金魚體內(nèi)吡蟲啉及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)方法

徐王暉，侯佳音，周忠靜，俞建忠，章陸陸，3，杜曉華，陳列忠*

（1. 浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310014；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310021；3.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江寧波 315832）

吡蟲啉（Imidacloprid），分子式為C9H10ClN5O2，化學(xué)名稱為(E)-1-(6-氯吡啶-3-吡啶基甲基)-N-硝基亞咪唑烷-2-基胺，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1，是第一代新煙堿類殺蟲劑，自1991年投放市場(chǎng)以來(lái)，已在120多個(gè)國(guó)家登記使用[1]。由于使用量大，使用范圍廣，又具有較好的水溶性和環(huán)境穩(wěn)定性，吡蟲啉已在世界各地的水體中形成了較為普遍的殘留污染[2-3]，對(duì)環(huán)境和環(huán)境生物存在潛在的危害風(fēng)險(xiǎn)。已有研究表明，吡蟲啉會(huì)影響非靶標(biāo)生物的健康狀態(tài)，如：會(huì)引發(fā)斑馬魚腸道組織的損傷和氧化應(yīng)激，輕微誘發(fā)腸道菌群失調(diào)和特定細(xì)菌改變[4]；誘導(dǎo)雄性小鼠產(chǎn)生氧化應(yīng)激[5]；具有肝毒性，并導(dǎo)致大鼠雄性生殖系統(tǒng)受損[6-7]。

圖1 吡蟲啉結(jié)構(gòu)式

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于吡蟲啉在哺乳動(dòng)物、植物以及昆蟲中的代謝產(chǎn)物已有較多報(bào)道，常見(jiàn)代謝產(chǎn)物有5-羥基吡蟲啉、4，5-二羥基吡蟲啉、烯式吡蟲啉、吡蟲啉亞硝基亞胺、吡蟲啉脲、6-氯煙酸等（表1），在不同生物體內(nèi)的代謝途徑主要有反硝化作用、硝基還原、氧化、水解等（圖2）。但是關(guān)于吡蟲啉在水生生物中代謝的研究仍較少。而魚類作為水生生物中重要的一環(huán)，在研究吡蟲啉在生物體中的代謝時(shí)，理應(yīng)受到關(guān)注。金魚（Carassius auratus）屬于鯉科鯽屬魚類，是一種中國(guó)特色的水生生物，故本文選用金魚作為研究生物，更能體現(xiàn)吡蟲啉對(duì)水生生物的影響。

表1 吡蟲啉在生物體內(nèi)的常見(jiàn)代謝物

圖2 生物體內(nèi)吡蟲啉的降解途徑[1]

本研究以金魚作為研究對(duì)象，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定了吡蟲啉在金魚體內(nèi)主要的代謝產(chǎn)物，探究吡蟲啉及代謝物含量的定量測(cè)定方法，可為后續(xù)進(jìn)一步進(jìn)行吡蟲啉對(duì)金魚的毒理學(xué)評(píng)估提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：SCIEX 5500+高效液相三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)愛(ài)博才思公司；Eclipse C18柱，美國(guó)安捷倫公司；Sartorius BSA124S萬(wàn)分之一天平，德國(guó)賽多利斯公司；LC-DCY-12SF水浴氮吹儀，上海力辰儀器科技有限公司。

試劑：吡蟲啉（純度95%），上海源葉生物科技有限公司；吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；100 mg/L吡蟲啉脲-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液、100 mg/L烯式吡蟲啉-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液、100 mg/L 5-羥基吡蟲啉-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液、100 mg/L 6-氯煙酸-甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，天津阿爾塔科技有限公司；甲醇（色譜級(jí)）、乙酸乙酯（色譜級(jí)），美國(guó)密理博公司；純凈水，屈臣氏有限公司。

