表面活性素促進枯草芽胞桿菌XF-1在大白菜葉際定殖能力研究

何朋杰 崔文艷 何鵬飛 李興玉 吳毅歆 SHAHZAD Munir 何月秋

摘要 枯草芽胞桿菌XF-1是一株大白菜內(nèi)生生防菌，通過葉面噴施的方式可有效防控大白菜根腫病，但其葉際定殖的分子機制尚不明確。為了明確表面活性素對XF-1在大白菜葉際定殖的影響，進一步提高其在田間應(yīng)用效果，本研究通過測定生長曲線、泳動運動、群集運動和24孔細(xì)胞培養(yǎng)板靜置培養(yǎng)試驗，分析表面活性素對XF-1菌株生長速率、運動能力和生物膜形成水平的影響;利用葉片-微生物互作分析和定殖試驗，測定XF-1及突變體XF-1-ΔsrfA在大白菜葉表黏附和植株內(nèi)的定殖能力。結(jié)果表明，XF-1-ΔsrfA與XF-1相比生長曲線沒有明顯差異，泳動能力和群集運動能力分別顯著下降了36.8%和43.9%，靜置培養(yǎng)24 h后生物膜形成能力顯著下降53.9%，48 h后無顯著差異。葉片-微生物互作試驗中，突變體標(biāo)記菌XF-1-ΔsrfA-gfp黏附效率較XF-1-gfp約下降80%。噴施接種3～7 d后， XF-1-ΔsrfA-gfp相較于XF-1-gfp在大白菜葉片內(nèi)和根系中的定殖數(shù)量均顯著下降。試驗結(jié)果表明表面活性素對枯草芽胞桿菌XF-1在大白菜葉際定殖具有較為明顯的促進作用，srfA基因的缺失顯著抑制XF-1的葉際定殖能力。

關(guān)鍵詞 表面活性素; 枯草芽胞桿菌; 定殖; 生長曲線; 群集運動; 生物膜

中圖分類號： S 476

文獻標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020580

Surfactin promotes the colonization of Bacillus subtilis XF-1 in the phyllosphere of Chinese cabbage

HE Pengjie1，2#， CUI Wenyan1，2#， HE Pengfei1， LI Xingyu1， WU Yixin1， SHAHZAD Munir1， HE Yueqiu1*

（1. State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-resources in Yunnan， Yunnan Agricultural

University，Kunming 650201， China; 2. Faculty of Basic Medicine， Guizhou University of

Traditional Medicine， Guiyang 550025， China）

Abstract

Bacillus subtilis XF-1 strain， an endophytic biocontrol bacterium， was isolated from Chinese cabbage rhizosphere， which could effectively control clubroot disease of Chinese cabbage through foliar-spaying， but the molecular mechanisms of its colonization in the phyllosphere of Chinese cabbage are still unclear. To determine the effect of surfactin on the colonization of XF-1 in the phyllosphere of Chinese cabbage and provide theoretical instructions for improving the agricultural application of B.subtilis XF-1， the growth curves， motility and biofilm formation of strain XF-1 and mutant XF-1-ΔsrfA were analyzed through static culture and biofilm assays on swimming and swarming agars and in 24-well plates， respectively. Then， the bacterial attachment onto plant leaf surface and colonization in plant tissues of XF-1 and its mutant XF-1-ΔsrfA were checked based on leaf-microbe interaction analysis and colonization assays. The results showed that， compared to wild type XF-1， there was no significant difference in the growth curve of XF-1-ΔsrfA; the swimming and swarming abilities of XF-1-ΔsrfA were significantly reduced by 36.8% and 43.9%， respectively， and the ability of biofilm formation of mutant XF-1-ΔsrfA was significantly reduced by 53.9% after 24 h， but there was no statistical difference after 48 h. Moreover， compared with XF-1-gfp， adhesion efficacy of? XF-1-ΔsrfA-gfp? onto plant leaf surface was decreased by approximately 80% in the assay of leaf-microbe interaction. In addition， the colonization density of GFP-tagged mutant， XF-1-ΔsrfA-gfp in plant leaf and root tissues significantly declined three to seven days after spraying bacterial suspension compared to XF-1-gfp. This study suggested that surfactin had an obvious promotion effect on the colonization of XF-1 in the phyllosphere of Chinese cabbage， which was significantly inhibited when the srfA gene was knocked out.

