大豆菌核病研究進(jìn)展

楊淼泠，張 維，韋秋合，施李鳴，國 圓，張克誠，葛蓓孛

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2中國農(nóng)業(yè)出版社有限公司，北京100125）

0 引言

大豆是中國最重要的油料作物之一，被廣泛應(yīng)用于豆制產(chǎn)品和動(dòng)物飼料油的生產(chǎn)。2019年，中國大豆種植面積達(dá)到933萬hm2，產(chǎn)量增長至1810萬t，平均產(chǎn)量為1939.5 kg/hm2[1]，大豆生產(chǎn)直接影響中國國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活，而病害則是影響大豆生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一，每年因病害造成大豆減產(chǎn)15%～ 40%。中國已報(bào)道的大豆病害有大豆胞囊線蟲病、疫霉病等50多種[2]，其中大豆菌核?。╯clerotinia stem rot of soybean，又名大豆白腐?。┦且环N危害嚴(yán)重且難防治的世界性病害，其分布地域廣，不僅普遍發(fā)生于中國東北、華北、華東、西南等各大豆產(chǎn)區(qū)，也在巴西、加拿大、美國、南非等大豆生產(chǎn)區(qū)造成了嚴(yán)重的危害。在大豆菌核病流行年份能夠造成大豆產(chǎn)量驟減20%～ 30%，嚴(yán)重地塊可達(dá)50%以上，甚至絕產(chǎn)[3]。同時(shí)，感染大豆菌核病后大豆中粗脂肪含量、粗蛋白含量甚至氨基酸總量均有下降趨勢(shì)，進(jìn)而影響了大豆的品質(zhì)[4]。隨著國家大豆振興計(jì)劃的實(shí)施，建立一項(xiàng)針對(duì)大豆病害的綠色防控技術(shù)是至關(guān)重要的。因此，筆者在國家大豆發(fā)展計(jì)劃和國家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目的支持下，對(duì)大豆菌核病病原致病機(jī)理、病害侵染循環(huán)以及抗病育種等方面研究進(jìn)行總結(jié)，以期為后續(xù)大豆菌核病的深入研究和防治提供參考。

1 大豆菌核病的病原菌

大豆菌核病的病原為核盤菌[Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary]，在 1837 年Libert[5]首次發(fā)現(xiàn)，并命名為Peziza sclerotiorum，后于1979年P(guān)urdy[6]將其重新改名為Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary，得到國際一致認(rèn)可并沿用至今。1945年，Whetzel等[7]根據(jù)在寄主內(nèi)形成菌核和產(chǎn)生有柄子囊盤的特征將其歸為子囊菌科，后又經(jīng)過多次修改[8-9]，現(xiàn)將其分類為真菌門(Eumycota)子囊菌亞門(Ascomycotina)盤菌綱(Discomycetes)柔膜菌目(Helotiales)核盤菌屬(Sclerotinia)。該病原是一種死體營養(yǎng)型植物病原真菌，寄主范圍廣，能夠侵染菊科、豆科、蕓苔科、傘形科等400多種植物。核盤菌危害大豆植株地上的各個(gè)部位，造成苗枯、葉腐、莖腐、莢腐等癥狀，受侵染的部位初呈水漬狀病斑，隨后進(jìn)一步擴(kuò)展形成淺褐色或深褐色病斑，其典型病征是在高濕環(huán)境下呈現(xiàn)棉絮狀白色菌絲，并形成鼠糞狀或不規(guī)則形的黑色菌核[10]。

1.1 菌核

菌核作為一種休眠和存活結(jié)構(gòu)在核盤菌的生命周期和病害循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用。菌核由外殼、皮層組織和髓三部分組成，Williams等[11]發(fā)現(xiàn)外殼是由一至多層增厚的細(xì)胞組成，并且外殼和皮層組織的細(xì)胞都有色素的沉淀，但后者結(jié)構(gòu)上更為緊密，髓是由大量無隔膜、不分枝的菌絲交聯(lián)形成[12]。在關(guān)于菌核形成過程的報(bào)道中，有些研究者將其劃分為6個(gè)階段(S0～ S6)，分別為菌絲營養(yǎng)生長期、起始發(fā)育期、菌核積聚期、菌核增大期、菌核合并期、色素沉積期、菌核成熟期[13]，也有些將其劃分為3個(gè)階段，即初始階段、發(fā)育階段、成熟階段[14-16]，初期菌絲集結(jié)成白色的菌核原基；中期菌核原基迅速生長，體積明顯增大，菌核表面分泌清澈透明的小液珠；后期菌核進(jìn)入成熟階段，菌核黑化即色素沉淀[17-19]。

