硝態(tài)氮和銨態(tài)氮對玉米幼苗中吡蟲啉積累和分配的影響

何 琴，張興興，賴鑒添，邵丹青，周宇明，申建梅，盧穎林，安玉興

1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院資源與環(huán)境學院，廣東 廣州 510225；2.廣東省科學院南繁種業(yè)研究所/廣東省藥肥工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510316；3.華南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，廣東 廣州 510642）

【研究意義】玉米（Zea maysL.）作為我國傳統(tǒng)的三大主糧作物之一，在“經(jīng)-糧-飼”三元種植結(jié)構(gòu)體系中扮演著十分重要的作用，其產(chǎn)量的穩(wěn)定性決定了我國糧食市場的供給平衡。農(nóng)藥和化肥施用是保證玉米高產(chǎn)的重要措施，但不合理使用也會帶來農(nóng)田土壤酸化、土壤板結(jié)、土壤微生物多樣性降低以及食品農(nóng)藥殘留超標、大氣及水體污染等諸多環(huán)境和食品安全問題［1］。吡蟲啉是一種新型高效氯代煙堿類廣譜殺蟲劑，可用于螟蟲、棉蚜、薊馬、蠐螬等害蟲的田間防治［2-5］。2019 年殺蟲劑市場調(diào)研結(jié)果顯示吡蟲啉在全球的銷售額排名第三，銷售量排名第四，在全球范圍內(nèi)的使用非常廣泛［6］。近年來，噴施和拌種等施藥方式下吡蟲啉等新煙堿類農(nóng)藥活性成分只有5%左右被農(nóng)作物吸收，90%進入到農(nóng)田土壤或大氣中，普遍存在利用率低的現(xiàn)象，由此也造成環(huán)境污染、生態(tài)失衡以及增加人體暴露風險等負面影響［7-11］。提高利用率、減少使用量是降低環(huán)境污染和人體吡蟲啉暴露風險的重要途徑?！八幏室惑w化技術(shù)”是近年來提出的一種新型施藥施肥技術(shù)，通過科技手段將農(nóng)藥和肥料科學組合、共同施用，達到提高藥效和肥效以及省時省工的目的。【前人研究進展】研究顯示，30%甜歌多功能藥肥（0.32%殺單·毒死蜱，基肥型N∶P2O5∶K2O=10∶10∶10，追肥型N∶P2O5∶K2O=12∶6∶12）兼具營養(yǎng)與殺蟲雙重功效，可在有效控制常見蔗田害蟲的同時促進甘蔗生長［12］。張夢晗等［13］的研究發(fā)現(xiàn)吡蟲啉種衣劑能夠促進小麥幼苗中游離氨基酸和可溶性蛋白的含量，加快植株氮代謝。和銳敏等［14］研究發(fā)現(xiàn)吡蟲啉與銨態(tài)氮共施有利于甘蔗的生長，與硝態(tài)氮共施可增加甘蔗的鮮重以及促進根系的生長?！颈狙芯壳腥朦c】目前，對吡蟲啉如何影響植物氮素代謝以及氮素對吡蟲啉在植物中的吸收轉(zhuǎn)運的影響研究較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析硝態(tài)氮和銨態(tài)氮對玉米吸收轉(zhuǎn)運吡蟲啉的影響，探討不同形態(tài)氮素在玉米幼苗積累和運輸吡蟲啉過程中的作用，解析其間的傳導關(guān)系，旨在為玉米生產(chǎn)中氮肥和吡蟲啉的合理施用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為超甜金銀粟2 號甜玉米，該品種綜合性狀較穩(wěn)定，非常適宜在廣州地區(qū)推廣種植［15］，購于廣東省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所。

1.2 試驗方法

試驗于2020 年12 月至2021 年4 月在廣東省科學院南繁種業(yè)研究所廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（藥肥互作與作物逆境調(diào)控）產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心進行。試驗通過水培方式研究不同氮素對玉米吡蟲啉吸收的影響，設(shè)置硝態(tài)氮（NO3-）和銨態(tài)氮（NH4+）2種氮素處理，濃度分別為正常供氮量4 mmol/L 和高濃度供氮量10 mmol/L，吡蟲啉處理濃度為1.0、2.5、5.0 mg/L，共12 個處理，每個處理3 次重復。