Key words

surfactin; Bacillus subtilis; colonization; growth curve; swarming; biofilm

有益生防芽胞桿菌能夠通過多種機制促進植物生長，幫助植物抵御病原菌的侵染。促生與生防作用的基礎(chǔ)是芽胞桿菌在植株組織內(nèi)的定殖數(shù)量必須達(dá)到能夠發(fā)揮作用的最低數(shù)量級[1]。在植物根際，除初始接種種群數(shù)量外，土壤中的芽胞桿菌的定殖主要取決于4個關(guān)鍵因素：植物根系分泌物的含量和種類、細(xì)菌對植物根系分泌物的趨化性、在植物根表形成生物膜水平及群集運動能力。其中，首先發(fā)揮作用的是趨化反應(yīng)和運動能力。細(xì)菌靠近或接觸根表后才開始形成生物膜[2-4]，逐步完成定殖過程。植物葉際與根際的環(huán)境差異巨大，與根際環(huán)境相比，葉際微生物直接暴露于大氣之中，受到自然環(huán)境的影響，同時間接受到植物代謝物的影響，生存條件極為惡劣[5]。此外，由于植物葉片存在蠟質(zhì)角質(zhì)層，葉際分泌物較根系分泌物含量和種類均較為匱乏，濕度和溫度變化較快，外加光照、紫外線、風(fēng)力等環(huán)境因子的影響[5-6]，可能使得芽胞桿菌在植物葉際的定殖模式和分子機制與根際有較大的差異。

表面活性素（surfactin）是一類脂肽類抗生素，芽胞桿菌普遍產(chǎn)生表面活性素。表面活性素具有的一個顯著特點是減小表面張力。由于群集運動需要細(xì)菌個體之間的相互交流和作用，故表面活性素等表面活性物質(zhì)的生物合成與分泌是影響細(xì)菌群集運動能力的關(guān)鍵因素之一[7]。表面活性素等多種脂肽類抗生素在芽胞桿菌生物膜形成過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，López等報道了表面活性素促進芽胞桿菌3610生物膜形成與鉀離子泄漏有關(guān)[8]。因此，表面活性素的生物合成與分泌也是促進芽胞桿菌根際定殖的關(guān)鍵因素之一。然而，表面活性素是否影響內(nèi)生芽胞桿菌在寄主葉際的定殖能力及相關(guān)分子機制尚不明確。

枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis XF-1（CGMCC No.2357）（下稱XF-1）分離自根腫病重病田的大白菜根際土壤，具有內(nèi)生特性，對由蕓薹根腫菌Plasmodiophora brassicae Woronin侵染引起的土傳病害大白菜根腫病有良好的生防效果，應(yīng)用潛力巨大[9-11]。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)，葉面噴施XF-1能有效減輕大白菜根腫病的危害程度[12]，但其在葉際定殖的分子機制尚不明確。為了研究XF-1菌株在大白菜葉際的定殖模式和相關(guān)分子機制，本文以XF-1和其表面活性素缺陷突變體XF-1-ΔsrfA（不分泌表面活性素）為材料，利用群集運動試驗、生物膜形成試驗和盆栽條件下葉表黏附及組織內(nèi)定殖能力監(jiān)測試驗，初步探究表面活性素對XF-1在大白菜葉際定殖的促進作用，以期為田間條件下葉面噴施XF-1防控大白菜根腫病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

枯草芽胞桿菌 Bacillus subtilis XF-1和其表面活性素缺陷突變體XF-1-ΔsrfA及相應(yīng)的綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記菌株XF-1-gfp與XF-1-ΔsrfA-gfp，均保存于本實驗室。

1.1.2 供試大白菜

大白菜品種‘青島83-1 種子購自昆明市農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.3 試劑

氯霉素購自索萊寶（Solarbio）科技有限公司（北京）;Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR試劑購自全式金生物技術(shù)有限公司（北京）;其余試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.1.4 供試培養(yǎng)基

泳動培養(yǎng)基：蛋白胨1%（m/V，下同），氯化鈉0.25%，瓊脂粉0.3%。群集培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%，蛋白胨10%，酵母粉5%，氯化鈉5%，瓊脂粉06%。LB培養(yǎng)基：蛋白胨10%，酵母粉5%，氯化鈉5%，瓊脂粉2%。MSgg培養(yǎng)基：氯化鎂2 mmol/L，氯化鈣700 mmol/L，氯化鐵50 mmol/L，氯化錳 50 mmol/L，氯化鋅 1 mmol/L，硫銨2 mmol/L，3-嗎啉丙磺酸（MOPS）溶液100 mmol/L（pH 7.0），磷酸鉀緩沖液5 mmol/L（pH 7.0），甘油5%，谷氨酸0.5%，苯丙氨酸50 mg/mL，色氨酸50 mg/mL。生物膜測定漂洗緩沖液：硫酸銨 150 mmol/L，磷酸二氫鉀 100 mmol/L，檸檬酸鈉 34 mmol/L，硫酸鎂 1 mmol/L，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 野生型菌株XF-1與突變體菌株的生長曲線測定