1.2 試驗(yàn)材料與處理

金魚（Carassius auratus）成魚，購(gòu)自杭州市鳳起花鳥市場(chǎng)。所有金魚在正式試驗(yàn)前均在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)1周以上。馴養(yǎng)條件如下：試驗(yàn)用水為曝氣除氯的自來(lái)水，pH為7.0～8.5，溫度為（20.9±0.4）℃，溶解氧為6.9±0.2 mg/L，養(yǎng)殖用水符合GB11607—1989《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》[13]的規(guī)定。在正式處理開始前，按1.5中的檢測(cè)條件對(duì)馴化后的金魚進(jìn)行隨機(jī)檢測(cè)，結(jié)果為其體內(nèi)沒(méi)有吡蟲啉及其代謝物的存在。

金魚處理：馴化后的金魚隨機(jī)分成對(duì)照組和兩個(gè)吡蟲啉處理組，根據(jù)吡蟲啉對(duì)金魚的安全濃度，設(shè)置處理濃度分別為20 mg/L和40 mg/L[14]。暴露時(shí)間為28 d，在每一試驗(yàn)組隨機(jī)放入60尾金魚，養(yǎng)殖密度為4尾/L。在試驗(yàn)開始前以及暴露2 h、6 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d和28 d從各試驗(yàn)組隨機(jī)取出5條魚，解剖，取每條金魚肝臟、腸道、肌肉、鰓組織、腦組織和性腺于EP管中，樣品保存于-80℃冰箱中，待分析。

1.3 樣品前處理

取金魚組織樣本置于20 mL離心管中，然后加入適量乙酸乙酯溶液，渦旋混勻1 min，再加入1 g無(wú)水MgSO4和0.5 g硅藻土，渦旋混勻1 min后在室溫下超聲10 min，之后以4 000 r/min在4℃下離心10 min，取上層清液，氮吹至干，以甲醇定容至1 mL后過(guò)膜分析。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

用分析天平準(zhǔn)確稱取吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，將稱好的樣品放置在100 mL容量瓶中，以甲醇為溶劑，并用超聲使樣品溶解完全，定容至刻度線，配制成100 mg/L的儲(chǔ)備液。分別移取吡蟲啉、吡蟲啉脲、烯式吡蟲啉、5-羥基吡蟲啉和6-氯煙酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成1 μg/L的混標(biāo)溶液，避光保存于-20℃冰箱中備用。

1.5 色譜質(zhì)譜條件

1.5.1 液相色譜條件

液相色譜柱：Eclipse C18柱（1.8 μm，3.0 mm×100 mm）；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：2 μL；流速：5 μL/s；流動(dòng)相：水相為0.1%甲酸水，有機(jī)相為甲醇，采用梯度洗脫，洗脫程序如表2。

表2 液相色譜檢測(cè)吡蟲啉及代謝物梯度洗脫程序

1.5.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜離子源：電噴霧離子源ESI；離子化模式：正離子模式；掃描方式：選擇離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（SRM）；噴霧電壓：4 000 V；溫度：200℃；鞘氣和輔助氣均為高純氮?dú)?，壓力均?13.7 kPa；離子傳輸毛細(xì)管溫度：450℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 金魚體內(nèi)吡蟲啉代謝物的定性分析

取吡蟲啉處理后的金魚組織樣本進(jìn)行液質(zhì)分析。選擇全離子掃描模式對(duì)m/z 50～1 000范圍內(nèi)的離子對(duì)進(jìn)行全掃描。對(duì)比吡蟲啉代謝物的質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)信息可知，質(zhì)荷比在256.2、212.2、254.2、223.1、171、155.9、128.1、112.1范圍左右存在重合，故推測(cè)出吡蟲啉在金魚體內(nèi)可能代謝成吡蟲啉脲、烯式吡蟲啉、5-羥基吡蟲啉和6-氯煙酸，其離子碎片信息（表3）和液相色譜圖如圖3所示。

表3 吡蟲啉及其代謝物離子碎片信息

圖3 吡蟲啉及其代謝物液相色譜圖

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

分別選擇2∶1、1∶1、1∶2不同比例的乙酸乙酯-水混合溶液以及9、12 mL和18 mL不同用量的乙酸乙酯-水混合溶液，考察其在金魚組織樣品中對(duì)吡蟲啉及其代謝物的提取效率，結(jié)果如圖4～5所示。檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)乙酸乙酯∶水比例為2∶1，用量為12 mL時(shí)，對(duì)金魚組織中吡蟲啉及其代謝物回收率最高。

