來自大興安嶺凋落物的綠僵菌及其相近菌屬真菌的生物活性

高思禹 鄭旭 岳群 張李香 徐利劍

摘要 為研究綠僵菌Metarhizium及其相近菌屬真菌的生物活性，采用形態(tài)學和分子生物學的方法對來自大興安嶺凋落物的肉色基思菌Keithomyces carneus（曾用名：肉色綠僵菌M.carneum）與馬氏馬昆德菌Marquandomyces marquandii（曾用名馬昆德綠僵菌M. marquandii）以及金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae進行了鑒定，并分析了它們對3種害蟲、4種植物病原菌的活性。殺蟲活性測定表明，肉色基思菌與馬氏馬昆德菌對雙斑螢葉甲Monolepta hieroglyphica、玉米蚜Rhopalosiphum maidis、綠豆象Callosobruchus chinensis具有侵染能力，為非寄主?；驼婢?。抑菌活性測定表明，肉色基思菌對立枯絲核菌Rhizoctonia solani，水稻白葉枯病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzae等病原菌具有抑菌活性。本研究揭示了3種供試真菌具有防治雙斑螢葉甲的潛力，也發(fā)現(xiàn)了肉色基思菌與馬氏馬昆德菌的生防潛力，為它們進一步開發(fā)利用打下了基礎。

關鍵詞 綠僵菌; 殺蟲活性; 抑菌活性; 雙斑螢葉甲; 生物防治

中圖分類號： S 476.12

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020334

Biological activities of species of Metarhizium and its close genera

from litters in the Greater Khingan Mountains

GAO Siyu1， ZHENG Xu2， YUE Qun3， ZHANG Lixiang1， XU Lijian1 *

（1. College of Advanced Agriculture and Ecological Environment， Heilongjiang University， Harbin 150080， China;

2. Qiqihar Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Qiqihar 161006， China;

3. Biotechnology Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China）

Abstract

In order to investigate the biological activities of species of Metarhizium and its close genera fungi， Keithomyces carneus （former name： Metarhizium carneum） and Marquandomyces marquandii （former name： Metarhizium marquandii） as well as Metarhizium anisopliae were identified from the litters in the Greater Khingan Mountains by using morphological and molecular biological methods. Their activities against three pests and four plant pathogens were investigated by biological activity assays. According to the insecticidal activity test， K.carneus and Ma.marquandii had an infectivity against Monolepta hieroglyphica， Rhopalosiphum maidis and Callosobruchus chinensis， demonstrating that K.carneus and Ma.marquandii were non host-specific fungi. According to the antimicrobial assays， K.carneus had antimicrobial activities against Rhizoctonia solani， Xanthomonas oryzae pv. oryzae and the others. This study revealed that three tested fungal species had the potential for biocontrol of M.hieroglyphica. It was also found that K.carneus and Ma.marquandii had the biocontrol potential. It laid the foundation for their further development and utilization.

Key words

Metarhizium; insecticidal activity; antimicrobial activity; Monolepta hieroglyphica; biocontrol

綠僵菌Metarhizium spp.作為昆蟲病原真菌可以用作生物農(nóng)藥已廣為人知。綠僵菌廣泛分布在世界各地，通常作為植物根際菌[1]、植物內(nèi)生菌[2]、昆蟲病原菌[3]以及土壤真菌生存在于自然界中。1883年，Sorokin正式將第一種綠僵菌命名為金龜子綠僵菌M.anisopliae[4]，從此開始了綠僵菌作為昆蟲病原菌與生物農(nóng)藥的研究。綠僵菌還可以提高植物對病原菌的抗性[5]，例如Lara等[6]發(fā)現(xiàn)棕色綠僵菌M.brunneum可減輕鐮刀菌Fusarium spp.引起的小麥根腐病。一些綠僵菌由于展現(xiàn)了良好的殺蟲、抑菌能力，可以作為生物農(nóng)藥廣泛應用在農(nóng)業(yè)上[7-11]。目前已有許多成功的室內(nèi)及田間防治案例，如金龜子綠僵菌、黃綠綠僵菌M.flavoviride和羅伯茨綠僵菌M.robertsii等菌種對葡萄黑象甲Otiorhynchus sulcatus[10]、摩門螽Anabrus simplex[9]、小菜蛾Plutella xylostella[12]、灰飛虱Laodelphax striatellus[13]等鞘翅目、直翅目、鱗翅目、半翅目的昆蟲皆有侵染作用。綠僵菌具有豐富的次生代謝產(chǎn)物[14]，這些代謝產(chǎn)物除了可以殺死昆蟲外，還具有抑制真菌和細菌的功能。例如，肖代敏等發(fā)現(xiàn)戴氏蟲草無性型戴氏綠僵菌M.taii發(fā)酵液具有較強的抑菌能力[15]。