將過夜活化的細(xì)菌接種于新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃，160 r/min，振蕩培養(yǎng)4～6 h，用無菌水重懸至OD600=0.6作為種子液。按1∶100的接種量將種子液轉(zhuǎn)接至裝有100 mL液體LB培養(yǎng)基的三角瓶（500 mL）內(nèi)，每個菌株設(shè)3個重復(fù)。37℃ 振蕩培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)接后的0、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、72 h取樣，用紫外分光光度計測定波長600 nm處的吸光度。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，各培養(yǎng)階段的吸光值為縱坐標(biāo)，比較XF-1和突變體XF-1-ΔsrfA在LB培養(yǎng)基中的生長差異。

1.2.2 野生型菌株XF-1與突變體菌株的運動性測定

運動性包括泳動運動和群集運動。將過夜活化的細(xì)菌接種于新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃，160 r/min，振蕩培養(yǎng)，直至OD600達(dá)到約1.0時，用牙簽尖部蘸取細(xì)胞培養(yǎng)物分別轉(zhuǎn)接至芽胞桿菌泳動運動和群集運動試驗平板的中央。室溫培養(yǎng)12～48 h后測定所形成的菌落直徑或拍照。

1.2.3 野生型菌株XF-1與突變體菌株的生物膜測定

生物膜試驗用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板進行（JET BIOFIL， 海門），具體流程參照Hamon等[13]的方法稍做修改。將過夜活化的細(xì)菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)，直至OD600達(dá)到約1.0時，4℃離心收集菌體。用無菌水洗滌菌體并重懸于與LB培養(yǎng)液等體積的MSgg培養(yǎng)基中。往細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中加入2 mL的MSgg培養(yǎng)基，然后分別接種10 μL XF-1或XF-1-ΔsrfA菌懸液，各設(shè)置3個重復(fù)，于37℃靜置培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后24 h和48 h，用槍頭小心吸凈生物膜下的液體培養(yǎng)基和游離的細(xì)胞，加入適量的漂洗緩沖液輕柔漂洗3次。室溫下自然風(fēng)干，加入適量含33%乙酸的1%結(jié)晶紫染液，室溫染色20 min。染色結(jié)束后用ddH2O漂洗5～10次，再加入200 μL 洗膜緩沖液（33%乙酸）置于搖床上低速振蕩15 min（37℃，70 r/min），稀釋5～10倍后于570 nm處測定吸光度。

1.2.4 野生型菌株XF-1與突變體菌株的黏附試驗

芽胞桿菌重懸液的制備：將過夜活化的GFP標(biāo)記菌株XF-1-gfp與XF-1-ΔsrfA-gfp轉(zhuǎn)接至液體LB培養(yǎng)基（含10 μg/mL氯霉素）中。37℃，160 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h，制得穩(wěn)定期培養(yǎng)物。培養(yǎng)結(jié)束后，室溫離心（2 700 g，10 min）收集菌體，然后使用0.85%的生理鹽水清洗并重懸菌體細(xì)胞。芽胞桿菌重懸液現(xiàn)配現(xiàn)用。

挑取健康飽滿的大白菜種子表面消毒后播種于裝有滅菌自然土的營養(yǎng)缽（18 cm×18 cm）中。出苗20～30 d后，首先在無菌條件下去除最外面的兩片子葉，隨機挑取2～3片內(nèi)部的真葉，用手術(shù)刀將其切成3 cm×3 cm的小塊;然后將切取的大白菜小塊葉片置于培養(yǎng)皿（d=9 cm），每個培養(yǎng)皿放1小塊葉片，加入25 mL生理鹽水，保證葉片被完全浸沒;最后將整個培養(yǎng)皿置于30℃和高強度光照（7 500 lx）條件下預(yù)處理20 min。預(yù)處理結(jié)束后，小心移除培養(yǎng)皿內(nèi)生理鹽水，重新加入25 mL? XF-1-gfp或突變體XF-1-ΔsrfA-gfp懸浮液（108 cfu/mL），置于相同的光照條件下水浴30 min。

