020279

Cloning of cytochrome P450 gene CYP6EM1 and its function in imidacloprid resistance in whitefly， Bemisia tabaci

ZHAO Qiannan1， HUANG Mingjiao2， WEI Xuegao2， YANG Jing2， DU Tianhua2，YIN Cheng2， XIANG Wensheng1， YANG Xin2， ZHANG Youjun1，2*

（1. College of Life Science， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China; 2. Institute of Vegetables

and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China）

Abstract

Whitefly， Bemisia tabaci， is a global harmful pest， and insecticides were widely used to control this pest. Imidacloprid， one of the neonicotinoid insecticides， has been used to control whitefly for many years. However， resistance to imidacloprid has been developed in field strains. In this study， the imidacloprid resistant and susceptible populations were compared， and a cytochrome P450 gene， CYP6EM1 was found to be over-expressed in resistant strain for 4.7 fold. The full length of CYP6EM1 was cloned and the mRNA expression level was analyzed by qRT-PCR. The results showed that CYP6EM1 was over-expressed in the third instar nymph and male adult of B.tabaci of imidacloprid resistance， and abound in thorax and abdomen of resistant adult. Moreover， the expression level of CYP6EM1 gene in adults was reduced by 54.8% by RNA interference. Then， it was found that the mortality of B.tabaci significantly increased by 39.65% when exposed to imidacloprid. This study is conducive to revealing the imidacloprid resistance mechanism of B.tabaci and provides a theoretical significance to determine the status of imidacloprid resistance in B.tabaci in the field and further establish the IPM strategies for whiteflies.

Key words

Bemisia tabaci; imidacloprid; cytochrome P450; RNA interference

煙粉虱Bemisia tabaci是一種世界性園藝害蟲，寄主植物廣泛，目前已經(jīng)報(bào)道的寄主植物已經(jīng)超過(guò)600多種，具有廣泛的植物適應(yīng)性[1]。煙粉虱為害主要有三種途徑：直接吸食植物汁液使得植物生長(zhǎng)緩慢，嚴(yán)重時(shí)萎蔫;分泌蜜露誘發(fā)煤污病影響植物光合作用;傳播植物病毒，特別是植物雙生病毒，導(dǎo)致大面積植株矮小，結(jié)實(shí)率降低甚至絕產(chǎn)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)危害[2-4]。

煙粉虱的防治以化學(xué)防治為主，由于煙粉虱是一種刺吸性小型蔬菜害蟲，主要在植物葉片背部刺吸植物汁液，傳統(tǒng)的觸殺型殺蟲劑很難防治煙粉虱，而具有植物內(nèi)吸性的新煙堿類殺蟲劑是防治煙粉虱等刺吸性害蟲的首選藥劑，對(duì)煙粉虱成蟲及若蟲均有很好的防效[5]。其中吡蟲啉作為第一代新煙堿類殺蟲劑廣泛用于防治煙粉虱，但是隨著吡蟲啉長(zhǎng)期、大量的施用，導(dǎo)致了嚴(yán)重的抗藥性[5-8]。2007年在我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)煙粉虱對(duì)吡蟲啉產(chǎn)生抗藥性;雖然北京和新疆的煙粉虱對(duì)吡蟲啉敏感，但是浙江、江蘇和湖北的煙粉虱對(duì)其產(chǎn)生了中到高水平的抗性，抗性倍數(shù)（抗性倍數(shù)=抗性種群的LC50/敏感參考種群的LC50）達(dá)到23～84倍[9]。2009年采集自江蘇省的煙粉虱對(duì)吡蟲啉表現(xiàn)出極高的抗性，抗性倍數(shù)達(dá)1 900倍[10]。大量的田間煙粉虱抗性水平監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，自然環(huán)境中的煙粉虱對(duì)吡蟲啉產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性[11]。