2014年，基于多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，進一步修訂了綠僵菌屬分類系統(tǒng)[16]。綠僵菌屬由原來的11個種擴增至31個種，包括26種核心綠僵菌（core-Metarhizium）與5種非核心綠僵菌。核心綠僵菌為系統(tǒng)發(fā)生學的單系群，在屬內(nèi)擁有共同的祖先。形態(tài)學上核心綠僵菌能產(chǎn)生大量深色色素的分生孢子。非核心綠僵菌系統(tǒng)發(fā)生學分支位于核心綠僵菌單系群以外，與核心綠僵菌的祖先不同;且形態(tài)學上非核心綠僵菌不產(chǎn)生深色色素的分生孢子。5種非核心綠僵菌分別為肉色綠僵菌M.carneum、馬昆德綠僵菌M.marquandii、M.khaoyaiense、M.yongmunense和M.kusanagiense[16]。相比于金龜子綠僵菌、蝗綠僵菌M. acridum、棕色綠僵菌等核心綠僵菌[6，18-19]，這些非核心綠僵菌的活性很少被報道。2020年，綠僵菌屬分類系統(tǒng)再次被修訂，將5種非核心綠僵菌分別歸為5個新建立的屬，命名為肉色基思菌Keithomyces carneus、馬氏馬昆德菌Marquandomyces marquandii、Purpureomyces khaoyaiense、Sungia yongmunense和Yosiokobayasia kusanagiense[17]。

本文研究了肉色基思菌與馬氏馬昆德菌的生物活性。據(jù)報道，馬氏馬昆德菌可以抑制根結線蟲Meloidogyne incognita[20-22]，侵染率70%以上[20];肉色基思菌對歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis具有一定的侵染活性，侵染率在20%～30%之間[23]。目前尚未檢索到有關肉色基思菌與馬氏馬昆德菌侵染雙斑螢葉甲Monolepta hieroglyphica、玉米蚜Rhopalosiphum maidis以及綠豆象Callosobruchus chinensis的相關報道。它們是否同樣是昆蟲病原真菌（是否為寄主專性寄生），是否具有抑制植物病原菌的活性[24]，以及它們的生防譜是否與綠僵菌一樣等問題值得研究。

雙斑螢葉甲（葉甲科）是雜食性昆蟲，可取食多種農(nóng)作物的葉片及果實，在玉米田和棉花田發(fā)生較多[25-26]，嚴重時可造成減產(chǎn)20%左右[27]。目前雙斑螢葉甲主要是采用化學防治[28]，存在潛在的農(nóng)產(chǎn)品與環(huán)境安全問題。除化學防治外，還可通過人工和機械網(wǎng)捕捉來減少雙斑螢葉甲數(shù)量[29]，但這兩種方法見效較慢并且對人力物力要求較高。對雙斑螢葉甲缺少綠色農(nóng)藥防控的有效方法。未見綠僵菌及其相近菌屬真菌對雙斑螢葉甲的生防活性的報道。

本研究從大興安嶺林下凋落物中分離出了3株真菌，分別為肉色基思菌SGSF001、馬氏馬昆德菌SGSF043與金龜子綠僵菌SGSF221，研究了它們對雙斑螢葉甲、玉米蚜以及綠豆象的侵染活性，目前這3種害蟲的防治主要依賴于化學手段[8，30-31]同時還研究了它們的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