水浴結(jié)束后，將葉片在無菌生理鹽水中連續(xù)漂洗10次以移除未黏附菌。將葉片轉(zhuǎn)入研缽中快速研磨成勻漿，用梯度稀釋法稀釋勻漿液并涂布到含10 μg/mL氯霉素的LB固體平板上。37℃靜置培養(yǎng)24 h，次日于光電折射儀下統(tǒng)計平板上的熒光菌落數(shù)。

1.2.5 野生型菌株XF-1與突變體菌株的定殖監(jiān)測

大白菜栽培于營養(yǎng)缽（18 cm×18 cm）中，出苗10 d后，每盆保留長勢一致的幼苗2株作為試驗材料。參照何朋杰等[12]的方法接種XF-1-gfp、XF-1-ΔsrfA-gfp菌懸液：取適量的無菌吸水紙輕柔地包裹住幼苗莖基部至完全覆蓋盆栽土壤，然后用無菌棉球蘸取菌懸液輕輕擦拭大白菜幼苗的全部葉片表面，使葉表完全潤濕但不能有液滴滴下，5 min后小心移除吸水紙。本試驗同時設(shè)立野生型菌株XF-1和無菌水兩個對照處理，每處理種植大白菜幼苗9盆，每3盆為1組分別用于處理后第3、5、7天取樣，結(jié)合選擇性培養(yǎng)與光電折射儀，采用梯度稀釋涂板法回收監(jiān)測標(biāo)記菌在大白菜的根以及葉組織內(nèi)的定殖數(shù)量[14-15]。根系樣品的采集和處理：取3盆大白菜幼苗將其中6棵苗全部從土壤中輕輕拔起，置于水龍頭下輕柔沖洗后用吸水紙吸干表面水分;然后將根剪成長約 1～1.5 cm的小段，稱重，經(jīng)表面消毒（1%次氯酸鈉溶液消毒5 min，75%乙醇消毒3 min）后在無菌條件下研磨均勻，按每克根加9 mL無菌水的比例轉(zhuǎn)移至試管中;渦旋混勻后梯度稀釋至10-1和10-2，取稀釋液涂布于含10 μg/mL氯霉素的LB平板上，每濃度涂3個平板，37℃靜置培養(yǎng)16～30 h，待菌落長出后置于光電折射儀下統(tǒng)計發(fā)光菌落數(shù)。除表面消毒時間（1%次氯酸鈉溶液消毒2 min，75%乙醇消毒2 min）不同外，大白菜葉片樣品（第1和第2片真葉）的采集和處理方式與根系一致。

1.3 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS 22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，采用Duncan氏新復(fù)極差法做差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體菌株與野生型菌株XF-1生長的差異

為了明確srfA基因敲除后生長速度對菌株運動性與生物膜形成及葉際定殖的影響，本研究首先比較了XF-1及突變體XF-1-ΔsrfA的生長差異。如圖1所示，兩菌株生長曲線沒有明顯差異。說明在室內(nèi)條件下，srfA基因的敲除不會導(dǎo)致菌株生長發(fā)生滯后現(xiàn)象。

2.2 突變體菌株與野生型菌株XF-1運動能力的差異

表面活性物質(zhì)在芽胞桿菌的鞭毛運動行為中充當(dāng)著“潤滑劑”的作用，故表面活性素合成缺失后芽胞桿菌的運動能力極可能大幅減弱。分別接種XF-1及XF-1-ΔsrfA至泳動、群集運動平板（圖2a）中。結(jié)果表明，與野生型菌株XF-1相比，表面活性素合成缺失后運動能力顯著減弱，突變體XF-1-ΔsrfA泳動能力和群集運動能力分別下降了36.8%和439%（圖2b）。

2.3 突變體菌株與野生型菌株XF-1生物膜形成能力的差異

采用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板靜置培養(yǎng)和結(jié)晶紫染色的方法定量測定了XF-1及XF-1-ΔsrfA的生物膜形成能力。試驗結(jié)果（圖3）表明，在室內(nèi)條件下，XF-1-ΔsrfA較XF-1在24 h時生物膜形成能力下降53.9%，差異顯著，而在48 h時二者的成膜能力相近。表明表面活性素僅在早期（<48 h）影響XF-1生物膜的形成，且表面活性素只是調(diào)控芽胞桿菌生物膜形成的因子之一。