害蟲產(chǎn)生抗藥性的機(jī)制主要有兩種，分別為藥物靶標(biāo)不敏感導(dǎo)致的靶標(biāo)抗性和解毒酶過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致的解毒抗性。靶標(biāo)抗性的典型研究為褐飛虱乙酰膽堿受體突變（Y151）導(dǎo)致吡蟲啉在褐飛虱體內(nèi)的結(jié)合能力減弱，從而形成抗藥性[12];另外田間蚜蟲乙酰膽堿受體突變（R81T）導(dǎo)致蚜蟲對(duì)吡蟲啉抗性水平顯著升高[13]。煙粉虱產(chǎn)生抗藥性的機(jī)制主要集中在解毒酶過(guò)量表達(dá)，尚未有靶標(biāo)受體突變導(dǎo)致的抗藥性相關(guān)報(bào)道。例如CYP6CX1顯著高表達(dá)可能與福建省上街鎮(zhèn)的田間煙粉虱對(duì)氰戊酸酯、毒死蜱和阿維菌素的抗性相關(guān)[14]。田間煙粉虱對(duì)吡蟲啉產(chǎn)生抗性與2個(gè)細(xì)胞色素P450基因（CYP6CM1和CYP4C64）的表達(dá)量增加有關(guān)[15]。CYP6CM1基因過(guò)量表達(dá)，在B型煙粉虱和田間危害嚴(yán)重的Q型煙粉虱中形成抗藥性，它能將吡蟲啉代謝成毒力更低的羥基化吡蟲啉[15-17]。

前期研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)室內(nèi)飼養(yǎng)的煙粉虱暴露于吡蟲啉時(shí)CYP6EM基因的表達(dá)水平提高[18]，但是否能在煙粉虱種群形成抗藥性尚不得知。基于煙粉虱基因組序列克隆獲得煙粉虱CYP6EM1基因的全長(zhǎng)序列，通過(guò)熒光定量PCR分析了該基因在煙粉虱不同發(fā)育齡期和組織中的表達(dá)量，并且分析該基因在煙粉虱吡蟲啉抗敏品系中的表達(dá)量，最后通過(guò)RNA干擾技術(shù)研究了該基因在吡蟲啉抗性中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試煙粉虱

供試煙粉虱來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所一直飼養(yǎng)的Q型煙粉虱種群，于溫室內(nèi)飼養(yǎng)在棉花Gossypium herbaceum‘DP99B上，其中吡蟲啉敏感種群一直未接觸任何殺蟲劑，用吡蟲啉汰選獲得的抗性種群，其吡蟲啉抗性倍數(shù)約為42.5倍（表2）。溫室飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃、相對(duì)濕度（70±5）%、光周期L∥D=14 h∥10 h。

1.2 供試殺蟲劑

70%吡蟲啉水分散粒劑（WG），拜耳作物科學(xué)有限公司。

1.3 煙粉虱生物測(cè)定

煙粉虱成蟲生物測(cè)定采用浸液法，具體操作參考Feng等[19]的方法。吡蟲啉藥劑配制6個(gè)濃度，分別是50、100、200、400、800、1 600 mg/L和1組空白對(duì)照，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，在蒸餾水中加入0.01%曲拉通，便于藥劑在葉片表面附著。指形管底部平鋪2%的液態(tài)瓊脂，待凝固后并且管壁水蒸氣晾干，同時(shí)用直徑22 mm的打孔器打取棉花葉片，每片浸藥10 s，待晾干后輕放于指形管的瓊脂上方，每管接入20～30頭煙粉虱，用棉塞封口。將整個(gè)裝置于培養(yǎng)箱（溫度25℃，光周期L∥D=14 h∥10 h）中倒置，48 h后檢測(cè)生測(cè)結(jié)果。

1.4 提取RNA及合成cDNA

用吸蟲管從養(yǎng)蟲籠中取50頭煙粉虱成蟲，液氮速凍5 min后用TRizol法提取RNA，利用分光光度計(jì)檢測(cè)樣品濃度以及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，并且參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄合成試劑盒說(shuō)明書合成cDNA。