影響菌核形成的因素分為外部因素和內(nèi)部因素。外部因素包括溫度、pH等，菌絲在4～ 30℃范圍內(nèi)都能形成菌核，最適溫度是15～ 22℃。pH對(duì)菌核發(fā)育也有顯著的影響，在中性或者堿性條件下能夠抑制菌核的發(fā)育。另一方面，核盤菌對(duì)菌核發(fā)育存在復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，依靠pH-cAMP調(diào)控的MAPK信號(hào)通路在調(diào)控菌核發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，并認(rèn)為cAMP依靠蛋白激酶(PKA)可能參與MAPK信號(hào)通路控制菌核形成[19-20]，但Dickman等[21]和Wayne等[22]利用PKA抑制劑進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)cAMP對(duì)菌核的抑制與PKA無關(guān)，而Ras作為MAKP信號(hào)通路的上游激活因子是菌核發(fā)育所必需的。此外，還有很多蛋白質(zhì)或酶類以特有的方式參與菌核的發(fā)育，Erental等[23]發(fā)現(xiàn)當(dāng)核盤菌中2A型Ser/Thr磷酸酶(PP2A)受到干擾時(shí)，形成菌核的數(shù)量變少、體積變小。Rollins[24]發(fā)現(xiàn)在核盤菌中一個(gè)調(diào)節(jié)pH敏感基因的轉(zhuǎn)錄因子pac1也參與菌核的發(fā)育和成熟。Liang等[25]指出黑色素合成相關(guān)基因SCD1和THR1基因的缺失導(dǎo)致核盤菌菌核發(fā)育受損。Qu等[26]和Fan等[27]通過RNAi分別證明了核盤菌轉(zhuǎn)錄因子SsFKH1和SsMADS是菌核發(fā)育所必需的。

1.2 子囊盤

子囊盤是核盤菌的另一重要特征。核盤菌菌核萌發(fā)主要有兩種方式：子囊盤型萌發(fā)和菌絲型萌發(fā)[28-29]。其中，菌核萌發(fā)產(chǎn)生子囊孢子是核盤菌生活史中有性生殖階段，主要經(jīng)過菌核萌發(fā)初期、子囊盤柄形成期以及展盤期3個(gè)階段，一個(gè)菌核上可長出多個(gè)子囊盤柄，每個(gè)子囊盤柄上只形成一個(gè)子囊盤，成熟的子囊盤呈淡黃色，上生柵狀排列的子囊。

營養(yǎng)、濕度、光照是影響菌核子囊盤型萌發(fā)的主要因素。只有在營養(yǎng)適中的條件下培養(yǎng)出來的菌核才能正常萌發(fā)產(chǎn)生子囊盤，當(dāng)營養(yǎng)不足或者營養(yǎng)過剩時(shí)，菌核會(huì)發(fā)育形成不正常的子囊孢子或者完全不能產(chǎn)生子囊盤，PDA培養(yǎng)基屬于營養(yǎng)過剩型，所以菌核完全無法發(fā)育形成子囊盤，僅能萌發(fā)產(chǎn)生菌絲。濕度也是一個(gè)重要的環(huán)境因素[30]，Nepal等[31]指出，砂質(zhì)土壤含水率越接近飽和菌核萌發(fā)率越高，同時(shí)產(chǎn)生的子囊盤數(shù)量越多。此外，Huang和Kozub[32]強(qiáng)調(diào)只有在光照條件下才能形成正常的子囊盤柄并膨大產(chǎn)生子囊盤。一直以來，低溫處理是否是菌核萌發(fā)產(chǎn)生子囊盤的必須條件存在很大爭(zhēng)議，但現(xiàn)有研究表明，不同的地理區(qū)域形成的不同菌株對(duì)低溫反應(yīng)可能是不同的，所以低溫處理并非子囊盤萌發(fā)的必要條件。此外，Kruger等[33]發(fā)現(xiàn)菌核在不同深度的土壤中子囊盤萌發(fā)率也受影響，隨著土壤深度的增加其萌發(fā)率呈下降趨勢(shì)。