圖4 不同比例的乙酸乙酯-水混合溶液對(duì)金魚組織中吡蟲啉及其代謝物的提取效果

圖5 不同用量的乙酸乙酯-水混合溶液對(duì)金魚組織中的吡蟲啉及其代謝物的提取效果

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 方法的線性關(guān)系

在0.1～100 μg/L質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，吡蟲啉及其代謝物峰面積與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性范圍和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4。

表4 吡蟲啉及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

2.3.2 方法的檢測(cè)限和定量限

向空白處理的組織樣本中添加待測(cè)的組分，按“信噪比”法，測(cè)定信噪比為3∶1時(shí)，添加的化合物的量為方法的檢出濃度；測(cè)定信噪比為10∶1時(shí)，添加的化合物的量為方法的最低定量濃度。測(cè)得吡蟲啉、吡蟲啉脲、烯式吡蟲啉、5-羥基吡蟲啉、6-氯煙酸的檢測(cè)限分別為0.001、0.009 9、0.001 1、0.006 8 μg/L和0.005 6 μg/L，定量限分別為0.003 34、0.032 907、0.003 519、0.022 718 μg/L和0.018 682 μg/L。

2.3.3 方法精密度

在選定的分析條件下，對(duì)同一個(gè)吡蟲啉及其代謝物混標(biāo)溶液（10 μg/L）平行測(cè)定5次，計(jì)算吡蟲啉及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表5可知，吡蟲啉、吡蟲啉脲、烯式吡蟲啉、5-羥基吡蟲啉、6-氯煙酸的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.369 3、0.215 2、0.396 8、0.298 8和0.265 6，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.41%、1.98%、3.79%、2.84%和2.64%。所有相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4%，則該方法的重現(xiàn)性好、精密度高。

表5 吡蟲啉及其代謝物的精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 方法準(zhǔn)確度

取空白處理的金魚組織樣本，在其中添加待測(cè)的組分，按優(yōu)化后的前處理方法進(jìn)行處理，按照選定的色譜條件測(cè)定樣品中的吡蟲啉及其代謝物的含量，計(jì)算平均回收率。吡蟲啉、吡蟲啉脲、烯式吡蟲啉、5-羥基吡蟲啉、6-氯煙酸的平均回收率分別為96.08%，99.77%，85.25%，87.24%和100.23%（表6），表明該方法的準(zhǔn)確度滿足農(nóng)藥殘留測(cè)定的要求。

表6 吡蟲啉及其代謝物的添加回收率

2.4 樣品檢測(cè)

染毒濃度依據(jù)吡蟲啉對(duì)鯽魚的CL50設(shè)置[14]，分別用20 mg/L和40 mg/L的吡蟲啉染毒，28 d后取金魚的組織樣本。按照優(yōu)化后的提取方法進(jìn)行提取，再進(jìn)行LC/MS分析。結(jié)果測(cè)得金魚體內(nèi)吡蟲啉的含量在1 000～6 500 ng/g之間，20 mg/L吡蟲啉處理中殘留量最高的組織是腸道。吡蟲啉的主要代謝產(chǎn)物是吡蟲啉脲和5-羥基吡蟲啉，體內(nèi)殘留量分別為50～400 ng/g和30～300 ng/g；少量代謝成6-氯煙酸和烯式吡蟲啉，含量分別為0.2～2 ng/g和0.5～5 ng/g（圖6）。

圖6 金魚體內(nèi)吡蟲啉及其代謝物含量

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法確定了吡蟲啉在金魚體內(nèi)的代謝產(chǎn)物為吡蟲啉脲、烯式吡蟲啉、5-羥基吡蟲啉和6-氯煙酸，并且建立了準(zhǔn)確的測(cè)量方法。該方法的精密度和準(zhǔn)確度較高，線性關(guān)系良好，是一種可行的分析方法，可以用于金魚體內(nèi)的吡蟲啉及其代謝物的定性以及定量分析。