1.2.1 植物材料培養(yǎng) 玉米種子用去離子水清洗，5%次氯酸鈉浸泡15 min 后再用去離子水清洗8～10 次，于25 ℃培養(yǎng)箱中浸種6 h，之后置于濕潤的蛭石中萌發(fā)，待玉米種子長出兩葉一心時將其移栽到有孔有機板上，置于盛有4 種不同營養(yǎng)液（pH，5.6～5.8）的塑料盒中，每盒9 株苗，每隔2 d 完全更換1 次營養(yǎng)液。營養(yǎng)液配置方法見表1。

表1 改良Hoagland 營養(yǎng)液成分Table 1 Composition of the improved Hoagland nutrient solution

玉米幼苗生長環(huán)境為人工培養(yǎng)箱，生長條件：白天溫度25 ℃、時間16 h，夜間溫度20 ℃、時間8 h，相對濕度為60%～80%。

1.2.2 植物材料處理 玉米材料在營養(yǎng)液中培養(yǎng)15 d 后，營養(yǎng)液加入吡蟲啉處理，處理濃度設(shè)置為1.0、2.5、5.0 mg/L，每個處理3 次重復。繼續(xù)培養(yǎng)15 d 后，用二氯乙烷清洗玉米根部15 s，再用去離子水清洗干凈、吸水紙擦干，最后分別收取根、莖和葉并用液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測定項目及方法

1.3.1 吡蟲啉含量測定（1）標準曲線繪制。用分析天平準確稱取一定量的吡蟲啉標準品，用乙腈充分攪拌使其溶解，配制成質(zhì)量濃度為1.0 g/L的標準母液，再梯度稀釋為0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L 的系列標準工作溶液，每個濃度3 個重復，經(jīng)0.22 μm 有機微孔過濾膜過濾進入進樣瓶，待測。吡蟲啉濃度的檢測采用高效液相色譜儀，采用Agilent Zorbax TC-C18 檢測柱，流動相為（水∶乙腈）=70 ∶30，柱溫30 ℃，進樣量10 mL，流速1 mL/min，檢測器波長270 nm。以測定濃度為橫坐標（X）、其對應(yīng)峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸計算，求得吡蟲啉的標準曲線為Y=479.06X+1.3853，R2=1.00。

（2）玉米幼苗中吡蟲啉含量測定。采用高效液相色譜法測定吡蟲啉殘留含量的檢測方法，略作改動：分別稱取玉米幼苗根、莖、葉1.0 g 研磨成粉末，加入2 mL 乙腈，靜置提取30 min；依次向離心管中加入無水硫酸鎂0.2 g、氯化鈉0.3 g，振蕩器震蕩1 min 后7 000 r/min 離心5 min；取1.5 mL 上清液，加入到含有無水硫酸鎂0.15 g 和石墨化碳黑0.02 g 的2 mL 離心管中，振蕩1 min 后在5 000 r/min 下離心5 min，用一次性無菌注射器吸取上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾至HPLC 進樣瓶中，上機測定，根據(jù)標準曲線計算樣品中吡蟲啉含量。

1.3.2 玉米各部位吡蟲啉生物富集因子和轉(zhuǎn)運因子計算方法 玉米幼苗對吡蟲啉的吸收潛力和富集程度用生物富集因子（Bioconcentration factors，BCFs）表示［16］，吡蟲啉在玉米幼苗體中的轉(zhuǎn)運程度用轉(zhuǎn)運因子（Translocation factors，TFs）表示：

根部生物富集因子（RCF）=C根/C液

莖部生物富集因子（SCF）=C莖/C液

葉部生物富集因子（LCF）=C葉/C液

根到莖的轉(zhuǎn)運因子（TF莖/根）=C莖/C根

莖到葉的轉(zhuǎn)運因子（TF葉/莖）=C葉/C莖

式中，C根、C莖、C葉分別為玉米幼苗根、莖、葉中的吡蟲啉含量，C液為營養(yǎng)液中吡蟲啉的濃度。

試驗數(shù)據(jù)采用 IBM SPSS Statistics 20 進行統(tǒng)計，采用LSD進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝態(tài)氮和銨態(tài)氮處理對玉米幼苗吡蟲啉含量的影響