2 大豆菌核病的侵染循環(huán)

在土壤、病殘?bào)w及混雜在大豆種子間越冬的菌核是翌年大豆菌核病的初侵染來源[6,34-35]。菌核在合適的環(huán)境條件下萌發(fā)產(chǎn)生子囊盤，子囊盤釋放大量的子囊孢子通過風(fēng)雨進(jìn)行傳播擴(kuò)散是大豆菌核病流行的主要途徑[36]。菌核萌發(fā)產(chǎn)生的菌絲也具有侵染性，可直接接觸侵染健康寄主植物[37]。研究表明，雖然子囊孢子可以萌發(fā)產(chǎn)生芽管，但只有外源營養(yǎng)物質(zhì)和水共同存在時(shí)才能侵染寄主植物[38]。衰老的花器官能給病原菌充足的營養(yǎng)物質(zhì)，因此，大豆開花期是病害流行的高峰期[39]。帶菌花瓣和發(fā)病組織還可以通過接觸健康植株進(jìn)行再侵染[40-41]，構(gòu)成完整的侵染循環(huán)（圖1[12]）。

圖1 核盤菌侵染循環(huán)及發(fā)病癥狀示意圖

栽培管理、氣候條件、大豆品種等因素都能影響大豆菌核病發(fā)生和流行。花期過早、種植密度過大有利于該病的發(fā)生[31,42]，當(dāng)溫度為10～ 20℃，相對(duì)濕度保持在70%～ 80%時(shí)，菌核易萌發(fā)且萌發(fā)率高，極易形成子囊盤，空氣的相對(duì)濕度保持在85%以上時(shí)，子囊孢子的彈射效果好，侵染成功率高，而當(dāng)大豆種植密度過大，并且地勢(shì)低洼排水不暢時(shí)，極易造成通風(fēng)透光度差，濕度增加，給核盤菌菌核萌發(fā)創(chuàng)造有利的條件，從而導(dǎo)致大豆菌核病的發(fā)生流行。此外，不同地理區(qū)域來源的菌核對(duì)病害發(fā)生也有影響，Bardin等[43]研究表明，來自寒冷氣候地區(qū)(10℃)的菌核比在溫?zé)岬貐^(qū)(25～ 30℃)更容易萌發(fā)，而來源于熱帶的菌核不需經(jīng)過低溫處理，土壤中的水分含量達(dá)到100 kPa時(shí)1～ 2周即可萌發(fā)。

3 大豆菌核病的致病機(jī)理

核盤菌與大豆的葉片或莖稈等部位接觸后，形成侵染墊，通過機(jī)械壓力或分泌角質(zhì)酶侵入寄主，并分泌草酸、細(xì)胞壁降解酶(CWDEs)等在寄主體內(nèi)定殖、擴(kuò)展，直到危害寄主出現(xiàn)相應(yīng)的病理癥狀，造成菌核病的發(fā)生。

3.1 侵染墊

植物病原真菌在侵染植物時(shí)，首先接觸并附著在植物細(xì)胞表面，繼而形成相應(yīng)的侵染結(jié)構(gòu)，通過機(jī)械壓力直接侵入表皮細(xì)胞內(nèi)。Liang和Rollins[44]總結(jié)了先前關(guān)于核盤菌侵染和定殖過程的組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究，提出了核盤菌兩階段侵染模型，第一階段：菌絲接觸植物表皮，菌絲尖端通過分化形成侵染墊，之后形成侵染釘，并通過產(chǎn)生機(jī)械壓力及分泌角質(zhì)酶等穿透寄主表皮的角質(zhì)層，隨后形成球根狀皮下菌絲。第二階段：皮下菌絲在植物角質(zhì)層下不斷擴(kuò)張，之后分化形成皮下侵染菌絲，侵染菌絲通過分泌草酸、毒素以及CWDEs等降解寄主細(xì)胞壁，殺死寄主細(xì)胞，造成植物組織壞死并引起寄主植物死亡。