2.4 突變體菌株與野生型菌株XF-1葉表黏附能力的差異

為研究表面活性素對XF-1葉表黏附能力的影響，首先分別將XF-1-gfp、XF-1-ΔsrfA-gfp與新鮮大白菜葉片置于光照條件下共培養(yǎng)30 min （30℃），然后稀釋涂板檢測葉表及葉內(nèi)的標(biāo)記菌總數(shù)量。檢測結(jié)果如圖4所示，監(jiān)測回收到的XF-1-ΔsrfA-gfp菌落數(shù)量約為XF-1-gfp數(shù)量的20%，XF-1-ΔsrfA-gfp黏附效率較XF-1-gfp約下降80%，表明表面活性素確實是影響芽胞桿菌在葉表黏附的關(guān)鍵因子。

2.5 表面活性素合成缺陷顯著降低XF-1在大白菜植株內(nèi)的定殖能力

為明確XF-1及其突變體XF-1-ΔsrfA在大白菜葉際定殖能力的差異，監(jiān)測了目標(biāo)標(biāo)記菌在大白菜葉組織內(nèi)的定殖數(shù)量。結(jié)果表明，與標(biāo)記菌處理組相比，接種野生型菌株XF-1和無菌水后，抗性平板上均無熒光菌落生長（數(shù)據(jù)未展示）;接種標(biāo)記菌株3～7 d后，菌株XF-1-gfp與突變體XF-1-ΔsrfA-gfp在葉片內(nèi)定殖數(shù)量差異顯著（15～62倍，圖5）。

XF-1在大白菜根系內(nèi)的定殖結(jié)果（圖6）顯示，噴施接種后第3天，根系內(nèi)即檢測到大量XF-1-gfp（5×102 cfu/g），但未檢測到突變體菌株XF-1-ΔsrfA-gfp。接種后第5天，根系內(nèi)XF-1-gfp菌落的數(shù)量達(dá)到峰值（約1.5×103 cfu/g），此后逐漸下降并在接種后第7天下降至約8×102 cfu/g;與此同時，檢測到的突變體XF-1-ΔsrfA-gfp的菌落數(shù)量均顯著低于XF-1-gfp，接種后第5天和第7天XF-ΔsrfA-gfp的菌落數(shù)量分別為50 cfu/g與2×102 cfu/g。上述結(jié)果表明表面活性素不僅影響XF-1在大白菜植株內(nèi)的遷移速度，還影響其在植株內(nèi)的種群數(shù)量。

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生生防菌在防控植物病害、減少農(nóng)業(yè)損失、提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)等方面發(fā)揮重要作用?？莶菅堪麠U菌XF-1是本實驗室從大白菜根腫病重病田的健康植株根際分離得到的一株生防菌株，能夠合成分泌表面活性素、豐齊素、伊枯草菌素等次生代謝產(chǎn)物，因其對根腫病優(yōu)異的生防效果，現(xiàn)已研制成100億芽孢/g可濕性粉劑在全國范圍內(nèi)大面積推廣應(yīng)用[9-11，16-17]。有趣的是，采用葉面噴施的方式它也能定殖在植株組織內(nèi)并有效防控大白菜根腫病[12]。本文中，以菌株XF-1和其表面活性素合成缺陷突變體XF-1-ΔsrfA為材料，明確了表面活性素在XF-1于大白菜葉際定殖中所扮演的角色，為進一步研究XF-1在大白菜葉際和植株內(nèi)定殖機制及提高大田環(huán)境和噴施接種方式下XF-1生防效果的穩(wěn)定性提供了基礎(chǔ)。