凋落物樣品于2018年9月采集自黑龍江省大興安嶺地區(qū)南甕河國家級自然保護區(qū)，主要植物種類有紫椴Tilia amurensis Rupr.、蒙古櫟Quercus mongolica Fischer ex Ledebour和水曲柳Fraxinus mandshurica Rupr.等。將凋落物從上至下分為未分解層、半分解層、分解層，并分層收集樣品。每份樣品大約15 g，放于滅菌的信封中，寫明樣品來源、采集日期，帶回實驗室，在陰涼處自然風干，并保存。

供試昆蟲為雙斑螢葉甲成蟲、玉米蚜無翅成蟲和綠豆象成蟲。供試害蟲收集于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院嫩江農(nóng)業(yè)科學研究所試驗田。供試細菌包括青枯勞爾氏菌Ralstonia solanacearum和水稻白葉枯病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzae。供試真菌包括立枯絲核菌Rhizoctonia solani和串珠鐮刀菌Fusarium moniliforme。供試植物病原菌為本實驗室采集分離自黑龍江省尚志市帽兒山鎮(zhèn)農(nóng)田。

培養(yǎng)及形態(tài)學鑒定所需培養(yǎng)基（1 000 mL）。1/4馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（1/4PDA）：葡萄糖5 g、馬鈴薯50 g、瓊脂20 g。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：葡萄糖20 g、馬鈴薯200 g、瓊脂20 g。麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基（MEA）：麥芽浸粉30 g、瓊脂20 g。酵母提取物薩氏培養(yǎng)基（SDAY）：酵母浸粉10 g、葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、瓊脂20 g。燕麥培養(yǎng)基（OA）：燕麥30 g、瓊脂20 g。

菌株發(fā)酵所需培養(yǎng)基（1 000 mL）。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PD）：葡萄糖20 g、馬鈴薯200 g。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基加煙酰胺（PD+Nic）：煙酰胺終濃度為100 μg/mL。大米培養(yǎng)基（大米）：甘油2 g，酵母浸粉2 g，酒石酸鈉10 g，磷酸二氫鉀1 g，七水硫酸鎂1 g，七水硫酸亞鐵0.05 g，每10 mL溶液加入大米10 g。酵母提取物蔗糖培養(yǎng)基（YES）：酵母浸粉20 g、蔗糖100 g、硫酸鎂1 g，根據(jù)溶液體積加入適量蛭石。

抑菌活性測定所需培養(yǎng)基（1 000 mL）。水瓊脂培養(yǎng)基（WA）：瓊脂30 g。細菌基礎培養(yǎng)基（LB）：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化鈉10 g、瓊脂20 g。PDA（配方見上文）。

1.2 方法

1.2.1 綠僵菌及其相近菌分離與保存

采用平板稀釋法。將大興安嶺林下凋落物樣品干燥后，利用粉碎機粉碎成顆粒，用篩網(wǎng)過濾至100～200 μm。稱取1 g樣品顆粒加至裝有10 mL無菌水的離心管中搖晃均勻，用移液器分別吸取50、100、150、200、250 μL顆粒懸浮液加到1/4PDA平板上，用三角棒涂抹使顆粒均勻分布，待有菌落長出后，利用體視顯微鏡觀察菌落，挑取至新的PDA平板，劃線純化培養(yǎng)。在完成菌株分子鑒定后，將純化的菌株保存于含1 mL 30%甘油的凍存管內(nèi)。

1.2.2 菌株鑒定

形態(tài)學觀察：將分離純化獲得的疑似菌株轉接至PDA、MEA、SDAY與OA等培養(yǎng)基上[16，32]，培養(yǎng)14 d后，記錄菌落特征。利用顯微鏡觀察真菌在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)學特征。結合殺蟲活性試驗（1.2.4）中被侵染昆蟲的癥狀及其真菌特征，對比相關文獻[16-17，35]進行形態(tài)學鑒定。