侵染墊的形成受多種機(jī)制和多個(gè)基因調(diào)控。2012年Li等[45]發(fā)現(xiàn)編碼γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的Ss_Ggt1基因影響核盤菌侵染墊的形成，在沒有傷口的葉片上形成病斑的時(shí)間推遲，而在而在有傷口的葉片上沒有區(qū)別，因此，推測(cè)該基因和核盤菌侵染早期有關(guān)。Xiao等[46]在探究Ss_Caf1基因的功能時(shí)發(fā)現(xiàn)該基因在形成侵染結(jié)構(gòu)過程中發(fā)揮著重要作用。2015年Liang等[47]發(fā)現(xiàn)分別編碼草酸脫羧酶的Ss_oah2和草酸乙酸乙酰水解酶的Ss_oab1基因也能影響侵染墊的形成。Yu等[48]研究發(fā)現(xiàn)由Ss_Rhs1基因編碼的含有Rhs重復(fù)結(jié)構(gòu)的分泌蛋白是影響侵染墊形成的重要蛋白之一。近年來，還發(fā)現(xiàn)GATA轉(zhuǎn)錄因子在核盤菌的生長發(fā)育和致病過程中扮演著重要的角色，比如，SsAREA和SsSRE通過參與MAPK信號(hào)調(diào)控影響侵染墊的形成[49]。

3.2 胞外酶

植物病原菌在侵染寄主植物的過程中，為了獲取營養(yǎng)和與寄主建立營養(yǎng)寄生關(guān)系，產(chǎn)生多種與致病性相關(guān)的胞外酶，主要有角質(zhì)酶、細(xì)胞壁降解酶、蛋白酶、淀粉酶等，這些酶類的產(chǎn)生有的是在寄主細(xì)胞壁上發(fā)揮作用，有的是在降解細(xì)胞內(nèi)含物上起作用，其中分泌的一系列細(xì)胞壁降解酶可以打破寄主植物的物理屏障，進(jìn)而破壞植物組織干擾內(nèi)部正常的生理代謝過程。核盤菌在侵染過程中分泌包括果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶以及木聚糖酶等，其中多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PGs)作為一種重要的果膠酶一直是近些年的研究熱點(diǎn)。PGs能夠降解未酯化的果膠酯聚合物，即存在于在高等植物初生細(xì)胞壁和胞間層的結(jié)構(gòu)性多糖。根據(jù)PGs中不同的功能將其分為多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶(endoPGs)和多聚半乳糖醛酸外切酶(exoPGs)，其中內(nèi)切酶能夠催化多聚半乳糖醛酸的水解過程，引起植物過敏反應(yīng)，而外切酶可以分解果膠細(xì)胞壁多糖的單體或二聚體糖基，以便從寄主植物體內(nèi)攫取所需營養(yǎng)物質(zhì)[50-52]。利用RT-PCR進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶在接種發(fā)病后不同的時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出不同的釋放情況，其中pg1、pg2和pg3在接種36 h后表達(dá)量最大，而在96 h后則不表達(dá)，pg6和pg7在24～ 96 h內(nèi)都能檢測(cè)到，而pg5僅能在后期檢測(cè)到[53]。寄主植物為了與病菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶相對(duì)抗，產(chǎn)生多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIPs)。Oliveira等[54]認(rèn)為核盤菌的蛋白酶也是重要的致病因子，像天冬氨酸蛋白酶家族，如aspS、acp1在核盤菌侵染早期基因的表達(dá)水平顯著提高。同時(shí)，Bashi等[55]發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)酶所編碼的基因在侵染過程中其表達(dá)量顯著提升，因此推斷角質(zhì)酶在核盤菌侵染的過程中也發(fā)揮著一定程度的作用。