1.5 克隆CYP6EM1基因及序列分析

CYP6EM1（BTA005348.1）基因全長(zhǎng)通過(guò)煙粉虱基因組序列獲得，擴(kuò)增引物CYP6EM1-F/R（表1）用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以煙粉虱cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：1.0 μL cDNA，125 μL Taq酶 mix，10 μmol/L的上、下游引物各05 μL，105 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 5 min;95℃變性 30 s，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán);72℃再延伸10 min。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后將目的條帶切下，用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Promega）進(jìn)行膠回收，連接回收產(chǎn)物到pEASY-T1克隆載體上，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選陽(yáng)性克隆，送北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，在NCBI上比較分析測(cè)序結(jié)果。利用ExPASy翻譯工具Translate （http：∥web.expasy.org/translate/） 推斷蛋白序列。利用ExPASy蛋白組學(xué)工具Compute pI/Mw （http：∥ca.expasy.org/tools/pi_tool.html） 預(yù)測(cè)分子量（Mw） 和等電點(diǎn)（pI）。通過(guò)ClustalW[20]比對(duì)，利用MEGA 7.0的最大似然法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap重復(fù)取樣次數(shù)為1 000，分析CYP6EM1基因在不同昆蟲間的進(jìn)化關(guān)系。

1.6 分析CYP6EM1基因表達(dá)量

分別收集煙粉虱卵、1～4齡若蟲、雌性和雄性成蟲，每個(gè)齡期收集3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，卵的1個(gè)生物學(xué)重復(fù)收集700粒，各個(gè)齡期若蟲的1個(gè)生物學(xué)重復(fù)收集100頭，成蟲的1個(gè)生物學(xué)重復(fù)收集50頭。再分別收集煙粉虱成蟲的頭部、胸部和腹部，每個(gè)部位收集3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，頭的1個(gè)生物學(xué)重復(fù)收集500頭，胸和腹的1個(gè)生物學(xué)重復(fù)收集150頭。分別提取RNA，取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于研究CYP6EM1基因在吡蟲啉抗性煙粉虱不同齡期和組織的表達(dá)量。對(duì)于吡蟲啉抗性和敏感煙粉虱

種群，比較它們成蟲階段的差異。依據(jù)克隆獲得的CYP6EM1基因全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)熒光定量PCR（qRT-PCR）引物CYP6EM1-qF/-qR（表1），煙粉虱核糖體蛋白L29（ribosomal protein L29， RPL29）和延伸因子（elongation factors-1α，EF-1α）作為內(nèi)參基因。qRT-PCR采用SYBR Green I染料進(jìn)行，20 μL反應(yīng)體系：1.0 μL cDNA模板，10 μL 2×SuperReal PreMix Plus， 10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，7.6 μL RNase-free ddH2O，0.4 μL 50×ROX Reference Dye。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。qRT-PCR引物的擴(kuò)增效率通過(guò)3倍梯度稀釋的cDNA模板的Ct值來(lái)計(jì)算。根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算在煙粉虱不同發(fā)育齡期和組織，以及吡蟲啉抗性和敏感種群之間CYP6EM1基因表達(dá)量的差異。

1.7 RNA干擾

通過(guò)設(shè)計(jì)合成dsCYP6EM1以及對(duì)照外源基因dsGFP，進(jìn)行CYP6EM1的RNA干擾試驗(yàn)。采用飼喂法進(jìn)行煙粉虱的RNA干擾試驗(yàn)[21]。48 h后取存活的煙粉虱進(jìn)行qRT-PCR分析CYP6EM1基因的RNA干擾效率，確定該基因被干擾后進(jìn)行吡蟲啉抗性水平的測(cè)定。每個(gè)飼喂室加入dsRNA飼喂液100 μL，CYP6EM1基因的dsRNA濃度為0.5 μg/μL。每個(gè)飼喂室放置煙粉虱40頭左右。每個(gè)處理有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每生物學(xué)重復(fù)40頭左右煙粉虱。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，煙粉虱在不同發(fā)育齡期、不同組織和吡蟲啉抗敏種群之間的表達(dá)量差異采用單因素方差分析，差異顯著性分析應(yīng)用Tukey法。通過(guò)POLO program PC PoloPlus對(duì)生物測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行概率單位分析從而得到LC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 吡蟲啉抗性和敏感種群煙粉虱的生物測(cè)定