為研究營養(yǎng)液中吡蟲啉添加量對玉米幼苗根、莖、葉中吡蟲啉積累的影響，利用高效液相色譜儀分別測定1.0、2.5、5.0 mg/L 吡蟲啉處理下玉米幼苗根、莖、葉中吡蟲啉的含量，結(jié)果（圖1）顯示，吡蟲啉含量最高的部位是葉片，其次是根，莖中的含量最低，在4 種氮素供應(yīng)條件（4、10 mmol/L NO3-，4、10 mmol/L NH4+）下，吡蟲啉含量均表現(xiàn)為葉＞根＞莖，表明玉米幼苗葉片是吡蟲啉積累的主要部位。當吡蟲啉處理濃度升高時，硝態(tài)氮為氮源培養(yǎng)的玉米葉片中吡蟲啉含量逐漸升高，而銨態(tài)氮為氮源的玉米幼苗中吡蟲啉含量無顯著變化或呈現(xiàn)下降趨勢。此外，本研究結(jié)果顯示氮素形態(tài)影響玉米幼苗中吡蟲啉的積累。在3 個吡蟲啉濃度處理下，當供氮量相同時，以硝態(tài)氮為氮源培養(yǎng)的玉米，根、莖、葉中吡蟲啉的含量明顯高于銨態(tài)氮培養(yǎng)的玉米幼苗。以2.5 mg/L吡蟲啉濃度處理為例，4 mmol/L NO3-處理根中吡蟲啉含量為4 mmol/L NH4+處理的3.09 倍、10 mmol/L NO3-處理為10 mmol/L NH4+處理的5.15倍，莖中分別為1.90、3.04倍，葉中分別為1.70、3.22倍，這也表明葉片是玉米幼苗中吡蟲啉積累的主要部位，吡蟲啉在玉米幼苗中的積累與其添加量相關(guān)，添加濃度越高，玉米幼苗中的積累量越高；氮素形態(tài)與玉米幼苗中吡蟲啉積累量顯著相關(guān)，硝態(tài)氮為氮源更有利于玉米幼苗中吡蟲啉的積累。

圖1 不同供氮條件下玉米幼苗根、莖、葉中吡蟲啉的含量Fig.1 Contents of imidacloprid in roots，stems and leaves of maize seedling under different nitrogen supply conditions

2.2 硝態(tài)氮和銨態(tài)氮處理對玉米幼苗吡蟲啉生物富集因子的影響

為評估不同氮素形態(tài)下玉米幼苗對吡蟲啉的吸收潛力和富集能力，分析吡蟲啉與不同形態(tài)氮素共處理15 d 玉米幼苗不同部位中生物富集因子的變化。從表2 可以看出，在3 個吡蟲啉添加濃度下，玉米幼苗中吡蟲啉的LCF均顯著高于SCF和RCF，表明玉米幼苗葉部對吡蟲啉的生物富集能力最強，其次為根部，莖部對吡蟲啉的生物富集能力最弱。在氮素供應(yīng)水平相同的條件下，僅吡蟲啉添加量為1.0 mg/L 時4 mmol/L NO3-處理的LCF與4 mmol/L NH4+處理無顯著差異，其余硝態(tài)氮處理的吡蟲啉的LCF、SCF和RCF均大于銨態(tài)氮處理。另外，10 mmol/L NO3-處理的LCF、SCF和RCF均大于4 mmol/L NO3-處理，表明較高濃度的硝態(tài)氮更有利于玉米幼苗對吡蟲啉的富集。除添加吡蟲啉濃度為5 mg/L 時4 mmol/L NO3-處理的LCF外，隨著吡蟲啉濃度的添加，玉米幼苗中吡蟲啉的RCF、SCF和LCF均呈下降趨勢，兩者表現(xiàn)為負相關(guān)關(guān)系。

表2 不同供氮條件下玉米幼苗根、莖、葉中吡蟲啉的生物富集因子（BCFs）Table 2 Bioconcentration factors（BCFs）of imidacloprid in roots，stems and leaves of maize seedling under different nitrogen supply conditions