核酸序列鑒定：利用CTAB法提取菌株總DNA[33]，采用真菌通用引物ITS1/ITS4擴增內(nèi)轉錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）[34]，進行初步鑒定。參考Bischoff 等的方法[35]利用引物EF-983F（5′-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT-3′）和EF-2218R（5′-ATGACACCRACRGCRACRGTYTG-3′）進一步對供試菌的翻譯延伸因子1-α（translation elongation factor 1-α，TEF）序列片段進行擴增。對PCR產(chǎn)物進行雙向測序，利用NCBI網(wǎng)站的BLAST進行比對分析。

1.2.3 綠僵菌及其相近菌的抑菌活性測定

1.2.3.1 提取物制備

將已鑒定的3株菌的菌絲體接入PD液體培養(yǎng)基（種子培養(yǎng)基），置于25℃、180 r/min搖床培養(yǎng)3～5 d。然后分別利用4種培養(yǎng)基（PD、PD+Nic、大米、YES）進行菌株發(fā)酵[32]。PD和PD+Nic培養(yǎng)基發(fā)酵：吸取300 μL種子發(fā)酵液分別加入至含有10 mL PD或PD+Nic的100 mL三角瓶中，轉移至搖床中，25℃、180 r/min條件下培養(yǎng)14 d;大米培養(yǎng)基發(fā)酵：吸取300 μL種子發(fā)酵液加入到含有10 mL大米培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，放入25℃培養(yǎng)箱黑暗靜置培養(yǎng)14 d。YES培養(yǎng)基發(fā)酵：吸取300 μL種子發(fā)酵液加入至含有10 mL YES的100 mL三角瓶中，搖晃均勻后，倒入裝有5 g無菌蛭石的100 mL三角瓶中，放入25℃培養(yǎng)箱黑暗靜置培養(yǎng)14 d。發(fā)酵結束后，加入10 mL乙酸乙酯浸泡24 h，用加有濾紙的三角漏斗過濾除掉固體，利用分液漏斗取上層液體（乙酸乙酯提取液），利用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮，得到的固體為粗提物，再加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制成4 mg/mL的待測樣品。每株菌得到4種發(fā)酵方式的粗提物，用于抑菌活性篩選。

1.2.3.2 抑菌活性測定

利用平板打孔藥劑擴散法測定抑菌活性[32]。抑制真菌試驗：將PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)的病原真菌菌餅（6.5 mm）接至新鮮配制的PDA平板中間，在距菌餅邊緣約15 mm處等間距打孔，每皿5個孔，孔內(nèi)分別加入每株菌4種不同發(fā)酵方式得到的粗提物的待測樣品（4 mg/mL）和兩性霉素（200 μg/mL）各20 μL。于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～5 d，觀察結果。抑制細菌試驗：首先在LB固體平板上劃線活化植物病原細菌，待菌落長出后，挑取病原細菌單菌落分別接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基，于180 r/min，25℃培養(yǎng)1～2 d，然后采用雙層平板法[32]測定抑菌活性。將10 mL 1×105 cfu/mL的病原細菌菌液加至50℃、200 mL熔化的LB固體培養(yǎng)基中，搖勻后倒在水瓊脂平板上層，制成雙層平板。再在雙層平板的上層等間距打5個直徑6.5 mm的孔，孔距培養(yǎng)皿中心約為20 mm，各孔分別加入待測樣品和200 μg/mL金霉素各20 μL，24 h后觀察結果。細菌試驗測量抑菌圈直徑，真菌試驗測量抑菌圈半徑，計算出抑菌圈直徑，抑菌圈直徑包含了孔的直徑（6.5 mm）。每個處理設置3次重復。

1.2.4 綠僵菌及其相近菌對3種昆蟲的侵染活性

1.2.4.1 制備孢子懸浮液

將待測菌分別接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d，向平板中加入5 mL滅菌的0.05%吐溫-80水溶液，刮取表面孢子。用滅菌棉花（薄層網(wǎng)）過濾掉多余菌絲體和瓊脂后利用血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子懸浮液最終調(diào)整至孢子含量為1×108個/mL。