對(duì)吡蟲啉抗性和敏感種群的煙粉虱進(jìn)行生物測(cè)定的結(jié)果如表2所示。

2.2 煙粉虱CYP6EM1基因的克隆及其序列分析

以煙粉虱cDNA作為模板，通過(guò)基因克隆獲得CYP6EM1基因的全長(zhǎng)ORF序列，長(zhǎng)度為1 539 bp，與基因組序列一致（基因組登錄號(hào)：BTA005348.1）。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)CYP6EM1基因可編碼512個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為6.33，分子量為58.95 kD。該蛋白具有細(xì)胞色素P450基因的保守結(jié)構(gòu)域：Heme-binding結(jié)構(gòu)域（P449-A459），Helix-C WXXXR結(jié)構(gòu)域（W189-R193），Oxygen-binding結(jié)構(gòu)域（A317-V322），以及Meander PXXFXP結(jié)構(gòu)域（P426-P431），屬于典型的昆蟲P450基因。CYP6EM1基因的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示，Q型煙粉虱CYP6EM1基因編碼的氨基酸序列與煙粉虱P450家族CYP6亞家族基因聚類在一起。

2.3 在吡蟲啉抗性煙粉虱不同發(fā)育齡期和組織中CYP6EM1基因的表達(dá)水平

CYP6EM1基因在煙粉虱不同發(fā)育齡期的表達(dá)量可以通過(guò)熒光定量PCR分析，從圖2a可以看出，CYP6EM1基因在卵期表達(dá)量最低，在3齡若蟲期表達(dá)量稍高，在成蟲期的雄性成蟲中表達(dá)量最高，表明該基因在雄性煙粉虱中發(fā)揮作用。不同組織中的表達(dá)量如圖2b所示，該基因在煙粉虱頭部表達(dá)很少，在胸部和腹部表達(dá)較多。

2.4 CYP6EM1基因在吡蟲啉抗敏種群的表達(dá)量

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)在室內(nèi)飼養(yǎng)的Q型敏感種群和吡蟲啉抗性種群中CYP6EM1基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)該基因在吡蟲啉抗性種群中過(guò)量表達(dá)4.7倍（圖3a），差異極顯著，表明該基因過(guò)量表達(dá)可能參與煙粉虱對(duì)吡蟲啉的抗藥性。

2.5 RNA干擾試驗(yàn)

由于CYP6EM1基因在煙粉虱吡蟲啉抗性種群中過(guò)量表達(dá)（圖3a），而對(duì)于該基因參與煙粉虱抗性形成的機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。通過(guò)飼喂0.5 μg/μL的dsCYP6EM1和dsGFP進(jìn)行RNA干擾試驗(yàn)，48 h后用熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與飼喂dsGFP相比，飼喂dsCYP6EM1使得CYP6EM1基因在煙粉虱成蟲體內(nèi)表達(dá)量減少了54.8%（圖3b）。進(jìn)一步用100 mg/L的吡蟲啉進(jìn)行RNAi后的生物測(cè)定，24 h后發(fā)現(xiàn)與飼喂dsGFP相比，飼喂dsCYP6EM1后煙粉虱的死亡率顯著增加（圖3c）。結(jié)果表明RNA干擾降低CYP6EM1基因表達(dá)量能顯著降低煙粉虱對(duì)吡蟲啉的抗性。

3 討論

20世紀(jì)90年代以來(lái)，煙粉虱開(kāi)始入侵我國(guó)形成危害，特別是2003年發(fā)現(xiàn)的Q型煙粉虱入侵我國(guó)以后，造成了嚴(yán)重的危害，隨之而來(lái)的番茄黃化曲葉病也大規(guī)模暴發(fā)，導(dǎo)致番茄等重要農(nóng)作物大量減產(chǎn)，甚至絕產(chǎn)[22]。防治煙粉虱主要使用新煙堿類殺蟲劑，第一代新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉被廣泛用于防治煙粉虱。但是嚴(yán)重的抗藥性導(dǎo)致藥物的使用量增加，防效顯著降低，對(duì)于煙粉虱抗藥性的研究顯得十分重要。