3.3 草酸

草酸(Oxalic acid)在核盤菌致病過程中扮演著重要角色。1964年Bateman[56]在侵染寄主組織中發(fā)現(xiàn)草酸的積累。Liang等[57]通過構(gòu)建的草酸基因(OAH)敲除體發(fā)現(xiàn)其致病力顯著下降，而且抗菌核病的品種普遍能抑制草酸的吸收及運(yùn)輸。在核盤菌的致病過程中，草酸主要在以下幾方面發(fā)揮作用：（1）核盤菌在侵染寄主時(shí)，草酸的積累可以降低病變部位的pH，低pH環(huán)境下，核盤菌分泌的致病相關(guān)酶活性增強(qiáng)。核盤菌的細(xì)胞壁降解酶的最佳pH低于5.0，因此隨著分泌草酸量的不斷積累，pH降低能夠有效增強(qiáng)細(xì)胞壁降解酶的活性。同時(shí)，依賴pH調(diào)節(jié)的基因能夠影響核盤菌的致病性或生活周期，Chen等[58]研究表明，Smki作為菌核發(fā)育的必要因子在酸性環(huán)境下表達(dá)量最大。其實(shí)，酸性環(huán)境不僅對(duì)寄主植物會(huì)產(chǎn)生毒害作用，而且有利于核盤菌抑制寄主植物一系列的防衛(wèi)反應(yīng)，比如草酸能夠通過抑制寄主體內(nèi)氧化爆發(fā)[59]，甚至草酸可以降低過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、過氧化物酶等活性[60]，從而阻礙早期植物防御反應(yīng)，減少寄主對(duì)自身的傷害。（2）草酸鹽二價(jià)陽離子可以與鈣二價(jià)陰離子發(fā)生螯合反應(yīng)，降低了Ca+濃度，繼而促進(jìn)瓦解植物細(xì)胞壁進(jìn)程[61]。（3）草酸還可以通過形成草酸晶體堵塞寄主維管束和抑制脫落酸誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過程，從而造成植物萎蔫[30-31]。（4）核盤菌可以通過草酸的分泌誘導(dǎo)啟動(dòng)寄主植物的程序性細(xì)胞壞死[32]。（5）草酸能夠增強(qiáng)光抑制作用和造成光化學(xué)功能障礙，降解光合色素造成無法捕獲或者收集能量，繼而影響寄主的光合作用[62]。但隨著進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，未能形成草酸的突變株通過積累富馬酸仍然能夠形成菌核并引起發(fā)病，綜上所述，引起菌核病發(fā)生的必要條件是酸性pH，而不僅僅是草酸[63]。

3.4 分泌蛋白

近年來，分泌蛋白與核盤菌的致病相關(guān)性是研究熱點(diǎn)。核盤菌一直被認(rèn)為是典型的死體營養(yǎng)型植物病原真菌，但隨著進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，核盤菌也存在短暫的活體營養(yǎng)階段，并且也會(huì)分泌相應(yīng)的效應(yīng)子促進(jìn)核盤菌的侵染[64]。目前，核盤菌中很多分泌蛋白的作用機(jī)制被闡述，比如，SsITL蛋白參與了核盤菌抑制寄主JA/ET信號(hào)途徑介導(dǎo)的局部和系統(tǒng)性抗反應(yīng)，而SsCP1可以與寄主中的PR1互作，降低PR1對(duì)自身抑制作用，從而有利于核盤菌的侵染發(fā)病。

4 大豆菌核病抗病鑒定和育種

選育抗性品種是防治大豆菌核病最經(jīng)濟(jì)、最有效的手段之一。現(xiàn)大豆菌核病在遺傳育種方面已初步開展研究，包括抗病種質(zhì)資源的篩選、抗性遺傳規(guī)律和QTL定位以及基因工程育種等相關(guān)研究工作[78]。