2.3 不同濃度吡蟲啉在玉米幼苗植株中的轉(zhuǎn)運因子

為了研究氮素形態(tài)對玉米幼苗植株中吡蟲啉轉(zhuǎn)運的影響，分析吡蟲啉與不同形態(tài)氮素共處理15 d 后玉米幼苗植株中吡蟲啉轉(zhuǎn)運因子（TFs），結(jié)果（圖2）顯示，在吡蟲啉添加濃度為2.5 mg/L 時，4、10 mmol/L NO3-和4、10 mmol/L NH4+處理玉米幼苗吡蟲啉從根到莖的轉(zhuǎn)運因子均最高，TF莖/根分別為1.02、0.78、1.90、1.32，表明在此濃度下根中的吡蟲啉易轉(zhuǎn)移到莖中；在1.0、5.0 mg/L 吡蟲啉處理下，TF莖/根均小于1，說明這兩種吡蟲啉添加濃度下玉米幼苗莖中富集的吡蟲啉較少。對于吡蟲啉從莖部向葉部的轉(zhuǎn)運，所有處理的TF葉/莖均大于1，在吡蟲啉添加濃度為1.0、2.5 mg/L 時，4、10 mmol/L NO3-和4、10 mmol/L NH4+處理的TF葉/莖為1.5～3.5，統(tǒng)計學分析顯示除4 mmol/L NO3-處理較小外，其他3 個處理間無顯著差異；在吡蟲啉添加濃度為5.0 mg/L 時TF葉/莖最高，4、10 mmol/L NO3-和4、10 mmol/L NH4+處理的TF葉/莖分別為7.54、5.07、4.19、4.13，表明在此添加濃度下吡蟲啉更易從莖部轉(zhuǎn)運到葉部。與硝態(tài)氮處理相比，銨態(tài)氮處理玉米幼苗中吡蟲啉的TF葉/莖明顯較低，且差異達到顯著水平，表明在吡蟲啉添加濃度為5.0 mg/L 時硝態(tài)氮更有利于吡蟲啉向葉片中轉(zhuǎn)運。

圖2 玉米植株中吡蟲啉的轉(zhuǎn)運因子Fig.2 Translocation factors of imidacloprid in maize plant

3 討論

吡蟲啉是第一個新煙堿類殺蟲劑商品，因其高效、廣譜、低毒等特性廣泛應(yīng)用于作物蟲害防治［17］。葉面噴施是吡蟲啉的主要給藥方式，但在實際生產(chǎn)中這種給藥方式存在利用率偏低、環(huán)境風險高的問題，因此，根施吡蟲啉的方式越來越被人們重視［18-20］。對于大多數(shù)作物來說，葉片是主要受害部位，吡蟲啉能否通過根部運輸?shù)饺~片是改變施藥方式的限制因素。Van 等［21］研究表明，在相同給藥量下，盆底施藥更有利于溫室作物對吡蟲啉的吸收和富集，在根部施藥方式下吡蟲啉的藥效高于滴灌和噴施。Han 等［7］研究也表明，根部施藥方式下吡蟲啉可以被煙草吸收并運輸?shù)街仓旮鞑课?，且分布更均勻、持效性更好。本研究結(jié)果顯示，吡蟲啉能夠通過根部進入玉米體內(nèi)，運輸?shù)角o部和葉部，主要積累在葉部，表明根施吡蟲啉的施藥方式對防治玉米地上部蟲害是可行的。