前期研究報(bào)道表明細(xì)胞色素P450基因在煙粉虱對(duì)吡蟲啉抗性中發(fā)揮重要作用，特別是關(guān)鍵基因CYP6CM1的克隆[15]，功能解析[18]，以及一系列的田間樣品檢測(cè)[17]，發(fā)現(xiàn)該基因在煙粉虱對(duì)吡蟲啉的抗性形成中發(fā)揮重要作用。最近關(guān)于該基因在煙粉虱體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制也得到揭示，研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子CREB和MAPK信號(hào)通路參與了該基因的調(diào)控過(guò)程，也參與了吡蟲啉抗性的形成[23]。而除此之外，關(guān)于煙粉虱對(duì)于吡蟲啉抗性的其他解毒酶機(jī)制報(bào)道很少，最新研究表明解毒代謝相關(guān)基因如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因，ABC家族基因也可能參與了煙粉虱對(duì)吡蟲啉抗性的形成[24-25]。由細(xì)胞色素P450單加氧酶上調(diào)表達(dá)導(dǎo)致的代謝解毒能力增強(qiáng)是昆蟲產(chǎn)生抗藥性的重要機(jī)制。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因果蠅的研究發(fā)現(xiàn)，CYP6M2和CYP6P3的過(guò)表達(dá)與岡比亞按蚊Anopheles gambiae對(duì)噁蟲威的抗性相關(guān)，CYP6P3表達(dá)的蛋白可以代謝噁蟲威[26]。CYP6ER1的表達(dá)量上調(diào)（上調(diào)36.87倍）在褐飛虱Nilaparvata lugens對(duì)氟啶蟲胺腈的抗性中發(fā)揮了重要作用[27]。與敏感品系相比，CYP346B1、CYP346B2和CYP346B3均在赤擬谷盜Tribolium castaneum磷化氫抗性品系中過(guò)表達(dá)，CYP346B亞家族基因與其對(duì)磷化氫抗性相關(guān)[28]。CYP6CY3過(guò)表達(dá)參與了桃蚜Myzus persicae對(duì)新煙堿類殺蟲劑抗性的形成[29]。在果蠅中，CYP6G1的過(guò)表達(dá)增加了其對(duì)吡蟲啉和DDT大約10倍的抗性[30]。在家蠅Musca domestica中，CYP6A1、CYP6D1和CYP6D3的過(guò)表達(dá)與其對(duì)新煙堿抗性相關(guān)[31]。

本研究通過(guò)對(duì)吡蟲啉抗性和敏感種群的分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的P450基因CYP6EM1在煙粉虱吡蟲啉抗性種群中過(guò)量表達(dá)，依托Q型煙粉虱基因組序列對(duì)該基因的全長(zhǎng)進(jìn)行了克隆分析，發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆诶ハxP450基因家族。進(jìn)一步分析CYP6EM1基因在煙粉虱不同發(fā)育齡期和組織的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)該基因可能與煙粉虱雄性成蟲的生理功能有關(guān)，并且是在胸部和腹部過(guò)量表達(dá)，表明該基因可能參與了煙粉虱中腸解毒過(guò)程。通過(guò)RNAi敲除該基因后，發(fā)現(xiàn)隨著CYP6EM1基因表達(dá)量的降低，煙粉虱對(duì)吡蟲啉的抗性水平也顯著降低，表明該基因可能參與煙粉虱對(duì)吡蟲啉抗藥性的形成。下一步將解析該基因?qū)料x啉的代謝能力，通過(guò)體外表達(dá)該基因的蛋白，進(jìn)行體外代謝確定其代謝能力，從而闡明煙粉虱CYP6EM1基因在吡蟲啉抗性中的作用。

關(guān)于煙粉虱對(duì)新煙堿類殺蟲劑的抗性機(jī)制研究現(xiàn)在仍然處于大量挖掘抗性基因的階段，特別是田間抗性形成機(jī)制復(fù)雜，一系列與煙粉虱抗藥性相關(guān)的研究方向都需要從分子層面進(jìn)行解析，所以通過(guò)抗藥性機(jī)制的大量研究，為解決煙粉虱抗藥性提供思路，也為高效防治煙粉虱提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] BROWN J K， FROHLICH D R， ROSELL R C. The sweetpotato or silver leaf whiteflies： biotypes of Bemisia tabaci or a species complex？[J]. Annual Review of Entomology， 1995， 40（1）： 511-534.