4.1 大豆抗菌核病種質(zhì)資源

由于復(fù)雜的抗性遺傳規(guī)律和自然環(huán)境因素的疊加，增大了選育真正的抗性品種的難度[79-80]，因此，國內(nèi)外對(duì)于選育免疫或高抗菌核病的大豆品種方面研究進(jìn)展緩慢。目前，研究主要集中在篩選對(duì)菌核病部分抗性的種質(zhì)資源，對(duì)于耐病型和避病型品種的農(nóng)藝特性研究已經(jīng)相對(duì)明朗。耐病品種一般具有開花期早，株型緊湊、葉片上舉，不易倒伏等特性[79]?，F(xiàn)評(píng)價(jià)大豆對(duì)于菌核病的抗性主要采用人工接種鑒定和病田自然誘發(fā)鑒定，而普遍應(yīng)用的鑒定方法是在室內(nèi)或溫室環(huán)境下的小面積人工接種，包括離體組織菌絲塊接種、活體植株菌絲塊接種、草酸鑒定法、菌核埋土法、菌液噴霧法、莖中可溶性色素水平鑒定法等[78]。Maple Arrow是世界上公認(rèn)的耐病品種，除此之外，國外現(xiàn)已鑒定出Asgrow A2506、NKS 19-90、Colfax、Corsoy、FC 030233、PI5325等十余種部分抗性種質(zhì)[81]。國內(nèi)在大豆抗菌核種質(zhì)資源鑒定方面也有一些進(jìn)展。苗保河[82]在鑒定東北某些推廣品種時(shí)發(fā)現(xiàn)開紫色花的品種抗性相對(duì)較好，宋淑云等[78]對(duì)112個(gè)大豆品種進(jìn)行鑒定，篩選出了一個(gè)高抗品種‘吉育35’，除此以外，還篩選得到了‘寶交05-5318’、‘九三04-89’、‘牡05-742’、‘合豐24’、‘大天鵝蛋’、‘倪丁花眉豆’等多種具有中抗菌核病的大豆品種[83]。

表1 核盤菌中與致病性相關(guān)的分泌蛋白的基因及其功能

4.2 抗性遺傳與QTL定位

大豆對(duì)菌核病的抗性為數(shù)量性狀，由多基因控制，抗病遺傳規(guī)律較為復(fù)雜。通過分子標(biāo)記定位抗病主效基因在基因組中的位置，即進(jìn)行QTL(quantitative trait locus)定位，從而輔助選育抗病品種，加速抗病品種選育的進(jìn)程。用大豆的抗、感菌核病F2群體進(jìn)行RAPD標(biāo)記作圖，找到了1個(gè)對(duì)抗性貢獻(xiàn)率為18%的位點(diǎn)。Arahana、Kim、Guo、Vuong、Huynh等也定位出了多個(gè)大豆抗菌核病的QTLs，并發(fā)現(xiàn)葉形、生育期和開花期等農(nóng)藝性狀與QTL定位相關(guān)[81,84]。Li等[85]和Zhao等[86]在探究QTL與可溶性色素含量的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)可溶性色素含量與抗菌核病相關(guān)的QTLs。宋偉等[87]通過復(fù)合區(qū)間作圖法結(jié)合表型鑒定也定位到7個(gè)抗大豆菌核病相關(guān)的QTL位點(diǎn)，并發(fā)掘了3個(gè)可能參與大豆抗菌核病的基因。張羽等[88]通過對(duì)大豆抗菌核病的全基因組進(jìn)行SNP-phenotype和Haplotype-phenotype關(guān)聯(lián)分析表明，基于單個(gè)SNP-Trait的最大關(guān)聯(lián)在3號(hào)染色體上，其候選基因有pyrroline-5-carboxylate(P5C)reductase和cytochrome P450等，其中P5CR是一種催化脯氨酸生物合成的管家蛋白，脯氨酸在植物的抗逆過程中發(fā)揮著重要的作用。Haplotype-Traits的最大關(guān)聯(lián)在17號(hào)染色體上，其中纖維素合酶基被列為關(guān)聯(lián)基因。Sun等[89]也通過全基因組關(guān)聯(lián)研究確定3個(gè)主效基因的6個(gè)SNPs和微效基因的8個(gè)SNPs，其中Glyma_18G012200被認(rèn)為在抗病性方面發(fā)揮重要的作用。

