人參內(nèi)生細(xì)菌NJ13在宿主體內(nèi)定殖特性及對(duì)人參黑斑病的防治效果

陳長(zhǎng)卿+李桐+李欣蓮+姜云+田磊+許鵬

[收稿日期] 2013-10-22

[基金項(xiàng)目] 吉林省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（20140204055NY）；國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201310193001）

[通信作者] *陳長(zhǎng)卿，副教授，研究方向?yàn)樗幱弥参锊『ι锓乐?，E-mail：ccqjy@163.com

[摘要] 為明確人參內(nèi)生生防細(xì)菌NJ13在宿主體內(nèi)的定殖特性，該研究通過(guò)抗生素誘導(dǎo)獲得了同時(shí)對(duì)利福平和硫酸鏈霉素具有穩(wěn)定抗性的雙抗標(biāo)記菌株NJ13-R，分析了菌株在宿主體內(nèi)的定殖特性，并研究了NJ13對(duì)人參黑斑病的田間防治效果。結(jié)果表明，菌株在人參根、莖、葉部均可定殖，而且定殖量與接種濃度呈正相關(guān)。菌株可在人參不同部位侵染植株并在體內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移，在根部和葉部定殖量表現(xiàn)為先升后降的變化趨勢(shì)，而在莖部呈先升高后平緩趨勢(shì)。研究還發(fā)現(xiàn)，生防細(xì)菌NJ13表現(xiàn)出對(duì)宿主特定部位具有一定的偏好性，隨著時(shí)間推移在莖部的定殖量高于其他部位。田間試驗(yàn)證明，生防細(xì)菌NJ13對(duì)人參黑斑病具有較好的防治作用，其中0.76×108 cfu·mL^-1發(fā)酵液防效達(dá)75.62%，高于對(duì)照藥劑0.67 mg·L^-150%嘧菌環(huán)胺WG的防效（73.06%）。

[關(guān)鍵詞] 內(nèi)生細(xì)菌； 定殖； 人參黑斑病； 生物防治

人參Panax ginseng CA Mey為五加科人參屬多年生宿根草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中草藥，素有“百草之王”的美譽(yù)，主要分布在我國(guó)東北長(zhǎng)白山地區(qū)。由鏈格孢菌Alternaria panax Whetz.引起的人參黑斑病，是人參生產(chǎn)上發(fā)生最為普遍、分布最為廣泛、為害最為嚴(yán)重的病害之一。該病害主要為害人參地上部，包括葉片、莖稈、花梗和果實(shí)等部位，尤以葉斑和莖斑發(fā)生最為普遍，吉林省高發(fā)期集中在7—8月份，常年發(fā)病率在20%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80～100%，造成早期落葉、植株枯萎、不結(jié)實(shí)，參根和參籽減產(chǎn)，品質(zhì)下降^[1]。目前，生產(chǎn)上人參黑斑病主要以化學(xué)防治為主，然而在病害防治過(guò)程中化學(xué)農(nóng)藥的不科學(xué)使用，暴露出了人參農(nóng)藥殘留超標(biāo)、出口率降低、病原菌抗藥性產(chǎn)生以及污染生態(tài)環(huán)境等系列問(wèn)題。因此，生物防治等更為安全有效的防治措施研究亟待開(kāi)展。

目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于人參黑斑病生物防治的研究報(bào)道相對(duì)較少，主要集中在生防菌的分離篩選及發(fā)酵條件研究。崔立萍等^[2]從土壤和人參黑斑病菌組織中分離篩選出對(duì)人參黑斑病菌有拮抗作用的菌株22個(gè)。李勇等^[3]從人參根中分離出40株內(nèi)生細(xì)菌，通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)篩選獲得了對(duì)人參黑斑病菌有抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌Stenotrophomonas maltophilia和Bacillus sp.。周如軍等^[4-5]從人參根際土壤中篩選到對(duì)人參銹腐病菌有拮抗活性的細(xì)菌2株和真菌1株，其對(duì)人參黑斑病菌有一定的抑菌效果，并對(duì)上述菌株進(jìn)行了鑒定及最適發(fā)酵條件研究。