[2] JONES D R. Plant viruses transmitted by whiteflies [J]. European Journal of Plant Pathology， 2003， 109（3）： 195 -219.

[3] DE BARRO P J， LIU Shusheng， BOYKIN L M， et al. Bemisia tabaci： a statement of species status [J]. Annual Review of Entomology， 2011， 56（1）： 1-19.

[4] 褚棟， 張友軍. 近10年我國(guó)煙粉虱發(fā)生為害及防治研究進(jìn)展[J]. 植物保護(hù)， 2018， 44（5）： 51-55.

[5] CASIDA J E. Neonicotinoids and other insect nicotinic receptor competitive modulators： progress and prospects [J]. Annual Review of Entomology， 2018， 63（1）： 125-144.

[6] NAUEN R， DENHOLM I. Resistance of insect pests to neonicotinoid insecticides： current status and future prospects [J]. Archives of Insect Biochemistry and Physiology， 2005， 58（4）： 200-215.

[7] ERDOGAN C， MOORES G D， GURKAN M O， et al. Insecticide resistance and biotype status of populations of the tobacco whitefly Bemisia tabaci （Hemiptera： Aleyrodidae） from Turkey [J]. Crop Protection， 2008， 27（3）： 600-605.

[8] FENANDZ E， GRAVALOS C， HARO P J， et al. Insecticide resistance status of Bemisia tabaci Q-biotype in south-eastern Spain [J]. Pest Management Science， 2009， 65（8）： 885-891.

[9] LUO Chen， JONES C M， DEVINE G， et al. Insecticide resistance in Bemisia tabaci biotype Q （Hemiptera： Aleyrodidae） from China [J]. Crop Protection， 2010， 29（5）： 429-434.

[10]WANG Zhenyu， YAN Haifei， YANG Yihua， et al. Biotype and insecticide resistance status of the white fly Bemisia tabaci from China [J]. Pest Management Science， 2010， 66（12）： 1360-1366.

[11]WANG Ran， CHE Wunan， WANG Jinda， et al. Monitoring insecticide resistance and diagnostics of resistance mechanisms in Bemisia tabaci Mediterranean （Q biotype） in China [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2019， 163： 117-122.

[12]LIU Zewen， WILLIAMSON M S， LANSDELL S J， et al. A nicotinic acetylcholine receptor mutation conferring target-site resistance to imidacloprid in Nilaparvata lugens （brown plant-hopper）[J]. Proceeding of the National Academy of Sciences， 2005， 102（24）： 8420-8425.

[13]BASS C， PUINEAN A M， ANDREWS M， et al. Mutation of a nicotinic acetylcholine receptor β subunit is associated with resistance to neonicotinoid insecticides in the aphid Myzus persicae [J/OL]. BMC Neuroscience， 2011， 12： 51. DOI： 10.1186/1471-2202-12-51.

[14]ZHUANG Huamei， WANG Kuanfu， ZHENG Lin， et al. Identification and characterization of a cytochrome P450 CYP6CX1 putatively associated with insecticide resistance in Bemisia tabaci [J]. Insect Science， 2010， 18（5）： 484-494.

[15]YANG Xin， XIE Wen， WANG Shaoli， et al. Two cytochrome P450 genes are involved in imidacloprid resistance in field populations of the whitefly， Bemisia tabaci， in China [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2013， 107（3）： 343-350.