4.3 基因工程育種

目前，國內(nèi)外學(xué)者在大豆抗菌核病的基因工程育種方面已初步開展研究。將小麥中分離得到的具有降解草酸功能的草酸氧化酶基因轉(zhuǎn)入大豆植物中，使得大豆對(duì)菌核病表現(xiàn)出顯著的抗性[90]。張宇航等[91]從耐菌核病大豆品種Maple Arrow中克隆得到Gm_GLP10基因并發(fā)現(xiàn)該基因可能作為生長素結(jié)合蛋白參與調(diào)控大豆的生長發(fā)育與抗病防御應(yīng)答反應(yīng)。楊靜等[92]利用從盾殼霉屬中的幾丁質(zhì)基因CmCH1轉(zhuǎn)入大豆植株并過表達(dá)，接種后發(fā)現(xiàn)大豆體內(nèi)防御相關(guān)酶活性增強(qiáng)，比如過氧化物酶、超氧化物歧化酶、苯丙氨酸解氨酶等，同時(shí)也能誘導(dǎo)下游防御反應(yīng)，即相關(guān)防御基因表達(dá)量增高，更重要的是，對(duì)基因的轉(zhuǎn)入對(duì)大豆植物的生長發(fā)育并無有害影響。

5 大豆菌核病的防治技術(shù)

根據(jù)大豆菌核病病原菌及其侵染循環(huán)和發(fā)病機(jī)制，大豆菌核病的防治策略應(yīng)以減少初侵染源為主，選用耐病品種栽培種植，加強(qiáng)田間管理，輔之必要的藥劑防治。

5.1 減少初侵染源

通過建立合理的種植制度、選用無病繁殖材料、保持田園衛(wèi)生和增加土壤有益微生物等措施減少初侵染源。菌核在土壤內(nèi)的存活時(shí)間較長，常發(fā)病區(qū)應(yīng)實(shí)行輪作機(jī)制，可與禾本科作物輪作，避免與油菜、向日葵、煙草等作物之間輪作。選無病株留種，采用篩選法除去種子中混雜的菌核，然后通過溫湯浸種或者藥劑浸種等進(jìn)行種子處理。每年大豆秋收后，應(yīng)及時(shí)清理農(nóng)田病殘?bào)w和落地花盤籽粒，集中深埋或燒毀病殘?bào)w。春種時(shí)，適時(shí)的進(jìn)行土壤深翻，將土壤中越冬菌核埋入深土中，并在大豆封壟前及時(shí)中耕培土，可降低菌核的萌發(fā)。增加土壤中有益微生物菌群，比如利用植物根際促生菌(PGPR)或利用盾殼霉(Coniothyrium minitans)對(duì)菌核的重寄生作用，施用盾殼霉生物防治菌劑于土壤中，可減輕發(fā)病程度[93]。

5.2 選用耐病品種

選育抗性品種是防治大豆菌核病最經(jīng)濟(jì)、最有效的手段之一。由于對(duì)大豆菌核病高抗或是免疫的大豆品種較少，可選用‘吉育35’、‘合豐24’、‘合豐35’、‘墾農(nóng)4號(hào)’、‘墾農(nóng)5號(hào)’等具有中抗菌核病品種進(jìn)行合理布局。未有中抗種質(zhì)資源，可選擇株型較為緊湊，通風(fēng)透光性能好，植株葉面稍尖或葉片上舉的大豆品種。

5.3 加強(qiáng)田間管理

調(diào)整播期、合理調(diào)節(jié)環(huán)境因子、優(yōu)化水肥管理，創(chuàng)造有利于植物生長發(fā)育而不利于病害發(fā)生的生態(tài)環(huán)境條件。調(diào)整播期，適時(shí)遲播，使開花期與降雨期錯(cuò)開。保持田間排水良好，通風(fēng)透光，減少易積水和低洼地的種植。重施基肥、苗肥，施足磷鉀肥，特別是噴施磷酸鹽對(duì)控制大豆菌核病的發(fā)生有一定程度的作用[94-95]，在冬小麥-夏大豆模式中，免耕覆秸播種技術(shù)能增產(chǎn)增效的同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了麥茬大豆田間病蟲草害的防治[96]。