1.2.4.2 對3種昆蟲的致病力測定

將雙斑螢葉甲成蟲浸泡在1×108個/mL的孢子懸浮液中5 s，然后轉移至裝有玉米粒的三角瓶內(nèi)，用滅菌的0.05%吐溫-80水溶液作為溶劑對照。每處理35頭成蟲，各處理重復3次。處理后所有三角瓶轉移至（25±1）℃，相對濕度（70±5）%，24 h全黑暗條件的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

將綠豆象成蟲浸泡在1×108個/mL濃度的孢子懸浮液中5 s，然后用毛筆轉移至裝有綠豆的三角瓶內(nèi)，用滅菌的0.05%吐溫-80水溶液作為溶劑對照。每處理20頭成蟲，設置3個重復。處理后后所有三角瓶轉移至（25±1）℃，相對濕度（70±5）%，24 h全黑暗條件的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

將無翅玉米蚜成蟲用毛筆轉移至直徑90 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，采用噴霧法[36-37]接種，利用小型手動噴霧器將1 mL 1×108個/mL孢子懸浮液均勻噴灑在蚜蟲體表，再將處理過的玉米蚜轉移至甘藍葉上，每處理接種40頭玉米蚜，各處理重復3次。處理后所有培養(yǎng)皿轉移至（25±1）℃，相對濕度（70±5）%，24 h全黑暗條件的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

每日觀察3種昆蟲狀態(tài)，統(tǒng)計死亡率與校正死亡率，并將死蟲轉移至鋪有無菌濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)觀察綠僵菌侵染情況，共觀察14 d。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel 2013與SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)分析，采用單因素方差分析法（One-way ANOVA）進行顯著性分析，利用Probit幾率值法計算致死中時（LT50）[38]，校正死亡率采用Abbott提出的公式計算[39]：

校正死亡率=（處理組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）×100%。

2 結果與分析

2.1 3株真菌的形態(tài)學鑒定

圖1為3株待測菌在PDA平板上的菌落特征與產(chǎn)孢結構。

肉色基思菌SGSF001菌株的菌落正面為白色絨毛狀，有較少褶皺，未見明顯色素與滲出物產(chǎn)生;菌落背面為淺褐色，褶皺與正面相對應（圖1a1）。白色分生孢子梗具有多級分支，且次級分支呈瓶狀，分支較多，大小為（9.11～20.23）μm×（2.38～3.81）μm （圖1a2）。分生孢子透明。近球形至球形，大小為（244～4.28）μm×（2.36～4.28）μm（圖1a3）。被侵染的昆蟲首先從腹部長出白色菌絲，后產(chǎn)生白色產(chǎn)孢結構與分生孢子，遍布全身。

馬氏馬昆德菌SGSF043菌株的菌落正面呈白色棉花狀，無褶皺，未見明顯色素與滲出物產(chǎn)生;菌落背部為淺黃色（圖1b1），分生孢子卵圓形，大小為（211～4.31）μm×（1.85～3.04）μm（圖1b3）;在PD液體培養(yǎng)基中可見圓形厚垣孢子。體視顯微鏡下觀察，分生孢子梗多級分支，大小和形狀與SGSF001接近（圖1b2）。被侵染的昆蟲首先從腹部長出白色菌絲，后產(chǎn)生白色產(chǎn)孢結構與分生孢子，遍布全身。

金龜子綠僵菌SGSF221菌株的菌落正面中間墨綠色，外圍橄欖綠色，菌落背面白色，邊緣菌絲呈放射狀（圖1c1）。分生孢子呈圓柱形至長圓形，有的略有彎曲，兩端基本對稱，截斷處較為平滑圓潤，大小為（2.56～4.61）μm×（2.44～3.87）μm（圖1c3）。體視顯微鏡下觀察，分生孢子梗多級分支;分生孢子綠色、串生（圖1c2）。被侵染的昆蟲首先從腹部長出白色菌絲，初期產(chǎn)生白色產(chǎn)孢結構與分生孢子，后來分生孢子變?yōu)榫G色，遍布全身。