芽胞桿菌的根際定殖與其趨化性、運動性和生物膜的形成密切相關(guān)[3-4]。表面活性素等表面活性物質(zhì)一方面具有增加表面張力和起到潤滑劑的作用，是細(xì)菌在介質(zhì)表面黏附和群集運動必不可少的前提條件[7，18]，也間接影響了芽胞桿菌的趨化速度[18-19];另一方面通過細(xì)胞膜上的K離子通道促進生物膜的形成[8]。本研究對野生型及其突變體菌株的運動能力和生物膜形成能力分析后發(fā)現(xiàn)，突變體XF-1-ΔsrfA的群集運動能力較野生型菌株XF-1顯著降低（低43.9%）;其成膜能力在靜置培養(yǎng)24 h時顯著低于XF-1（低539%），而培養(yǎng)48 h二者無顯著差異。泳動運動是依賴鞭毛旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的動力而行進的一種細(xì)菌運動類型，其與群集運動的區(qū)別是，泳動是細(xì)菌以單個個體在液體環(huán)境中移動。此前有研究表明表面活性素與細(xì)菌的泳動運動并無關(guān)聯(lián)[7，18]。而Ghelardi等[18]發(fā)現(xiàn)表面活性素通過上調(diào)鞭毛蛋白的表達(dá)，促進枯草芽胞桿菌PB1831的泳動。有趣的是，本研究試驗結(jié)果表明表面活性素合成缺失后，XF-1-ΔsrfA的泳動能力較野生型菌株下降了36.8%，與Ghelardi等試驗結(jié)果相似，表明表面活性素不僅在XF-1的群集運動中發(fā)揮潤滑作用，而且也可通過促進鞭毛的合成正向介導(dǎo)XF-1的泳動運動，但尚需后續(xù)的試驗進一步證實。由于上述因素，表面活性素在芽胞桿菌的根際定殖中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[18]。筆者猜測XF-1在大白菜葉際的定殖與根際定殖機制相似，但因為葉際環(huán)境的特殊性，如光照、溫度的變化和葉際分泌物的匱乏，導(dǎo)致定殖模式發(fā)生一定程度的改變[4-6]。內(nèi)生微生物必須在短時間內(nèi)成功黏附在葉表或快速通過氣孔進入葉片內(nèi)，才能有效規(guī)避外界環(huán)境中的不利條件，高效地定殖在適宜的生存環(huán)境——寄主植株內(nèi)。根據(jù)微生物的根際定殖機制[3， 18-20]，表面活性素對芽胞桿菌運動能力和成膜能力的提升極可能提高內(nèi)生芽胞桿菌在寄主葉表的成膜能力和進入葉肉組織的速度，從而促進其在寄主葉際的定殖能力。本文將GFP標(biāo)記菌株XF-1-gfp及突變體XF-1-ΔsrfA-gfp與大白菜葉片置于光照條件下共培養(yǎng)30 min，結(jié)果表明，葉片表面黏附和葉內(nèi)定殖XF-1-gfp的數(shù)量顯著高于XF-1-ΔsrfA-gfp;接種后3～7 d，葉片內(nèi)檢測到的XF-1-gfp的數(shù)量顯著高于突變體XF-1-ΔsrfA-gfp。

此外，微生物在寄主內(nèi)的增殖速度和存活時間也在一定程度上限制其定殖的種群規(guī)模。有報道稱表面活性物質(zhì)合成缺失雖然不影響其在室內(nèi)條件下的生長速率，但使其在與其他內(nèi)生微生物的競爭中處于不利地位，使得微生物在植株內(nèi)的最大種群數(shù)量大幅下降[21]。在本研究中也觀察到相似的結(jié)果，隨著監(jiān)測回收時間點的推移，XF-1-gfp和突變體XF-1-ΔsrfA-gfp在大白菜葉片內(nèi)的種群數(shù)量的差異逐漸增大。接種后3 d，根系組織中未回收到XF-1-ΔsrfA-gfp，但回收到約5×102 cfu/g的XF-1-gfp，這可能與突變體XF-1-ΔsrfA的運動能力較弱有關(guān);接種后7 d，檢測到的XF-1-ΔsrfA-gfp定殖量顯著低于XF-1-gfp，再次表明XF-1-ΔsrfA在寄主組織內(nèi)增殖或存活能力可能較XF-1弱。

植物內(nèi)生生防菌通過多種機制幫助植物抵御外來病原微生物的侵染，如產(chǎn)生抗生素、抑制病原菌生長、提高植物抗逆性及高效快速定殖等。本研究中，喪失合成表面活性素能力的XF-1突變體（XF-1-ΔsrfA-gfp）接種至大白菜葉際，其在植株組織內(nèi)定殖能力顯著低于野生型菌株。根據(jù)本研究的結(jié)果，在后續(xù)的工作中，可以通過盆栽和大田試驗對比，研究噴施接種XF-1及突變體XF-1-ΔsrfA對根腫病的防治效果，同時采用分子遺傳育種的方法，過表達(dá)XF-1基因組中的表面活性素基因簇，進一步提高XF-1的葉際定殖能力，分析不同突變體對根腫病的防治效果，從而有效提高XF-1的田間應(yīng)用效果，減少根腫病的發(fā)生與危害。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）