[16]KARUNKER I， BENTING J， BETTINA L， et al. Over-expression of cytochrome P450 CYP6CM1 is associated with high resistance to imidacloprid in the B and Q biotypes of Bemisia tabaci （Hemiptera： Aleyrodidae）[J]. Insect Biochemistry & Molecular Biology， 2008， 38（6）： 634-644.

[17]KARUNKER E， MOROUB D， NIKOUB R， et al. Structural model and functional characterization of the Bemisia tabaci CYP6CM1vQ， a cytochrome P450 associated with high levels of imidacloprid resistance [J]. Insect Biochemistry & Molecular Biology， 2009， 39（10）： 697-706.

[18]XIE Wen， YANG Xin， CHEN Chunhai， et al. The invasive MED/Q Bemisia tabaci Genome： A tale of gene loss and gene gain [J/OL]. BMC Genomics， 2018， 19（1）： 68. DOI： 10.1186/s12864-018-4448-9.

[19]FENG Y T， WU Q J， XU B Y， et al. Fitness costs and morphological change of laboratory-selected thiamethoxam resistance in the B-type Bemisia tabaci （Hemiptera： Aleyrodidae）[J]. Journal of Applied Entomology， 2009， 133（6）： 466-472.

[20]LARKIN M A， BLACKSHIELDS G， BROWN N P， et al. Clustal W and Clustal X version 2.0 [J]. Bioinformatics， 2007， 23（21）： 2947-2948.

[21]楊鑫. Q型煙粉虱對(duì)噻蟲嗪抗性機(jī)制研究 [D]. 長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[22]PAN Huipeng， CHU Dong， GE Daqing， et al. Further spread of and domination by Bemisia tabaci （Hemiptera： Aleyrodidae） biotype Q on field crops in China [J]. Journal of Economic Entomology， 2011， 104（3）： 978-985.

[23]YANG Xin， DENG Shun， WEI Xuegao， et al. MAPK-directed activation of the whitefly transcription factor CREB leads to P450-mediated imidacloprid resistance [J]. Proceeding of the National Academy of Sciences， 2020， 117（19）： 10246-10253.

[24]YANG Xin， HE Chao， XIE Wen， et al. Glutathione S-transferases are involved in thiamethoxam resistance in the field whitefly Bemisia tabaci Q （Hemiptera： Aleyrodidae）[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2016， 134： 73-78.

[25]HE Chao， LIANG Jingjing， LIU Shaonan， et al. Changes in the expression of four ABC transporter genes in response to imidacloprid in Bemisia tabaci Q （Hemiptera： Aleyrodidae）[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2019， 153： 136-143.

[26]EDI C V， DJOGBENOU L， JENKINS A M， et al. CYP6 P450 enzymes and ACE-1 duplication produce extreme and multiple insecticide resistance in the malaria mosquito Anopheles gambiae [J/OL]. PLoS Genetics， 2014， 10（3）： e1004236. DOI： 10.1371/journal.pgen.1004236.

[27]廖遜.褐飛虱對(duì)氟啶蟲胺腈的抗性及其機(jī)理研究 [D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

[28]劉蔓文.赤擬谷盜CYP346基因家族介導(dǎo)磷化氫抗性的機(jī)理研究 [D]. 南京：南京財(cái)經(jīng)大學(xué)，2019.

[29]PUINEAN A M， FOSTER S P， OLIPHANT L， et al. Amplification of a cytochrome P450 gene is associated with resistance to neonicotinoid insecticides in the aphid Myzus persicae[J/OL]. PLoS Genetics， 2010， 6（6）： e1000999. DOI： 10.1371/journal.pgen.1000999.

[30]DABORNP J， BOUNDY S， YEN J， et al. DDT resistance in Drosophila correlates with Cyp6g1 over-expression and confers cross-resistance to the neonicotinoid imidacloprid [J]. Molecular Genetics and Genomics， 2001， 266（4）： 556-563.

[31]MARKUSSEN M D K， KRISTENSEN M. Cytochrome P450 monooxygenase-mediated neonicotinoid resistance in the house fly Musca domestica L. [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2010， 98（1）： 50-58.

（責(zé)任編輯：田 喆）