2.2 3株真菌分子鑒定結果

3株真菌的ITS與TEF序列與其最相近菌種的相似性皆為100%，其中與SGSF001最相近菌種為肉色基思菌Keithomyces carneus，與SGSF043最相近菌種為馬氏馬昆德菌Marquandomyces marquandii，與SGSF221最相近菌種為金龜子綠僵菌Metarhizium anisopliae（表1）。

2.3 3株真菌的抑菌活性

2.3.1 對供試絲狀真菌的抑菌活性

在3株真菌中只有肉色基思菌SGSF001對立枯絲核菌有抑菌效果;馬氏馬昆德菌SGSF043對供試真菌未表現(xiàn)出抑菌活性;金龜子綠僵菌SGSF221對串珠鐮刀菌有抑制作用，對立枯絲核菌未表現(xiàn)出抑制活性（表2）。

2.3.2 對供試細菌的抑菌活性

由表3可見，肉色基思菌SGSF001和金龜子綠僵菌SGSF221對兩種病原細菌都有抑菌活性。其中肉色基思菌SGSF001的大米培養(yǎng)基提取物對兩種病原菌都有抑制作用，并且抑制效果較好，其余3種發(fā)酵方式提取物只對青枯勞爾氏菌有抑制活性;金龜子綠僵菌SGSF221對水稻白葉枯病菌的抑制作用較強，其YES提取物的抑菌圈直徑達到（21.3±0.03）mm。馬氏馬昆德菌SGSF043對供試菌未表現(xiàn)出抑菌活性。

綜上，肉色基思菌SGSF001抑菌譜最廣，馬氏馬昆德菌SGSF043對供試菌均未表現(xiàn)出抑菌活性，金龜子綠僵菌SGSF221的抑菌活性較強，但不能抑制立枯絲核菌的生長;SGSF001與SGSF221可能含有不同的抑菌物質(zhì)。

2.4 3株真菌對供試昆蟲的侵染活性

3株真菌對雙斑螢葉甲均有較強的殺蟲效果，菌株間差異不顯著（表4），并且接種4 d致死率均達50%以上。接種后校正死亡率隨時間延長持續(xù)增加，在7 d時校正死亡率均達到90%（圖2）。雙斑螢葉甲死亡后轉移至濕潤濾紙培養(yǎng)7 d，3株真菌均能觀察到蟲體上長出菌絲，最終僵蟲率均達到90%以上（表4）。

3株真菌對玉米蚜都有較高的致死率，說明其對玉米蚜具有較強的侵染性，在接種后第3天玉米蚜死亡率均達到100%（圖2）。玉米蚜死亡后轉移至濕潤濾紙上，蟲體長出白色菌絲，最終3株真菌侵染玉米蚜導致的僵蟲率均達到70%左右（表4）。

綠豆象接種3株真菌孢子的試驗組與用吐溫-80處理的對照組相比，其取食行為、活動能力在測試時間范圍內(nèi)無明顯差異。在接種后第1天綠豆象出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，接種后4 d，金龜子綠僵菌SGSF221處理組死亡率明顯高于其他兩個處理，接種后6 d 金龜子綠僵菌SGSF221處理組綠豆象全部死亡;馬氏馬昆德菌SGSF043處理組8 d時校正死亡率為51.66%;肉色基思菌SGSF001對綠豆象的侵染效果較弱（圖2）。將蟲尸轉移至濕潤濾紙上培養(yǎng)后，可以觀察到部分蟲體表面長出菌絲。

3株真菌對3種供試害蟲均表現(xiàn)出了侵染活性。除金龜子綠僵菌SGSF221對綠豆象的侵染活性明顯高于另外兩種昆蟲外，3株真菌對雙斑螢葉甲和玉米蚜的活性較為接近，尤其是對雙斑螢葉甲均具有較好的防治效果。本次研究中3種供試昆蟲來自2個目3個科，由此可推斷出肉色基思菌和馬氏馬昆德菌也為非寄主?；屠ハx病原真菌。