農(nóng)藥在植物體中的積累受多種因素影響。農(nóng)藥的理化性質(zhì)（如分子量、水溶解性、疏水性以及分子結(jié)構(gòu)）可影響植物根系對農(nóng)藥的吸收和富集［22-23］。此外，植物自身的蒸騰作用以及物質(zhì)轉(zhuǎn)運通道也與農(nóng)藥的吸收和運輸有關(guān)［24-25］。Sur等［20］研究表明吡蟲啉被根吸收后，從木質(zhì)部轉(zhuǎn)移到植物頂端。李成名等［26］、Li 等［27］研究表明，吡蟲啉在不同蔬菜品種、不同生長階段的吸收和轉(zhuǎn)運存在差異，這種差異可能與蔬菜根系中吡蟲啉的日蒸騰量和濃縮能力有關(guān)。鞠超［28］的研究顯示，吡蟲啉在小麥中主要通過共質(zhì)體途徑吸收，根部吡蟲啉含量及轉(zhuǎn)移系數(shù)、根部蛋白質(zhì)含量和蒸騰率分別是根吸收富集吡蟲啉的主要因素和次要因素。本研究結(jié)果顯示，吡蟲啉的積累量與氮素形態(tài)密切相關(guān)，在相同供氮量下，硝態(tài)氮為氮源時玉米幼苗各部位吡蟲啉含量顯著高于銨態(tài)氮，生物富集因子結(jié)果也顯示硝態(tài)氮處理的吡蟲啉LCF、SCF和RCF均大于銨態(tài)氮處理，3 個不同濃度吡蟲啉添加情況下出現(xiàn)類似結(jié)果，表明硝態(tài)氮有利于吡蟲啉在玉米幼苗中的富集。氮素作為植物需求量最旺盛的礦質(zhì)元素，對作物生物量和產(chǎn)量起著重要作用。玉米生長發(fā)育受氮素形態(tài)影響顯著。李學俊等［29］研究表明，與其他施氮處理相比，單獨施用硝態(tài)氮肥的玉米生物量最高；陳冬梅等［29］研究顯示，在pH 4.0 和6.0 條件下，硝態(tài)氮為氮源時玉米苗期側(cè)根數(shù)目和主根長度均高于銨態(tài)氮。另有研究表明，與銨態(tài)氮為唯一氮源相比，硝態(tài)氮處理增加了玉米蒸騰速率和光合作用、提高了自由水含量和細胞活躍度，從而加快了氮素代謝活動，促進了玉米生長［30］。硝態(tài)氮為氮源的玉米中積累更多吡蟲啉的原因可能是硝態(tài)氮可促進玉米根系生長、提高蒸騰速率，有助于玉米根部對吡蟲啉的吸收和向莖、葉的運輸。

根部是農(nóng)藥進入植物體的主要部位，但是多數(shù)害蟲的取食部位是莖和葉，因此，農(nóng)藥根-莖-葉的轉(zhuǎn)運對農(nóng)藥的利用率至關(guān)重要［31］。Ge 等［32］在水稻中研究顯示吡蟲啉可被水稻從土壤中吸收，易從根轉(zhuǎn)移到水稻地上部。在油菜中的研究顯示，吡蟲啉在各部位中的分布與吡蟲啉添加量相關(guān)，低藥種比處理情況下吡蟲啉在莖中的含量顯著高于其他部位，而在高藥種比情況下其分配規(guī)律表現(xiàn)為葉＞莖＞根［25］。本研究結(jié)果顯示，在3 個吡蟲啉添加濃度、4 種不同氮供應(yīng)條件下，玉米幼苗中吡蟲啉莖-葉的轉(zhuǎn)運因子均大于1.5，表明吡蟲啉易在玉米葉片中富集；另外，在吡蟲啉添加量為5 mg/L 時，硝態(tài)氮處理下莖-葉的轉(zhuǎn)運因子顯著高于銨態(tài)氮處理，表明硝態(tài)氮更有利于吡蟲啉向玉米幼苗葉片中轉(zhuǎn)運。

4 結(jié)論

本研究通過水培試驗探究不同濃度吡蟲啉與不同形態(tài)氮素共處理下吡蟲啉在玉米中的富集、分配與轉(zhuǎn)運情況，結(jié)果表明，葉片是吡蟲啉積累的主要部位，吡蟲啉添加濃度越高，玉米葉片中吡蟲啉富集越多；氮素形態(tài)影響玉米對吡蟲啉的富集和轉(zhuǎn)運，以2.5 mg/L 吡蟲啉濃度處理為例，4 mmol/L NO3-處理根中吡蟲啉含量為4 mmol/L NH4+處理的3.09 倍、10 mmol/L NO3-處理為10 mmol/L NH4+處理的5.15 倍，莖中分別為1.90、3.04倍，葉中分別為1.70、3.22 倍。在吡蟲啉添加濃度為5.0 mg/L 時TF葉/莖最高，4、10 mmol/L NO3-和4、10 mmol/L NH4+處理的TF葉/莖分別為7.54、5.07、4.19、4.13，表明在此添加濃度下吡蟲啉更易從莖部轉(zhuǎn)運到葉部。與硝態(tài)氮處理相比，銨態(tài)氮處理玉米幼苗中吡蟲啉的TF葉/莖明顯較低，且差異達到顯著水平，表明在吡蟲啉添加濃度為5.0 mg/L 時硝態(tài)氮更有利于吡蟲啉向葉片中轉(zhuǎn)運，在根施吡蟲啉防治玉米害蟲過程中添加硝態(tài)氮肥更有利于提高吡蟲啉利用率。