生防菌在植物體內(nèi)的有效定殖是其控制植物病害的關(guān)鍵，因此，明確生防菌的定殖特性是揭示其生防機(jī)制和評(píng)價(jià)其應(yīng)用潛力的重要依據(jù)。而目前關(guān)于人參內(nèi)生菌的定殖及人參黑斑病田間生物防治研究還未見(jiàn)報(bào)道。本課題組從人參莖部分離獲得了1株對(duì)人參主要病害病原菌具有較好抑菌活性的內(nèi)生細(xì)菌菌株NJ13，經(jīng)鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌Bacillus methylotrophicus，明確了最適發(fā)酵培養(yǎng)條件^[6]。為進(jìn)一步挖掘NJ13菌株的生防潛力，本研究擬對(duì)菌株在人參體內(nèi)的定殖特性及其對(duì)人參黑斑病的田間防治效果進(jìn)行分析，為開(kāi)展該菌株更為廣泛的生物防治及相關(guān)研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基 供試生防菌株NJ13 B. methylotrophicus，由本課題組分離獲得；人參黑斑病菌A. panax由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

NJ13按常規(guī)方法在NA（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）上繁殖保存，其發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖3%、可溶性淀粉1.5%，酵母浸粉1.5%，K2HPO4 0.1%，NaCl 0.5%，起始pH 8.0；靶標(biāo)菌在常規(guī)PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）上繁殖保存。

1.2 試驗(yàn)藥劑 利福平（rifampicin， Rif）和硫酸鏈霉素（streptomycin sulfate， Stre），購(gòu)于北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，分別使用甲醇和無(wú)菌水溶解。50%嘧菌環(huán)胺WG購(gòu)于先正達(dá)中國(guó)投資有限公司。

2 方法

2.1 NJ13菌株發(fā)酵液的制備 將NJ13菌株劃線接種于NA平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d。待菌落長(zhǎng)好后用直徑1 cm的打孔器打取2塊菌碟，接種于滅菌的LB培養(yǎng)液（胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 L，pH 7.4）中培養(yǎng)10 h，制備成發(fā)酵種子液，4%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，起始pH 8.0、搖瓶（250 mL）裝量75 mL/瓶，轉(zhuǎn)速為180 r·min^-1，28 ℃搖瓶培養(yǎng)96 h得培養(yǎng)液。

2.2 NJ13對(duì)人參黑斑病菌的抑制作用 采用平板對(duì)峙法^[7]測(cè)定NJ13菌體對(duì)人參黑斑病菌的抑制作用，取培養(yǎng)7～10 d的人參黑斑病菌平板，用直徑8 mm的打孔器在菌落邊緣打下菌碟，置于PDA平板一側(cè)，另一側(cè)放入8 mm的細(xì)菌菌碟，25 ℃培養(yǎng)5～7 d，測(cè)定抑菌帶大小。

采用混菌法^[7]測(cè)定NJ13代謝物對(duì)人參黑斑病菌的抑制作用，①對(duì)將1 mL無(wú)菌水加入人參黑斑病菌的培養(yǎng)試管中，用接種針將菌絲和孢子刮下制成菌懸液與PDA培養(yǎng)基10 mL 混勻后到入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中制成平板。②將NJ13發(fā)酵液12 000 r·min^-1離心30 min，取上清液，然后用0.22 μm的滅菌細(xì)菌過(guò)濾器除菌得無(wú)菌培養(yǎng)濾液備用。③將無(wú)菌牛津杯置于充分冷卻后的平板中央，向牛津杯中加入200 μL無(wú)菌發(fā)酵液，25 ℃培養(yǎng)5～7 d，十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑。endprint