3 結論與討論

本研究利用形態(tài)學特點和ITS序列與TEF序列比對，鑒定出金龜子綠僵菌及2種與之相近的菌，肉色基思菌和馬氏馬昆德菌。真菌的分子鑒定多采用ITS序列，但是由于綠僵菌屬分類復雜，ITS序列具有局限性[16-17，35]，單獨使用無法區(qū)分金龜子綠僵菌復合體M.anisopliae complex和黃綠綠僵菌復合體M.flavoviride complex中分子水平相近的菌種，因此現(xiàn)多將含有較多遺傳信息的TEF序列配合ITS序列共同完成綠僵菌及其相近屬真菌的鑒定。本研究將形態(tài)學特點，ITS序列與TEF序列比對相結合，確保了鑒定的準確性。

金龜子綠僵菌殺蟲譜廣，被廣泛用于害蟲的生物防治[4，40]。但作為曾經(jīng)的非核心綠僵菌，有關肉色基思菌與馬氏馬昆德菌的殺蟲活性方面的報道很少，肉色基思菌與馬氏馬昆德菌的生防潛力還有待挖掘?，F(xiàn)在已有金龜子綠僵菌對綠豆象、玉米蚜生物防治效果的研究報道[41-42]，致死率均在80%以上，本研究有關金龜子綠僵菌的結果與文獻報道相符。目前尚未見關于肉色基思菌與馬氏馬昆德菌侵染3種害蟲的報道。本研究從大興安嶺凋落物中分離的3株真菌對雙斑螢葉甲均具有良好的侵染活性，說明綠僵菌及其相近菌防治雙斑螢葉甲是一種潛在可行的綠色防治方法。

利用不同培養(yǎng)基發(fā)酵，真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物不同。為了一定程度上避免漏篩，本研究選用了4種發(fā)酵方法獲得相應粗提物，發(fā)現(xiàn)肉色基思菌SGSF001在抑制水稻白葉枯病菌的試驗中，只有大米發(fā)酵粗提物表現(xiàn)出了抑菌活性，而馬氏馬昆德菌SGSF043的4種粗提物對供試病原菌均未表現(xiàn)出抑菌活性。利用相同方法發(fā)酵3種真菌，但它們對同一種菌的抑菌活性不同，說明3種真菌次生代謝產(chǎn)物存在差異。3種供試真菌都曾經(jīng)被報道過具有抑菌活性[43-45]，而且金龜子綠僵菌抑菌譜較廣[46-49]。本研究首次揭示了肉色基思菌具有抑制串珠鐮刀菌、立枯絲核菌、青枯勞爾氏菌與水稻白葉枯病菌的活性。對于金龜子綠僵菌，除了抑制立枯絲核菌的活性曾被報道外[50]，本研究還發(fā)現(xiàn)它具有抑制串珠鐮刀菌、青枯勞爾氏菌與水稻白葉枯病菌的活性。本研究未發(fā)現(xiàn)馬氏馬昆德菌SGSF043具有抑制4種測試菌的活性，但馬氏馬昆德菌曾被報道對金黃色葡萄球菌Staphyloccus aureus、藤黃微球菌Micrococcus luteus和白色念珠菌Candida albicans具有抑菌活性[45]。

本研究分離鑒定了3株來自大興安嶺森林凋落物的麥角菌科真菌，它們是綠僵菌及其相近菌屬真菌，并測試了它們對雙斑螢葉甲、玉米蚜和綠豆象3種害蟲的活性以及對植物病原真菌和細菌的抑制作用。首次揭示了綠僵菌及其相近菌屬真菌具有防治雙斑螢葉甲的潛力;發(fā)現(xiàn)了肉色基思菌SGSF001與馬氏馬昆德菌SGSF043對雙斑螢葉甲、玉米蚜等害蟲均有侵染活性，同時還發(fā)現(xiàn)了肉色基思菌SGSF001具有抑制4種植物病原菌的活性，從而豐富了麥角菌科真菌的活性研究，為進一步開發(fā)利用麥角菌科真菌和大興安嶺真菌資源打下了基礎。

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（責任編輯：楊明麗）