5.4 藥劑防治

化學(xué)藥劑是防治大豆菌核病的主要手段，而早期及時(shí)噴施藥劑對(duì)預(yù)防菌核病發(fā)生是至關(guān)重要的[97]，菌核病的最佳防治時(shí)期是子囊盤發(fā)生期與大豆開花期的重疊期，菌核一般在大豆封壟后開始萌發(fā)，7月中下旬是子囊盤萌發(fā)的高峰期?，F(xiàn)主要有苯甲基咪唑類、琥珀酸脫氫酶類、三唑類、甲氧基丙烯酸酯類、二硝基苯胺類殺菌劑，通過不同的作用機(jī)制能夠有效的降低大豆菌核病的發(fā)病率[98-102]。雖化學(xué)防治對(duì)菌核病的防效十分明顯，但由于長時(shí)間的大量噴施化學(xué)藥劑，導(dǎo)致核盤菌抗藥性產(chǎn)生[103]、環(huán)境污染，大豆食品安全隱患等問題。

相比于化學(xué)藥劑，生物制劑具有對(duì)環(huán)境相容性好、農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[104-105]。除上述利用盾殼霉對(duì)菌核的重寄生作用外，還可利用木霉(Trichoderma viride)和 (Trichoderma harzianum)[106]、枯 草 芽 桿 菌(Bacillus subtilis)[107]、鏈霉菌(Streptomyces avermitilis和Streptomyces hygroscopicus)[108]對(duì)核盤菌的拮抗作用，達(dá)到較好的防治效果。此外，施用核盤菌SsHADV-1病毒粒子后，不僅能夠減輕病害發(fā)生程度，還能縮小病原菌寄主范圍、提高作物產(chǎn)量[109]。

6 展望

目前，基于核盤菌的致病機(jī)理及侵染特性，利用基因工程技術(shù)在大豆抗菌核病育種方面取得了一定的成效，同時(shí)，化學(xué)防治作為防治大豆菌核病的主要手段能有效的預(yù)防及阻止菌核病的發(fā)生危害。但仍然存在一些重要問題需要解決：（1）大豆-核盤菌之間互作機(jī)制還未闡述清楚。大豆是如何響應(yīng)核盤菌分泌的毒素或分泌蛋白，抗病信號(hào)是如何啟動(dòng)并轉(zhuǎn)導(dǎo)，是否也像疫霉菌一樣存在“誘餌模式”[110]，這些問題阻礙了抗病基因的挖掘和分子育種的進(jìn)程。（2）大豆中缺乏可利用的優(yōu)良抗源。雖已定位到很多的QTL，但重復(fù)性差，缺少穩(wěn)定的主效QTL，這導(dǎo)致大豆抗菌核病遺傳育種的研究進(jìn)展緩慢。（3）研究手段尚需改進(jìn)。當(dāng)前對(duì)抗病基因的鑒定研究多采用QTL定位或通過檢驗(yàn)少數(shù)基因?qū)吮P菌的響應(yīng)情況來推測(cè)其與抗性的關(guān)系，難以準(zhǔn)確鑒定出抗病基因，更無法了解寄主的抗病機(jī)制。（4）缺少一種綠色、安全且高效的防治大豆菌核病的技術(shù)手段。目前雖然化學(xué)方法能很快地抑制病原體發(fā)展并具有一定的預(yù)防作用，但是存在環(huán)境污染、抗藥性產(chǎn)生以及食品安全等問題。

針對(duì)以上問題，今后可從以下幾個(gè)方面開展后續(xù)研究：（1）集中篩選抗病品種，通過雜交將抗病成分轉(zhuǎn)入大豆，并利用其進(jìn)行抗病位點(diǎn)鑒定，從而提高抗病位點(diǎn)的準(zhǔn)確性。（2）通過全基因組水平、轉(zhuǎn)錄組水平和代謝組水平等現(xiàn)代生物信息學(xué)的分析手段，加快核盤菌-大豆互作機(jī)制的研究，挖掘抗病基因，為大豆抗菌核病分子育種奠定基礎(chǔ)。（3）積極研究生物防治方法對(duì)大豆菌核病的防控效果及機(jī)理，推進(jìn)生物防治策略與化學(xué)或農(nóng)業(yè)防治方法綜合聯(lián)用，為建立良好的綜合防治管理技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

致謝：感謝國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“主要經(jīng)濟(jì)作物重要及新成災(zāi)病害綠色綜合防控技術(shù)”(2019YD1002000)的資助和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的良好實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。